HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ ĐỐI MỤC (MUGIL CEPHALUS) Ở VÙNG BIỂN PHÍA BẮC - TRUNG BỘ VIỆT NAM DỰA TRÊN TRÌNH TỰ GEN CO1 Trần Thị Việt Thanh1, Phan Kế Long1,4, Jean Dominique Durand2,3 Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM Viện Nghiên cứu phát triển - IRD, Đại học T ng hợp Montpelier, Pháp Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Biển Việt Nam vùng nhiệt đới gió mùa, đường đẳng nhiệt 20oC (đường ranh giới hai vùng nhiệt đới nhiệt đới) chạy qua nửa phía bắc vịnh Bắc Bộ Mũi Varella (Mũi Nạy - 12o30‟ vĩ độ Bắc) đường ranh giới phân cách hai khu hệ động vật khác coi ranh giới phân bố cực nam loài cận nhiệt đới di cư đến từ vùng biển Nhật Bản đường ranh giới phía bắc vùng phân bố nhiều lồi cá ơn đới điển hình Theo phân vùng thủy sản FAO, Việt Nam thuộc vùng 61 (lạnh) hay cịn gọi vùng ơn đới vùng 71 (nóng) vùng nhiệt đới Ranh giới vùng dãy Hải Vân vùng 61 gồm vùng biển Đơng Bắc đến Huế vùng 71 tính từ vùng biển Đà Nẵng đổ phía nam Ở Việt Nam cá Đối mục có phân bố từ Bắc đến Nam, tập trung nhiều vùng cửa sơng (Lưu Xn Hịa, 2011) Theo Nguyễn Khắc Hường, Trương Sĩ Kỳ, 2007 họ cá Đối (Mugilidae) Việt Nam có khoảng 6-7 lồi có giá trị kinh tế cao lồi cá Đối mục Tổng cục Thủy sản xác định 27 loài cá biển kinh tế phép xuất Kết nghiên cứu cá Đối mục vùng biển Đài Loan, Nhật Bản Tây Bắc Thái Bình Dương xác định cá Đối mục (Mugil cephalus) gồm dòng NWP1, NWP2, NWP3 (Ke et al., 2009; Durand 2012) Trong dịng NWP1 phân bố Bắc Thái Bình Dương, biển Nhật Bản vùng biển Hoa Đơng Trung Quốc cho dịng có nguồn gốc ơn đới, dịng NWP2 bị giới hạn với vĩ độ thấp ghi nhận vùng đảo Hải Nam, Trung Quốc cho dịng có nguồn gốc nhiệt đới, dòng NWP3 phân bố vùng biển Đài Loan, đảo Hải Nam dòng hỗn hợp dòng NWP1 NWP2 Trên vùng gen CO1, dòng NWP1 khác dịng NWP2 10 vị trí nucleotide; dịng NWP1 khác dịng NWP3 24 vị trí nucleotide; dịng NWP2 khác dịng NWP3 21 vị trí nucleotide (Durand 2012) Bài báo trình bày đa dạng di truyền dòng cá Đối mục Mugil cephalus vùng biển Bắc - Trung Bộ Việt Nam sở phân tích đặc điểm vùng gen cytochrome c oxidase subunit (CO1) I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tổng số 59 mẫu cá Đối mục thu từ 21 điểm thuộc tỉnh: Quảng Ninh (6 điểm, 21 mẫu), Hải Phòng (4 điểm, 17 mẫu), Nam Định (5 điểm, 13 mẫu), Hà Tĩnh (1 điểm, mẫu), Quảng Bình (3 điểm, mẫu), Thừa Thiên - Huế (2 điểm, mẫu) (Bảng 1) Sau phân loại hình thái dựa tài liệu như: Động vật chí Việt Nam Nguyễn Khắc Hường, Trương Sĩ Kỳ (2007) đối chiếu với sở liệu loài cá Đối Froese and Pauly (2005) mẫu nghiên cứu DNA lấy từ lưng vây bụng bảo quản ethanol (75%) nhiệt độ phòng 917 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN Bảng Danh mục mẫu cá Đối mục dùng nghiên cứu Tỉnh Quảng Ninh Hải Phòng Nam Định Hà Tĩnh Quảng Bình Thừa Thiên - Huế Tổng cộng Tổng số mẫu Q16 - Q19 Đảo Ba Mùn 20o55‟05‟‟ N; 107o40‟10‟‟ E Q20 - Q22 Vân Đồn 21o06‟94‟‟ N; 107o42‟02‟‟E Q29 - Q33 Đảo Minh Châu 21o04‟19‟‟ N; 107o25‟30‟‟ E Q34, Q38, Q39, Q41, Q42 Hạ Long 20o52‟24‟‟ N; 107o05‟23‟‟ E Q43 - Q45 Đảo Cô Tô 21o05‟21‟‟ N; 107o52‟19‟‟ E S3 Quảng Yên 20o55‟40‟‟ N; 106o51‟05‟‟ E P6 - P12 Cửa sông Văn Úc 20o40‟25‟‟ N; 106o42‟48‟‟ E P13, P14, P16 Đảo Cát Bà 20o50‟40‟‟ N; 106o55‟15‟‟ E E32, E33 Đồ Sơn 20o44‟25‟‟ N; 106o47‟28‟‟ E H6 - H10 Cảng Hải Phòng 20o51‟59‟‟ N; 106o40‟57‟‟ E ND27 VQG Xuân Thủy 20o11‟15‟‟ N; 106o25‟05‟‟ E F5 - F8, Giao Thiện 20o16‟45‟‟ N; 106o35‟05‟‟ E F10 - F12 Cửa sông Ba Lạt 19o53‟25‟‟ N; 106o10‟37‟‟ E F14, F16 Giao Tiến 20°16‟19‟‟N ; 106°23‟30‟‟E X4, X7, X15 Quất Lâm 20o11‟10‟‟ N; 106o21‟36‟‟ E Hà Tĩnh Thiên Cầm 18o16‟32‟‟ N; 106o07‟05‟‟ E QB40 Bố Trạch 17o28‟06‟‟ N; 106o15‟15‟‟ E QB41 Đồng Hới 17o26‟55‟‟ N; 106o35‟08‟‟ E QB46 Hàm Ninh 17o23‟05‟‟ N; 106o35‟28‟‟ E K1 Phú Lộc 16o16‟59‟‟ N; 107o26‟19‟‟ E K2- K4 Cầu Hai 16o40‟05‟‟ N; 107o51‟35‟‟ E 59 mẫu Ký hiệu mẫu Địa điểm Tọa độ 21 điểm thu Tách chiết DNA: DNA tổng số tách chiết từ mô theo theo quy trình cải tiến từ phương pháp Zang & Shi., 1989 Sản phẩm PCR tinh hóa chất Genomic DNA Purification kit (#KO512, Fermentas) Nhân gen đích PCR đọc trình tự: Cặp mồi xuôi Fish F1 (TCAACCAACCAC ACCGACATTGGCAC); Fish F2 (TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC) mồi ngược 918 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Fish R1 (TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC) (Ward et al., 2005) sử dụng để nhân vùng gen CO1 với kích thước khoảng 650 bp Hỗn hợp PCR 25 µl bao gồm 12,5 l Master mix 2X; l MgCl2 25 mM; 0,5 l Taq polymerase u/ l; l DNA mẫu; 1,25 l mồi xuôi 10 pM; 1,25 l mồi ngược 10 pM; bổ sung H2O PCR thực máy PCR system 9700 theo chu trình nhiệt: 94oC/2 phút, sau 35 chu kỳ lặp lại: 95oC/30 giây; 52oC/1phút; 72oC/ 1phút; cuối 72oC 10 phút để kết thúc phản ứng giữ mẫu 4oC Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,2%, chụp ảnh hệ thống máy chiếu ánh sáng UV Sản phẩm PCR tinh trước gửi đọc trình tự trực tiếp chiều công ty Macrogen, Hàn Quốc X lý số liệu: Trình tự sau đọc hiệu chỉnh phần mềm Chromas (Technelysium., 2013), tìm kiếm trình tự tương đồng Genbank phần mềm BLAST, xếp trình tự tương đồng phần mềm ClustalW (Thompson et al., 1997), chỉnh sửa phần mềm Bioedit xây dựng phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood phần mềm Mega 5.2.2 (Tamura et al., 2011) II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nhân đoạn gen đích DNA tổng số tách chiết cho chất lượng tốt Hình ảnh điện di cho băng đậm rõ nét Tất mẫu thu có số OD nằm giới hạn 1,8 - 2,0 DNA có độ cao, khơng bị đứt gãy đảm bảo cho thí nghiệm Nhân gen đích kỹ thuật PCR với cặp mồi phức FishF1- Fish F2/Fish R1 cho kết băng vạch rõ ràng với kích thước khoảng 650 bp (hình 1) phù hợp với kích thước lý thuyết vùng gen CO1 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 650 bp Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR 59 mẫu nghiên cứu gel agarose 1,2% (Ký hiệu: giếng 1-59 ; M: marker phân tử 1kb) Xác định trình tự nucleotide Tất sản phẩm PCR giải trình tự trực tiếp Sau chỉnh sửa sở đối chiếu trình tự sợi đơi, loại bỏ trình tự đoạn mồi, vùng gen CO1 có chiều dài 641 bp với thành phần nucleotide: T=30,6%; C=26,8%; A=24,3%; G=18,3% (Bảng 2) Đã xác định 597/641 vị trí nucleotide bảo thủ (Conserved), 39/641 vị trí biến đổi (Variable), 36/641 vị trí mang thơng tin di truyền Pi (Parsimony informative), 3/341 vị trí Si (Singleton) 919 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN Bảng Thành phần nucleotide (%) vùng gen CO1 59 mẫu cá Đối mục Địa điểm Quảng Ninh Hải Phòng Nam Định Hà Tĩnh Quảng Bình Thừa Thiên - Huế Trung bình Số mẫu 21 17 13 T 30,8 30,8 30,4 30,4 30,9 30,4 30,6 C 26,3 26,6 27,1 27,1 26,6 27,1 26,8 A 24,4 24,4 24,2 24,1 24,5 24,2 24,3 Kích thƣớc (bp) 641 641 641 641 641 641 641 G 18,1 18,2 18,5 18,6 18,0 18,5 18,3 Trình tự gen CO1 có mức độ khác biệt lồi mẫu vùng nghiên cứu nhỏ P