Để xử lý sinh học thì việc lựa chọn chủng vi sinh vật là điều vô cùng quan trọng và việc sử dụng được những giống bản địa sẽ giải quyết được vấn đề thích nghi của vi sinh vật với môi trường sống mới và có thể ứng dụng ngay vào thực tiễn giảm bớt quá trình khảo sát điều kiện sinh trưởng và phát triển. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết điều kiện sinh trưởng của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học cao su thiên nhiên.
ISSN 2354-0575 BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐIỀU KIỆN SINH TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC CAO SU THIÊN NHIÊN Nguyễn Việt Thùy, Trần Thị Ưng Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Hưng Yên Ngày tòa soạn nhận báo: 15/10/2018 Ngày phản biện đánh giá sửa chữa: 16/11/2018 Ngày báo duyệt đăng: 07/12/2018 Tóm tắt: Cao su thiên nhiên polymer có khả chống mài mịn rách Vì ứng dụng rộng rãi trình làm vật liệu để sản xuất lốp xe, găng tay cao su, sản phẩm xốp,… Cùng với việc mở rộng sản xuất chất thải cao su phế thải cần phải có biện pháp xử lý Tuy nhiên, biện pháp xử lý chon lấp, đốt tái chế cao su khó khăn thân thiện với mơi trường Do hướng theo đường xử lý sinh học hướng mang lại tính hiệu thân thiện với môi trường Tuy nhiên để xử lý sinh học việc lựa chọn chủng vi sinh vật điều vô quan trọng việc sử dụng giống địa giải vấn đề thích nghi vi sinh vật với mơi trường sống ứng dụng vào thực tiễn giảm bớt trình khảo sát điều kiện sinh trưởng phát triển Với nguồn phân lập từ bể làm giàu thành phần nước thải, mủ thải, bùn thải từ nhà má cao su Cẩm Thủy – Thanh Hóa nhóm nghiên cứu phân lập chủng E1 E2 từ bể làm giàu Đồng thời từ chủng phân lập vào nghiên cứu để khảo sát điều kiện sinh trưởng để thu sinh khối tốt chủng mơi trường ni cấy Từ khố: Cao su thiên nhiên, phân hủy sinh học, vi sinh vật,mẫu làm giàu, điều kiện sinh trưởng Đặt vấn đề Cao su vật liệu sử dụng rộng rãi tồn cầu tính vượt trội bao gồm độ đàn hồi, chống rách, chống mài mòn [1,5] Cùng với lợi ích từ ngành cơng nghiệp mang lại chất thải cao su vấn đề đáng lo ngại Các biện pháp xử lý cao su thải sử dụng rộng rãi chon lấp, nhiệt phân chất đống Tuy nhiên biện pháp cịn nhiều bất cập, việc chơn lấp gây tốn diện tích cịn đốt phếp liệu để làm nhiên liệu nhà máy lại gây ô nhiễm mơi trường hiệu kinh tế khơng cao Chính mà việc tìm chủng vi sinh vật có khả phân hủy mạnh cao su phù hợp với điều kiện thời tiết khí hậu, môi trường khu vực điều thực cần thiết Các nghiên cứu phân hủy cao su tìm nhiều lồi vi khuẩn, xạ khuẩn nấm có khả phân hủy cao su nhiên với nhóm vi sinh vật khả sinh trưởng đặc tính chúng lại có khác biệt đồng thời phát huy vai trò phân hủy sinh trưởng môi trường phù hợp với sinh lý chúng [4, 6] Vì với sở phân lập chủng E1 E2 từ nước thải, mủ thải, bùn thải từ nhà máy cao su Cẩm Thủy – Thanh Hóa chúng tơi tiến hành nghiên cứu điều kiện sinh trưởng chủng với mong muốn tìm điều kiện để nuôi cấy tạo nhiều sinh khối nhằm phục vụ việc đưa chủng ứng dụng xử lý thực tiễn Việt Nam Nội dung 2.1 Vật liệu phương pháp 2.1.1 Nguồn vi sinh vật: Các chủng E1, E2 sưu tập giống môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội [2,3] 2.1.2 Môi trường nuôi cấy: Môi trường nghiên cứu sử dụng chủ yếu môi trường LB, PAB [2,3] Bảng Mơi trường hoạt hóa LB Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Thành Phần Pepton Cao nấm men NaCl g/l 10 25 Bảng Mơi trường hoạt hóa PAB Thành Phần Pepton Cao nấm men Cao thịt NaCl Glucoza KH2PO4 g/l 10 1.5 1.5 3.5 1.32 K2HPO4 3.68 Journal of Science and Technology 37 ISSN 2354-0575 2.1.3 Hóa chất: Hóa chất dùng nuôi cấy: pepton, cao nấm men, cao thịt, NaCl, Glucoza, KH2PO4, K2HPO4 2.1.4 Thiết bị: - Máy lắc ổn nhiệt (Taitec BR - 43FL, Nhật) - Máy li tâm lạnh (Tomy MX-305, Nhật) - Máy Vortex (Taitec, Nhật) - Nồi hấp tiệt trùng (Tomy ES315, Nhật) - Tủ cấy vô trùng (Panasonic MCV-B91F, Nhật) - Máy đo pH (Hanna Hi 2211, Italia) - Tủ sấy (Eyela LTI-601SD, Nhật) - Kính hiển vi điện tử (Nikon YS100, Nhật) 2.1.5 Sơ đồ nghiên cứu: [2,3] Các chủng vi sinh vật sưu tập Môi trường nuôi cấy (Enrichment) 2.1.7 Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu lên sinh trưởng phát triển chủng lựa chọn Thực bước tương tự khảo sát với môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường phù hợp khảo sát bước với chủng E1, E2 bình tam giác chứa mơi trường nuôi cấy điều chỉnh pH từ đến Khả sinh trưởng chủng xác định qua OD600 nm 2.1.8 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng lựa chọn Thực bước tương tự với khảo sát pH ban đầu với môi trường, pH khảo sát Thay đổi nhiệt độ nuôi cấy 20 oC, 30 oC, 37 oC, 42 oC, 50 oC Khả sinh trưởng chủng xác định qua OD600 nm 2.2 Kết thảo luận 2.2.1 Đặc điểm hình thái chủng Qua q trình ni cấy phịng thí nghiệm nhuộm gram thu hình ảnh khuẩn lạc hình ảnh nhuộm gram chủng Hình Hình 2: Khảo sát với môi trường dinh dưỡng Khảo sát điều kiện nhiệt độ ni cấy Hình Hình ảnh khuẩn lạc chủng nghiên cứu Khảo sát với điều kiện pH ban đầu Kết luận 2.1.6 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khác lên sinh trưởng phát triển chủng lựa chọn - Chuẩn bị bình tam giác sạch, khơ có nắp đậy (thơng khí) bọc kín giấy bên có chứa 40 ml LB PAB, pH = trùng 121oC, 20 phút - Các chủng E1, E2, hoạt hóa mơi trường LB, - ngày 37 oC Bổ sung 10% (v/v) canh trường có mật độ 109 CFU/ml với chủng E1, E2 vào bình tam giác chuẩn bị sẵn Đem nuôi 37 oC, tốc độ lắc 170 – 185 vòng/phút Tiến hành đo mật độ quang OD600 nm 12h lần để xác định gia tăng sinh khối mẫu 38 Hình Hình ảnh nhuộm Gram chủng độ phóng đại 1000 lần 2.2.2 Kết khảo sát phát triển chủng E1 môi trường nuôi cấy nhiệt độ 37 oC Hình Kết khảo sát phát triển chủng E1 môi trường nuôi cấy nhiệt độ 37 oC Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology ISSN 2354-0575 Nhìn vào kết ta thấy hai môi trường phù hợp với chủng E1 Tuy nhiên sinh khối E1 môi trường LB cao môi trường PAB 1,8 lần Sinh khối E1 môi trường LB đạt cực đại OD = 3,90±0,30 sau 24h tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml Chính LB chúng tơi lựa chọn môi trường nuôi cấy chủng E1 2.2.3 Kết khảo sát chủng E2 môi trường ni cấy nhiệt độ 37 oC Hình Kết khảo sát chủng E2 môi trường nuôi cấy nhiệt độ 37 oC Qua kết hai mơi trường phù hợp với chủng E2 Lượng sinh khối thu chủng E2 hai môi trường tương đương nhiên nuôi môi trường LB thời gian thu sinh khối cực đại ngắn Trong môi trường LB sinh khối cực đại sau 24h với OD = 3,99±0,29 tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml Vì nghiên cứu lựa chọn LB môi trường nuôi cấy E2 2.2.4 Kết khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến phát triển chủng E1 Hình Kết khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến phát triển chủng E1 Trong dải pH từ đến chủng E1 sinh trưởng phát triển pH = lượng sinh khối chủng E1 thấp Tại pH = 6, 7, tốc độ sinh trưởng chủng tương đương Lượng sinh khối thu cao nuôi chủng môi trường LB, pH = 6, sau thời gian 24h với OD = 4,08±0,18 tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml Như lựa chọn dải pH từ – điều kiện phù hợp với chủng E1 nghiên cứu 2.2.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến phát triển chủng E2 Hình Kết khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến phát triển chủng E2 Theo kết phía nhận thấy sử dụng dải pH từ đến chủng E2 phát triển nhiên với pH = chủng có lượng sinh khối Tại pH = lượng sinh khối chủng lớn với giá trị gấp 1,09 – 4,89 lần so với giá trị pH khác với OD = 4,39±0,13 sau 24h tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml Do pH ban đầu lựa chọn để ni chủng E2 thu sinh khối dải pH từ – 2.2.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E1 Hình Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E1 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology 39 ISSN 2354-0575 Nhìn vào lượng sinh khối thu chủng E1 thấy dải nhiệt độ 30 - 42 oC lượng sinh khối tạo chủng lớn Đối với nhiệt độ 20oC 50 oC chủng E1 phát triển chậm nhiều.Trong nhiệt độ 30 oC lượng sinh khối tạo lớn sau 12h với OD = 4,45±0,30 tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml Như dải nhiệt độ 30 42oC điều kiện phù hợp với E1 nuôi cấy nghiên cứu Nhìn vào đồ thị nhận thấy nhiệt độ 50 oC nhiệt độ không phù hợp cho sinh trưởng chủng E2 Dải nhiệt độ từ 20 oC – 42 oC phù hợp với sinh trưởng phát triển chủng E2 Tuy nhiên nhiệt độ 30 oC lượng sinh khối tạo lớn sau thời gian ngắn với OD = 4,61±0,21 sau 12h tương đương mật độ vi sinh vật 109 Như dải nhiệt độ từ 30 oC – 42 oC nhiệt độ nuôi cấy phù hợp với E2 nghiên cứu phần 2.2.7 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E2 Kết luận Với chủng có khả phân hủy cao su phân lập nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát điều kiện sinh trưởng phát triển chủng điều kiện nghiên cứu phịng thí nghiệm với mong muốn tìm điều kiện nuôi cấy để tạo nhiều sinh khối nhằm phục vụ cho nghiên cứu Bước đầu khảo sát điều kiện sinh trưởng chủng lựa chọn: Chủng E1 phát triển tạo sinh khối lớn môi trường LB, pH = - 8, nhiệt độ 30 - 42 oC Chủng E2 phát triển tạo sinh khối lớn môi trường LB, pH = - 8, nhiệt độ 30 - 42 oC Với kết bước đầu tiền đề để tiếp tục tiến hành nuôi cấy thu sinh khối sử dụng sinh khối phục vụ cho trình nghiên cứu trình phân hủy cao su chúng hướng tới tương lai đưa chủng vào ứng dụng xử lý mơi trường Hình Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E2 Tài liệu tham khảo [1] Nguyễn Hữu Trí, Công nghệ cao su thiên nhiên, NXB trẻ, 2008 [2] Đào Việt Linh, Luận văn thạc sĩ, Nagaoka university of Technology, 2013 [3] Bui Thi Trang, Dao Viet Linh, Nguyen Lan Huong, To Kim Anh, Phan Trung Nghia, and Fukuda Masao, “Screening of Natural Rubber – Degrading Microorganisms from Rubber Processing Factory Waste in Vietnam” International Journal of Waste Resources, 2013, 3, pp – 12 [4] Ibrahim E.M., Arenskotter M., Lufmann H., and Steinbuchel A, “Identification of poly (cis1,4-isoprene) degradation intermediates during growth of moderately thermophilic actinomycetes on rubber and cloning of a functional lcp homologue from Nocardia farcinia strains E1” A E Microbiol, 2016, 72, pp 3375-3382 [5] Kim H.C, Jayaram N, Gincy P.T, Nazalan N, Mas R H, Mas H, Kumar S, Identification of new rubber-degrading bacterial strains from aged latex Polymer Degradation and Stability, Volume, 2014, 109, pp 354–361 [6] Linos A, Berekaa M.M, Reichelt R, Keller U, Schmitt J, Flemming H.C, Biodegradation of poly (cis-1,4-polyisoprene) rubbers by distinct actinomycetes: microbial strategies and detailed surface analysis A E Microbiol, 2000, 66 pp 1639-1645 40 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology ISSN 2354-0575 INITIAL EVALUATION OF GROWTH CONDITIONS OF MICROORGANISMSBIODEGRADATION OF NATURAL RUBBER Abstract: Natural rubber is a polymer that is resistant to abrasion and tear It is widely used in making basic materials for the production of tires, rubber gloves, foam products, etc Along with the expansion of production waste and waste rubber need to take measures However, measures such as covering, burning and recycling rubber are difficult and less environmentally friendly Therefore, bioprocessing is one of the most effective and environmentally friendly pathways However, for biological treatment, the selection of microorganisms is of paramount importance and the use of native varieties will address the adaptation of microorganisms to new habitats and may Apply immediately to practice to reduce the process of surveying growth and development With the source extracted from the enrichment tank and the waste water, waste latex and waste sludge samples collected from a rubber processing from Cam Thuy - Thanh Hoa rubber factory, the research team isolated two strains E1 and E2 from the enrichment tank At the same time from isolates we went to study to investigate growth conditions to obtain the best biomass of each strain in the culture environment Keywords: Nature rubber, biodegradations, microbial, enrichment, growth conditions Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology 41 ... Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E2 Kết luận Với chủng có khả phân hủy cao su phân lập nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát điều kiện sinh trưởng phát triển chủng điều. .. chủng điều kiện nghiên cứu phịng thí nghiệm với mong muốn tìm điều kiện ni cấy để tạo nhiều sinh khối nhằm phục vụ cho nghiên cứu Bước đầu khảo sát điều kiện sinh trưởng chủng lựa chọn: Chủng E1... chọn Thực bước tương tự khảo sát với môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường phù hợp khảo sát bước với chủng E1, E2 bình tam giác chứa mơi trường ni cấy điều chỉnh pH từ đến Khả sinh trưởng chủng