Nghiên cứu thành phần hóa học hướngtác dụng chống oxy hóa của lá tràm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  Trần Thạch Thảo NGHIÊN CỨU Ầ Ọ ƢỚ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÀM (Folium Melaleucae) Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 BỘ GIÁO DỤ V Đ O ẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌ Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  Trần Thạch Thảo NGHIÊN CỨU Ầ Ọ ƢỚ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA (Folium Melaleucae) Chuyên ngành: Dƣợc học cổ truyền Mã số: 60.72.04.06 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học ƢỜ ƢỚNG DẤN KHOA HỌC: TS VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 i LỜ ĐO Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Tác giả Trần Thạch Thảo ii TÓM TẮT LUẬ VĂ Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dƣợc sĩ – năm học 2015 – 2017 Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc cổ truyền – Mã số: 60.72.04.06 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌ ƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÀM GIÓ (Folium Melaleucae) TRẦN THẠCH THẢO Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO Đặt vấn đề Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powel) dƣợc liệu dùng nhiều cho mục đích chiết tinh dầu Nhƣng chƣa có nghiên cứu nƣớc thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa lồi Đó lí tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa Tràm gió Folium Melaleucae” Đối tƣợng: Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell Quảng Ngãi hƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phân đoạn cao chiết mơ hình DPPH Sử dụng phƣơng pháp chiết phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột chân không, sắc ký Sephadex phƣơng pháp tinh chế khác để phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc dựa vào liệu khối phổ phổ NMR Kết bàn luận Bột Tràm gió (10 kg) đƣợc chiết ngấm kiệt với cồn 80%, thu đƣợc cao cồn đặc (1,9 kg) Từ cao cồn, chiết phân bố lỏng – lỏng lần lƣợt với dung môi thu đƣợc cao n-hexan (1,34 g), cao chloroform (85,89 g), cao ethyl acetat (152 g) Hoạt tính chống oxy hóa cao nồng độ 6,25 µg/ml cho kết giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (HTCO 39,52%) > cao nƣớc (11,02% ) > cao cloroform (10,69%) > cao n-hexan (2,23% ) Do cao ethyl acetat đƣợc chọn để khảo sát tiếp thành phần hóa học Từ 40 g cao ethyl acetat thu đƣợc chất IC50 chất phân lập đƣợc cao ethyl acetat đƣợc xác định so sánh với acid ascorbic, kết thu đƣợc nhƣ sau: acid ascorbic (IC50 = 2,41 µg/ml) > cao EA 8,23 (µg/ml) > myricitrin (9,87 µg/ml) > myricitin 3-O-methyl 3‟-βD-xylopyranosid (12,95 µg/ml) > quercitin 3-O-methyl 3‟-β-D-xylopyranosid > acid 3,3‟,4tri-O-methylellagic ii ABTRACT Thesis of master of pharmacy, course: 2015 – 2017 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Specciality code: 60.72.04.06 BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM THE LEAVES OF CAJEPUT TREE (Folium Melaleucae) TRAN THACH THAO Supervisors: Dr VO VAN LEO Introduction Melaleuca cajuputi Powell is a plant has been used for extracting oil But there has not been study about other chemical elements or pharmacology of Melaleuca cajuputi Powell in Vietnam Therefore, in this thesis, we aim to isolate substances of the leaves of Melaleuca cajuputi Powell for the antioxidant activity on DPPH Materials: the leaves of Melaleuca cajuputi Powell, collected in Quang Ngai Province Methods In-vitro screening of fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on DPPH assay Allocation of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, Sephadex Chroamatography and other refined means were performed to isolate pure compounds from fractions that had highly effective antioxidant outcome Interpretation of structure was based on NMR and MS method Results and discussion 10 kg of the leaves powder of Melaleuca cajuputi Powell was extracted with 80 % alcohol to obtain alcohol extract (1,9 kg) Alcohol extract was then consecutively liquid-liquid extracted with solvents to obtain n-hexane extract (1,34 g), chloroform extract (85,89 g), ethyl acetate extract (152 g) Antioxidant effects of extracts indicated at the concentration 6,25 µg/ml gave the result as follows: ethyl acetate extract (HTCO is 39,52%) > water extract (HTCO is 11,02%) > chloroform extract (HTCO is 10,69% ) > n-hexane extract (HTCO is 2,23%) Therefore, ethyl acetate extract was selected for further analysis of chemical compounds From 40 g of the ethyl acetate extract, four compounds were achieved IC 50 values of isolated substances and ethyl acetate extract were compared with ascorbic acid and the results obtained were as follows: acid ascorbic (IC50 = 2,41 µg/ml) > cao EA (8,23 µg/ml) > myricitrin (9,87 µg/ml) > myricitin 3-O-methyl 3‟-β-D-xylopyranosid (12,95 µg/ml) > quercitin 3-O-methyl 3‟-β-D-xylopyranosid > acid 3,3‟,4-tri-O-methylellagic v MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm họ Myrtaceae (Họ Sim) 1.1.3 Mơ tả hình thái chi Melaleuca .4 1.1.4 Đặc điểm thực vật học loài Melaleuca cajuputi Powell 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học chi Melaleuca 1.2.2 Thành phần hóa học lồi Melaleuca cajuputi Powell 11 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƢỢC LÝ 13 1.3.1 Theo y học cổ truyền 13 1.3.2 Theo y học đại 13 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 14 1.4.1 Khái niệm .14 1.4.2 Hệ thống chống oxy hoá 15 1.4.3 Cơ chế chống oxy hóa 16 1.4.4 Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 17 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 21 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu .21 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 23 2.2.2 Thử tinh khiết 23 v 2.2.3 Xác định hàm lƣợng chất chiết đƣợc dƣợc liệu 23 2.2.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 23 2.2.5 Chiết xuất .24 2.2.6 Tách phân đoạn chiết phân bố lỏng-lỏng 24 2.2.7 Phƣơng pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vitro 24 2.2.8 Phân lập tinh chế chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 26 2.2.9 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 27 2.2.10 Xác định khả chống oxy hóa chất tinh khiết 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC 30 3.1.1 Đặc điểm hình thái dƣợc liệu .30 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu Tràm gió 30 3.1.3 Soi bột dƣợc liệu Tràm gió 32 3.2 THỬ TINH KHIẾT 34 3.3 HÀM LƢỢNG CHẤT CHIẾT ĐƢỢC TRONG BỘT LÁ TRÀM GIÓ 34 3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 34 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 34 3.3.2 Chiết xuất phân lập chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa .36 3.3.3 Kiểm tra khả chống oxy hóa cao chiết phân đoạn 37 3.3.4 Phân lập chất từ cao EA .40 3.4.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập đƣợc SKLM 45 3.4.6 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập UPLC 50 3.4.7 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 56 3.4.8 Tóm tắt kết q trình chiết xuất phân lập 84 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRÊN CHẤT TINH KHIÊT .84 3.5.1 Định tính SKLM 84 3.5.2 Thử HTCO chất phân lập phƣơng pháp DPPH .85 3.6 BÀN LUẬN 91 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên br broad Đỉnh rộng 13 13 Cộng hƣởng từ hạt nhân C13 C-NMR H-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân proton CF Chloroform Cloroform COSY Correlated Spectroscopy Phổ tƣơng quan 1H – 1H d doublet Đỉnh đôi DCM Dichloromethane Dicloromethan dd doublet of doublets Đỉnh đôi k p DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Phổ DEPT Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate Ethyl acetat HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Inhibitor concentration 50% Nồng độ ức chế 50% J coupling constant Hằng số gh p J m multiplet Nhiều đỉnh, đỉnh bội MDA Malonyl dialdehyd MBC Minimal Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu ii MIC Minimal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MS Mas spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu s singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc k lớp mỏng Sắc k lớp mỏng tR Retention time Thời gian lƣu UV Ultra violet (Phổ) tử ngoại VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký (cột) chân không VS Vanilin - sulfuric Thuốc thử Vanilin-sulfuric UPLC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) Hình 1.2 Cấu trúc hóa học flavonoid phân lập đƣợc từ Melaleuca leucadendra L 10 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học polyphenol phân lập đƣợc từ Melaleuca quinquenervia (Cav.) S T Blake 10 Hình 1.4 Flavonoid Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell 11 Hình 1.5 Chromon Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell 12 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) 30 Hình 3.7 Vi phẫu (A), Sơ đồ cấu tạo (B) Tràm gió .30 Hình 3.8 Cấu tạo giải phẫu Tràm gió .31 Hình 3.9 Bột Tràm gió 32 Hình 3.10 Các cấu tử bột Tràm gió 33 Hình 3.11 SKLM kiểm tra cao phân bố 37 Hình 3.12 Sắc k đồ cao phân đoạn Tràm gió với TT DPPH 38 Hình 13 Biểu đồ kết thử HTCO phân đoạn cao chiết 39 Hình 3.14 Sắc k đồ phân đoạn cao EA qua cột VLC 41 Hình 3.15 Sắc k đồ ME-1 hệ dung mơi .46 Hình 3.16 Sắc k đồ ME-2 ME-3 hệ dung mơi 48 Hình 3.17 Sắc k đồ ME-4 hệ dung môi .49 Hình 3.18 Sắc k đồ ME-5 hệ dung môi .50 Hình 3.19 Sắc ký đồ UPLC ME-1 51 Hình 3.20 Sắc k đồ UPLC ME-2 52 Hình 3.21 Sắc k đồ UPLC ME-3 53 Hình 3.22 Sắc k đồ UPLC ME-4 54 Hình 3.23 Sắc k đồ UPLC ME-5 55 Hình 3.24 Phổ MS (MS-) ME-1 .56 Hình 3.25 Phổ UV (MeOH) ME-1 57 Hình 3.26 Khung ME-1 58 Hình 3.27 Cơng thức cấu tạo ME-1 60 PL-18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 35 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) hợp chất ME-3 Phụ lục 36 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) trích vùng 65-110 ppm hợp chất ME-3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 37 Phổ HSQC (DMSO d6,) hợp chất ME-3 Phụ lục 38 Phổ HSQC (DMSO d6) trích vùng 65-110; 3-7 ppm hợp chất ME-3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 39 Phổ HMBC (DMSO d6,) hợp chất ME-3 Phụ lục 40 Phổ HMBC (DMSO d6,) trích vùng 90-170; 4-13 ppm hợp chất ME-3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-21 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 41 Phổ HMBC (DMSO d6,) trích vùng 90-165; 5-7 ppm hợp chất ME-3 Phụ lục 42 Phổ HMBC (DMSO d6,) trích vùng 15-75; 0,5-5,5 ppm hợp chất ME-3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-22 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 43 Phổ HMBC (DMSO d6) trích vùng 66-75,5; 0,5-5,5 ppm hợp chất ME-3 Phụ lục 44 Phổ COSY (DMSO d6) hợp chất ME-3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-23 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 45 Phổ COSY (DMSO d6) trích vùng 6-7,1 ppm hợp chất ME-3 Phụ lục 46 Phổ COSY (DMSO d6) trích vùng 3-5,4 ppm hợp chất ME-3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 47 Phổ COSY (DMSO d6) trích vùng 0,5-3,5 ppm hợp chất ME-3 Phụ lục 48 Phổ 13C-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-25 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 49 Phổ 13C-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) trích vùng 65-180 ppm hợp chất ME-4 Phụ lục 50 Phổ 1H-NMR (DMSO d6,, 500 MHz) hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 51 Phổ 1H-NMR (DMSO d6,, 500 MHz) trích vùng 6,1-7,9 ppm hợp chất ME-4 Phụ lục 52 Phổ 1H-NMR (DMSO d6,, 500 MHz) trích vùng 3,2-5,8 ppm hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 53 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) hợp chất ME-4 Phụ lục 54 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) trích vùng 60-175 ppm hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 55 Phổ HSQC (DMSO d6) hợp chất ME-4 Phụ lục 56 Phổ HSQC (DMSO d6) trích vùng 90-125; 6-8 ppm hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 57 Phổ HSQC (DMSO d6) trích vùng 55-105; 3-5 ppm hợp chất ME-4 Phụ lục 58 Phổ HMBC (DMSO d6) hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 59 Phổ HMBC (DMSO d6) trích vùng 90-165; 6-8 ppm hợp chất ME-4 Phụ lục 60 Phổ HMBC (DMSO d6) trích vùng 65-155; 3-5,2 ppm hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 61 Phổ COSY (DMSO d6) hợp chất ME-4 Phụ lục 62 Phổ COSY (DMSO d6) trích vùng 3-5,2 ppm hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 63 Phổ COSY (DMSO d6) trích vùng 6-8 ppm hợp chất ME-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn ... ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa Tràm gió Folium Melaleucae” Đối tƣợng: Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell Quảng Ngãi hƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy. .. nghiên cứu thành phần tác dụng dƣợc lý thành phần ngồi tinh dầu 2 Chính thực tiễn đó, khuôn khổ luận văn cao học, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hƣớng tác dụng chống oxy. .. đƣợc dùng để phân tích thành phần hóa học kiểm tra tác dụng chống oxy hóa 2.2.7 hƣơng pháp sàng ọc tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vitro 2.2.7.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH