Tổng quan về bacterioncin và ứng dụng của bacterioncin trong bảo quản thực phẩm, enterocin, các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein ngoại lai ở nấm men; vật liệu và phương pháp nghiên cứu; kết quả và thảo luận.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Biểu enterocin E-760 tái tổ hợp Pichia pastoris đánh giá khả kháng khuẩn BÙI TRUNG HIẾU hieu.buitrung.bio@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Quang Hòa TS Nguyễn Thị Nhung Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Bùi Trung Hiếu Đề tài luận văn: Biểu enterocin E-760 tái tổ hợp Pichia pastoris đánh giá khả kháng khuẩn Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CA190014 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 30/10/2020 với nội dung sau: Các nội dung chỉnh sửa theo ý kiến Phản biện 1: PGS.TS Đinh Duy Kháng STT Ý kiến phản biện 1 Nội dung chỉnh sửa Chương 1: Tổng quan chung - Chỉ dẫn text hình khơng khớp với hình ảnh (hình 1.2 >< hình 1.1) - Tác giả chỉnh sửa dẫn luận hình khơng khớp (Hình 1.2) dòng số đoạn 1, trang thuộc Mục 1.1.2 Phân loại bacteriocin - Cơ chế để cắt đuôi - Tác giả trình bày trước dịng số dung hợp SUMO 13 thuộc đoạn số trang 20, thuộc phần 1.3.3 khỏi protein dung hợp? Tổng quan SUMO-3 protein ứng dụng làm protein dung hợp Chương 2: Vật liệu - Khơng có u cầu chỉnh sửa từ phản biện phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận - Thiếu giải hình (thử hoạt tính kháng khuẩn khơng nêu tên vi khuẩn kiểm định) - Tác giả bổ sung tên chủng vi khuẩn kiểm định L monocytogenes vào hình: + Hình 3.10 trang 44 hình 3.11 trang 45 thuộc Mục 3.4.2 Sàng lọc chủng biểu SUMOE; + Hình 3.15 hình 3.16 trang 51 thuộc Mục 3.5.4 Tối ưu tỉ lệ thể tích bình ni cấy ; + Hình 3.18 trang 52 hình 3.21 trang 54 thuộc Mục 3.6 Tách chiết sơ bộ, thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn ent760 tái tổ hợp - Tác giả có đánh giá - Tác giả gửi mẫu đánh giá độc tính cấp STT Ý kiến phản biện tính độc enterocin E-760 để phù hợp với định hướng sử dụng bảo quản thực phẩm hay không? Nội dung chỉnh sửa chế phẩm Học viện Quân y Kết đánh giá trình bày trang 56 thuộc Mục 3.8 Thảo luận kết đánh giá tính an tồn chế phẩm Học viện Quân y Phiếu phân tích kết thuộc phần Phụ lục Các phiếu phân tích kết luận văn - Khơng thấy tác giả nêu trình tự axit amin sử dụng để tối ưu hóa codon trình tự axit amin biểu - Tác giả bổ sung thêm trình tự axit amin sử dụng để tối ưu hóa codon cho biểu nấm men dòng số trang 39 Và trình tự nucleotide gene mã hóa ent760 sau tối ưu hóa codon dịng thứ - 6, đoạn trang 37 thuộc Mục 3.1 Nghiên cứu phù hợp mã ba trình tự nucleotide mã hóa cho peptide kháng khuẩn ent760 cho biểu gene nấm men P pastoris; - Tác giả bổ sung thêm Hình 3.2 Cấu trúc gene mã hóa ent760 dung hợp SUMO (SUMOE) tổng hợp nhân tạo, kích thước 507 bp kiểm tra sản phẩm sau dịch mã trang 38 Chương 4: Kết luận kiến nghị - S aureus vi khuẩn - Tác giả chỉnh sửa dịng thứ 20 trang Gram dương khơng 57 Kết luận, S aureus vi khuẩn phải Gram âm viết Gram dương kết luận Các nội dung chỉnh sửa theo ý kiến Phản biện 2: TS Nguyễn Tiến Thành STT Ý kiến phản biện Nội dung chỉnh sửa Chương 1: Tổng quan chung - Mục 1.2.3 Tình hình nghiên cứu enterocin giời Việt Nam nên chia thành 02 mục nhỏ tình hình giới Việt Nam để người đọc dễ theo dõi - Tác giả chia chia mục tình hình nghiên cứu enterocin thành 02 mục nhỏ để thuận lợi cho người đọc gồm: + Mục 1.2.3 Tình hình nghiên cứu enterocin giới trang 11; + Mục 1.2.4 Tình hình nghiên cứu enterocin Việt Nam trang 13 - Bổ sung thêm hình thể - Tác giả bổ sung thêm Hình 1.13 Vị trí cắt đặc hiệu enzyme giới hạn vị trí STT Ý kiến phản biện Nội dung chỉnh sửa vị trí cắt gắn đặc hiệu cặp mồi gene AOX1 (5’ enzyme giới hạn để AOX1 priming site 3’ AOX1 priming người đọc dễ theo dõi site) vector pPICZαA trang 18 Mục 1.3.2 Tổng quan vector biểu pPICZαA - Bổ sung thêm phần - Tác giả bổ sung thêm mục 1.5 Mục tiêu mục tiêu nội dung nội dung nghiên cứu đề tài trang nghiên cứu đề tài 23 24 thuộc Chương Tổng quan chung sau tổng quan Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Khơng có hình mơ tả thí nghiệm sinh học phân tử để thực nghiên cứu - Không thấy tác giả thể thông số công nghệ tốc độ lắc nhiệt độ nuôi cấy sau cảm ứng chủng biểu Methanol - Tác giả bổ sung thêm hình 2.1 Mơ tả thí nghiệm bước thực sàng lọc chủng biểu trang số 27 28 - Tác giả bổ sung thông tin tốc độ lắc nhiệt độ nuôi cấy thời điểm cảm ứng trang 35 Mục 2.2.10 Biểu gene mã hóa SUMOE P pastoris Chương 3: Kết thảo luận - Mục 3.5.4 bỏ hình ảnh đường chuyển hóa methanol khỏi kết chuyển lên phần tổng quan - Tác giả chuyển hình đường chuyển hóa methanol mục kết thành Hình 1.7 Con đường chuyển hóa methanol nấm men Pichia pastoris trang 15, Mục 1.3.1 Hệ biểu P pastoris, Chương tổng quan chung - Mục 3.6 nên chuyển - Tác giả chuyển quy trình thực thí quy trình thực thí nghiệm tủa phân đoạn xuống phần phụ lục 2: nghiệm xuống phần phụ Quy trình tủa phân đoạn cồn lục Chương 4: Kết luận kiến nghị - Kiến nghị tác giả thực - Tác giả bổ sung thêm kết giải trình giải trình tự gene tự gene sau chuyển gene vào nấm men để biết xác gene phần Phụ lục biểu Các nội dung chỉnh sửa theo ý kiến thành viên khác Hội đồng STT Ý kiến thành viên Hội đồng Nội dung chỉnh sửa Chưa có cam kết - Tác giả bổ sung thêm Bản cam kết các kết nghiên cứu kết sử dụng đề tài tác luận văn học giả thực viên tự thực Tác giả cần sửa chữa - Tác giả chỉnh sửa dẫn luận sai sót đánh hình khơng khớp (Hình 1.2) dòng số đoạn 1, trang thuộc Mục 1.1.2 Phân loại số hình, bảng biểu bacteriocin theo ý kiến phản biện Viết lại phần tổng quan - Tác giả thêm Mục 1.2.1 Vi khuẩn sinh tập trung vào chủ đề tổng hợp enterocin: Enterococcus trang 09 để giới thiệu vi khuẩn sinh tổng hợp luận văn enterocin lý lựa chọn sản xuất enterocin tái tổ hợp mà không sử dụng trực tiếp chủng tự nhiên để sinh tổng hợp; - Tác giả bổ sung thêm Mục 1.5 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài trang số 23 24 thuộc Chương Tổng quan chung theo ý kiến phản biện Tóm lược lại phần - Tác giả chuyển bảng thành phần môi trường Chương Vật liệu phương phương pháp pháp nghiên cứu sang phần Phụ lục Thành phần mơi trường sử dụng nghiên cứu để tóm lược lại phương pháp nghiên cứu để người đọc dễ theo dõi Bổ sung thêm hình ảnh, - Tác giả bổ sung thêm trình tự axit amin số liệu để minh họa cho sử dụng để tối ưu hóa codon cho biểu lập luận nấm men dòng thứ 8, đoạn trang 38 Và trình tự nucleotide gene mã hóa ent760 sau tối ưu hóa codon dịng thứ - 6, đoạn trang 38 thuộc Mục 3.1 Nghiên cứu phù hợp mã ba trình tự nucleotide mã hóa cho peptide kháng khuẩn ent760 cho biểu gene nấm men P pastoris để chứng minh phù hợp codon sử dụng biểu hiện; - Tác giả bổ sung thêm Hình 3.2 Cấu trúc gene mã hóa ent760 dung hợp SUMO (SUMOE) tổng hợp nhân tạo, kích thước 507 bp kiểm tra sản phẩm sau dịch mã STT Ý kiến thành viên Hội đồng Nội dung chỉnh sửa trang 39 để nêu rõ cấu trúc gene tổng hợp sản phẩm protein dịch mã tương ứng; - Tác giả thêm biện luận trích dẫn tài liệu tham khảo để chứng minh sản phẩm biểu enterocin E-760 đoạn 03 trang 46 Mục 3.4.2 Sàng lọc chủng biểu SUMOE Bổ sung thêm tài liệu - Tác giả bổ sung thêm 09 mục tài liệu tham khảo cho phần tham khảo phần kết thảo luận để đối chiếu so sánh kết nghiên cứu thảo luận đề tài với cơng bố trước đó, gồm: + Trích dẫn tài liệu [10], [55], [74] dòng số 13, tài liệu [55] dòng 15 đoạn trang 46 thuộc Mục 3.4.2 Sàng lọc chủng biểu SUMOE; + Trích dẫn tài liệu [3] dòng đoạn trang 48 thuộc Mục 3.5.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy; + Trích dẫn tài liệu [57], [91] dịng số 4, đoạn 1, trang 49 thuộc Mục 3.5.2 Tối ưu pH; + Trích dẫn tài liệu [9], [45], [92] dịng số đoạn trang 50 thuộc Mục 3.5.3 Tối ưu hàm lượng chất cảm ứng Ngày Giáo viên hướng dẫn TS Lê Quang Hòa TS Nguyễn Thị Nhung CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS TS Tô Kim Anh tháng năm 2020 Tác giả luận văn Bùi Trung Hiếu Mẫu 1c ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Họ tên người hướng dẫn chính: Lê Quang Hịa Học vị: Tiến sĩ Cơ quan: Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Họ tên người hướng dẫn phụ (nếu có): Nguyễn Thị Nhung Học vị: Tiến sĩ Cơ quan : Viện Công nghệ mới/ Viện Khoa học công nghệ quân Email: tepnhung@gmail.com DĐ: 0914367176 CQ: 069 516281 NR: Nội dung: Chuyên ngành: Công nghệ sinh học a Tên đề tài: Biểu enterocin E-760 tái tổ hợp Pichia pastoris đánh giá khả kháng khuẩn Mục tiêu đề tài (các kết cần đạt được): tạo dòng P pastoris tái tổ hợp biểu enterocin E-760 b Nội dung đề tài, vấn đề cần giải quyết: - Thiết kế gene tổng hợp nhân tạo - Tạo dòng P pastoris tái tổ hợp biểu enterocin E-760 - Tối ưu hóa điều kiện thu nhận enterocin E-760 P pastoris - Xây dựng quy trình tách chiết tinh enterocin E-760 - Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm enterocin E-760 Người hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) TS Lê Quang Hòa TS Nguyễn Thị Nhung Lời cam đoan Học viên: Bùi Trung Hiếu Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn 1: TS Lê Quang Hịa Đơn vị: Viện Cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/ Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Nhung Đơn vị: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học Công nghệ quân Tên luận văn: “Biểu enterocin E-760 tái tổ hợp Pichia pastoris đánh giá khả kháng khuẩn” Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, suốt trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn, bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Bùi Trung Hiếu Lời cảm ơn Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hịa, Viện Cơng nghệ sinh học Cơng nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Nguyễn Thị Nhung, Viện Công nghệ /Viện Khoa học Cơng nghệ qn sự, tận tình, hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn Trong thời gian thực tập làm việc phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học phân tử Viện Công nghệ mới, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kỹ thuật động viên chân thành ThS Nguyễn Khánh Hoàng Việt toàn thể anh, chị cán phịng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Nhân dịp xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ q trình thí nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Nghiên cứu sản xuất enterocin tái tổ hợp để bảo quản thực phẩm tươi sống cho đội Hải quân” năm 2019, chủ nhiệm đề tài Trung úy ThS Tô Lan Anh Viện Công nghệ /Viện Khoa học Công nghệ quân Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kỹ thuật phương pháp nghiên cứu cán thuộc Viện Công nghệ sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ q trình nhóm đề tài thực thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ /Viện Khoa học Công nghệ quân Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi, giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Bùi Trung Hiếu Tóm tắt nội dung luận văn Bảo quản lương thực, thực phẩm hạn chế sinh sản tiêu diệt loại vi khuẩn, nấm men, nấm mốc; hạn chế phân hủy, biến chất thực phẩm từ kéo dài thời gian sử dụng Hiện nay, việc bảo quản thực phẩm tươi sống trình vận chuyển, sử dụng cịn gặp nhiều khó khăn Chất lượng tất loại thực phẩm giảm theo thời gian không bảo quản cách Các yếu tố gây nên giảm chất lượng thực phẩm phân loại thành nhóm: (1) Các yếu tố nội bao gồm pH, độ ẩm, enzyme, chất loại thực phẩm; (2) yếu tố bên ngồi bao gồm nhiệt độ, khơng khí, ánh sáng, độ ẩm vi sinh vật Trong đó, tác nhân gây nên hư hỏng thực phẩm vi sinh vật Vi sinh vật không tác nhân gây nên hư hỏng thực phẩm mà chúng cịn ngun nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, với số ca bị ngộ độc thực phẩm vi khuẩn chiếm tới 66% tổng số ca bệnh Các lồi vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm bao gồm Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Bacillus cereus, Vibrio số chủng Escherichia coli Hiện nay, thực phẩm nói chung bảo quản phương pháp: vật lý, hóa học sinh học Tuy nhiên, phương pháp bảo quản sử dụng hóa chất dùng liều gây ngộ độc cấp tính ngộ độc mãn tính gây bệnh tiềm tàng khác Xu hướng ngành công nghiệp thực phẩm giới sử dụng chất bảo quản sinh học thay cho chất bảo quản hóa học chế biến thực phẩm, điển hình bacteriocin, với chất chuỗi peptide ngắn, vi khuẩn tiết để tiêu diệt vi khuẩn họ hàng Nisin bacteriocin tiêu biểu thương mại sử dụng bảo quản thực phẩm nhiều nước giới Mặc dù chứng minh có khả kháng khuẩn tốt nisin có số nhược điểm sau: (1) Nisin phát huy tác dụng kháng khuẩn pH sản phẩm 5; (2) phần lớn khả ức chế vi khuẩn Gram âm; (3) tan không tốt; (4) làm tăng vi khuẩn kháng nisin môi trường Từ lý trên, nhà khoa học khơng ngừng tìm phát bacteriocin có để ứng dụng qui trình lên men để đảm bảo an toàn chất lượng vệ sinh thực phẩm Trong đó, điển hình enterocin Enterocin thuộc nhóm II bacteriocin (một chất kháng khuẩn từ Enterococcus faecium) giới quan tâm Enterocin mang đầy đủ đặc điểm ưu việt vượt trội bacteriocin ứng dụng bảo quản thực phẩm như: khả kháng khuẩn tốt; nguồn gốc tự nhiên; không độc; chịu nhiệt hoạt động dải pH rộng Tại Việt Nam, enterocin nghiên cứu số phịng thí nghiệm Đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Công nghệ thực phẩm, Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch Tuy nhiên, enterocin sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn Enterococci Đây vi khuẩn Gram dương sinh độc tố nên khó sử dụng trực tiếp bảo quản thực phẩm (Floulquie Moreno cộng sự, 2006; Martin-Platero cộng sự, 2009) nên xu hướng chung giới sản xuất enterocin dạng tái tổ hợp để ứng dụng bảo quản thực phẩm Tại Viện Công nghệ sinh học/Viện Hàn lâm KH-CN Việt Nam 76 77 78 79 80 PHỤ LỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ... tài: ? ?Biểu enterocin E- 760 tái tổ hợp Pichia pastoris đánh giá khả kháng khuẩn? ?? thực với mục tiêu: Nghiên cứu biểu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn enterocin E- 760 tái tổ hợp có khả kháng vi khuẩn. .. Tris-Bufer Saline Tetramethylethylenediamine Vòng/phút Small ubiquitin-related modifier Protein SUMO dung hợp enterocin E- 760 Vector pPICZαA cài gene mã hóa enterocin E7 60 dung hợp SUMO Chủng nấm men... hóa enterocin E- 760 cho biểu gene nấm men P pastoris Nghiên cứu phác thảo cấu trúc biểu gene mã hóa enterocin P pastoris để đặt tổng hợp cấu trúc gene mã hóa cho enterocin Bước 2: Tổng hợp gene