Tách dòng và biểu hiện gen DPS mã hóa decaprenyl diphosphate synthase từ agrobacterium tumefaciens

Nghiên cứu tách DNA tổng số từ A.tumefaciens EHA. Phân lập gen dps mã hóa decaprenyl diphosphate synthase từ A.tumefaciens EHA. Tách dòng gen dps vào vector biểu hiện. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang vector biểu hiện chứa gen dps. Nghiên cứu tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Đinh Văn Minh TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN DPS MÃ HÓA DECAPRENYL DIPHOSPHATE SYNTHASE TỪ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trương Quốc Phong Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trương Quốc Phong (Trưởng phịng thí nghiệm Proteomics – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội), người tận tình hướng dẫn tạo điều kiện làm việc tốt cho suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo cán công tác Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, bạn làm việc phịng thí nghiệm nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 03 năm 2013 Học viên Đinh Văn Minh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Trương Quốc Phong giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu phòng thí nghiệm Proteomics – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà nội Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Học viên Đinh Văn Minh iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Tính chất, vai trò ứng dụng CoQ10 1.1.1 Tính chất CoQ10 .3 1.1.2 Vai trò CoQ10 1.1.3 Ứng dụng CoQ10 1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất CoQ10 1.3 Sinh tổng hợp CoQ10 .8 1.4 Các chiến lược để nâng cao khả sản xuất CoQ10 11 1.5 Nghiên cứu tách dòng gen dps biểu chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang plasmid chứa gen dps sinh tổng hợp CoQ10 19 1.6 Nhân nuôi Agrobacterium tumefaciens để thu CoQ10 19 1.7 Tách chiết tinh CoQ10 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 23 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu .23 2.1.2 Chủng vi sinh vật 24 iv 2.1.3 Hóa chất thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Tách DNA tổng số 27 2.2.2 Tách plasmid 27 2.2.3 Thiết kế mồi 28 2.2.4 PCR 28 2.2.5 Giải trình tự gen 30 2.2.6 Điện di DNA gel agarose .30 2.2.7 Thôi gel 31 2.2.8 Tinh DNA 32 2.2.9 Tạo tế bào khả biến: E coli A tumefaciens 32 2.2.10.Phương pháp xử lý enzyme cắt giới hạn .33 2.2.11.Ligation 34 2.2.12.Biến nạp: Sốc nhiệt, xung điện 35 2.2.12.Phương pháp tách chiết CoQ10 .36 2.2.13.Định lượng CoQ10 37 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 3.1 Tách DNA tổng số từ A tumefaciens EHA 39 3.2 Thiết kế mồi sử dụng PCR để thu gen dps từ A tumefaciens EHA .39 3.3 PCR nhân gen dps từ A tumefaciens EHA 40 3.4 Giải trình tự gen dps từ A tumefaciens EHA 42 3.5 Kết cắt nối ghép gen dps vector pCAMBIA1301 44 3.5.1 Xử lý vector pCAMBIA1301 với enzym giới hạn 44 3.5.2 Xử lý enzym giới hạn tinh gen dps 45 v 3.6 Kết chọn dòng E coli mang cấu trúc pCAM-dps tái tổ hợp 46 3.6.1 Biến nạp vector pCAMBIA1301 mang gen dps vào E coli DH10b .46 3.6.2 Kiểm tra plasmid E coli DH10b tái tổ hợp .47 3.6.3 PCR nhân gen dps từ plasmid E coli DH10b tái tổ hợp 48 3.7 Tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc biểu pCAM-dps 49 3.7.1 Tạo tế bào A tumefaciens EHA khả biến .49 3.7.2 Biến nạp cấu trúc pCAM-dps vào A tumefaciens EHA 51 3.7.3 Kiểm tra gen dps từ plasmid chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp… 51 3.8 Khả sản xuất CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp 52 3.8.1 Đánh giá khả sinh CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp so với chủng gốc 54 3.8.2 Thiết lập số điều kiện nuôi A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 54 KẾT LUẬN .58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 vi DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp : Cặp bazơ (Base pair) CoQ10 : Coenzyme Q10 Cs Da : : Cộng Dalton DMAPP : Dimethylallyl diphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid DPS : Decaprenyl diphosphate synthase DXP : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate DXS : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase FPP : Farnesyl diphosphate GA3P : Glyceraldehyde-3-phosphate GPP : Geranyl diphosphate IPP : Isopentenyl pyrophosphate LDL cholesterol : Cholesterol có mật độ lipoprotein thấp MEP : 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate MVA : Mevalonate pHBA : 4-hydroxybenzoate RNA : Ribonucleic acid vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1(a) Tính chất Ubiquinone (CoQ10) Bảng 1(b) Tính chất Ubiquinol (CoQ10 H2) Bảng 3.1 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens tái tổ hợp so với chủng gốc 54 Bảng 3.2 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường khác 55 Bảng 3.3 So sánh khả sinh tổng hợp CoQ10 nhiệt độ khác 56 Bảng 3.4 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường có giá trị pH ban đầu khác 56 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học coenzyme Q10 Hình 1.1 Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 Hình 1.2 Các phương pháp điều khiển trao đổi chất để tăng sản xuất CoQ10 12 Hình 2.1 Vector pCAMBIA1301 23 Hình 2.2 Chu trình phản ứng PCR 30 Hình 2.3 Phản ứng ethyl cyanoacetate CoQ10 37 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số thu từ A tumefaciens EHA 39 Hình 3.2 Kết nhân gen dps từ A tumefaciens PCR 40 Hình 3.3 Xử lý pCAMBIA1301 với NheI BglII 44 Hình 3.4 Điện sản phẩm thơi gel thu đoạn 9823 bp 45 Hình 3.5 Gen dps sau xử lý với NheI BglII, tinh 46 Hình 3.6 Khuẩn lạc tế bào E coli DH10b chứa vector pCAMBIA1301 mang gen dps mơi trường thạch LB có kháng sinh kanamycin 47 Hình 3.7 Kết điện di plasmid thu từ chủng E coli DH10b tái tổ hợp 48 Hình 3.8 Diện di sản phẩm PCR với khuôn plasmid từ dòng E coli DH10b tái tổ hợp 49 Hình 3.9 Kiểm tra tế bào A tumefaciens EHA khả biến 50 Hình 3.10 Khuẩn lạc A tumefaciens EHA tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps mơi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin 51 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen dps từ khuôn plasmid thu chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp 52 Hình 3.12 Đường chuẩn CoQ10 53 ix MỞ ĐẦU Coenzyme Q10 (CoQ10) coenzyme quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử màng tế bào sinh vật nhân sơ màng ty thể tế bào sinh vật nhân thực tạo thành từ liên kết vòng benzoquinone với chuỗi isoprenoid kỵ nước Coenzyme Q10 có vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp ATP (chất dự trữ lượng quan trọng tất loại tế bào) chất chống oxy hóa mạnh Do đó, CoQ10 sử dụng nhiều làm thực phẩm chức năng; ứng dụng y tế nhằm ngăn ngừa, điều trị nhiều bệnh tim mạch, tiểu đường, Parkinson, ung thư, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp, bổ sung vào mỹ phẩm chất chống oxy hóa, chống lão hóa Với nhiều ứng dụng có lợi nên nhu cầu CoQ10 ngày tăng lên Để đáp ứng nhu cầu có nhiều giải pháp đưa tổng hợp hóa học, bán tổng hợp cơng nghệ sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên CoQ10 sản xuất chủ yếu đường sinh học nhờ vi khuẩn A tumefaciens, P denitrificans, Cryptococcus laurentii, Tricosporon sp., Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Để nâng cao hiệu sản xuất CoQ10, nhiều nghiên cứu giới tập trung vào tối ưu hóa q trình lên men chủng tự nhiên cải biến chủng từ năm 1993 Việc cải biến chủng thực cách gây đột biến ngẫu nhiên tạo chủng tái tổ hợp Mặc dù chủng đột biến có khả tổng hợp CoQ10 tăng, nhiên chủng khó cải biến để tăng thêm hiệu suất Hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen mã hóa số enzyme quan trọng đường sinh tổng hợp CoQ10 dxs, dps Tuy nhiên, khả tổng hợp CoQ10 thấp so với chủng đột biến Ngoài ra, chủng E coli tái tổ hợp khơng tổng hợp CoQ10 mà cịn tổng hợp CoQ8 CoQ9 Đây điều bất lợi đặc biệt sản xuất quy mô công nghiệp cần nhiều bước tinh hồn thiện sản phẩm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn sử dụng để sản xuất CoQ10 chúng có nhiều ưu điểm có hàm lượng 3.7.2 Biến nạp cấu trúc pCAM-dps vào A tumefaciens EHA Plasmid tái tổ hợp từ dòng E coli DH10b số mang gen dps thu biến nạp vào A tumefaciens EHA khả biến phương pháp xung điện Quá trình biến nạp trình bày mục 2.2.12 Và kết xuất khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc chứa kháng sinh kanamycin, hình sau: Hình 3.10 Khuẩn lạc A tumefaciens EHA tái tổ hợp mang cấu trúc pCAMdps môi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin A tumefaciens EHA chủng gốc khơng có khả phát triển mơi trường chứa kháng sinh kanamycin, sau biến nạp vào cấu trúc biểu pCAMdps, có xuất khuẩn lạc mọc mơi trường có kháng sinh Vì vector pCAMBIA1301 mang gen kháng kháng sinh kanamycin Để khẳng định lại vector pCAMBIA1301 biến nạp vào A tumefaciens EHA có mang gen dps, chúng tơi tiến hành PCR nhân gen dps từ plasmid chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp 3.7.3 Kiểm tra gen dps từ plasmid chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp Chúng tiến hành nhân nuôi chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang vector kháng kháng sinh kanamycin thu để tách plasmid Plasmid thu tiến hành PCR với mồi dps2 để nhân đoạn gen dps Kết PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% thu kết điện di sau: 51 ~1077 bp Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen dps từ khuôn plasmid thu chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp Chú thích: 1: 100 bp lader, Biolab; 2: Sản phẩm PCR với mồi dps2 từ khuôn plasmid tách từ chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp Giếng số xuất băng có kích thước khoảng 1077 bp, với kích thước gen dps cần nhân lên Như vậy, thấy plasmid tách từ chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp mang gen dps Vì vậy, khẳng định trình biến nạp cấu trúc biểu pCAMBIA1301-dps vào A tumefaciens EHA thành công Và tạo chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp mang cấu trúc biểu pCAMBIA1301-dps để phục vụ cho nghiên cứu 3.8 Khả sản xuất CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp Chủng A tumefaciens EHA mang vector tái tổ hợp chứa gen dps nhân nuôi đánh giá khả sinh tổng hợp CoQ10 Nó so sánh khả tổng hợp CoQ10 với chủng A tumefaciens EHA ban đầu, so sánh điều kiện môi 52 trường nuôi khác nhau, nhiệt độ nuôi khác nhau, môi trường nuôi ban đầu với giá trị pH khác Sau tách thu CoQ10, tiến hành xác định hàm lượng CoQ10 dựa phản ứng tạo màu xanh ethyl cyanoacetate CoQ10 Thí nghiệm tiến hành với mẫu thí nghiệm mẫu kiểm chứng Mẫu thí nghiệm gồm 40 µl mẫu thu 10 µL ethyl cyanoacetat Mẫu kiểm chứng gồm 40 µl Ethanol 100 % 10 µl ethyl cyanoacetat Trộn đều, ủ phút nhiệt độ phịng Sau đó, thêm 10 µl KOH 0.2 N Đo kết phản ứng thiết bị đo quang, bước sóng 620 nm Để tính tốn hàm lượng CoQ10 từ kết đo được, chúng tơi xây dựng phương trình đường chuẩn CoQ10 đây: OD620 1.200 y = 0.064x + 0.0237 R² = 0.9992 1.000 0.800 0.600 Series1 Linear (Series1) 0.400 0.200 0.000 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 mg/L Hình 3.12 Đường chuẩn CoQ10 Dựa vào phương trình đường chuẩn CoQ10, từ giá trị đo, chúng tơi tính nồng độ CoQ10 (mg/L) 53 3.8.1 Đánh giá khả sinh CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp so với chủng gốc Tiến hành nhân nuôi A tumefaciens EHA tái tổ hợp chủng A tumefaciens EHA gốc mơi trường THQ10, lắc 120 vịng/phút, 30oC, pH môi trường ban đầu 7,0 96 để đánh giá so sánh khả sinh tổng hợp CoQ10 Sau nuôi tiến hành tách chiết xác định nồng độ CoQ10 ta thu bảng kết sau: Bảng 3.1 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens tái tổ hợp so với chủng gốc Giá trị tính tốn Nồng độ CoQ10 (mg/L) So với chủng gốc A tumefaciens EHA A tumefaciens tái tổ hợp 4,56 7,32 1,6 Ta nhận thấy, chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang vector pCAMBIA1301 chứa gen dps, tăng 1,6 lần khả sinh tổng hợp CoQ10 so với chủng gốc, tương ứng với nồng độ CoQ10 tạo 4,56 7,32 mg/L Như vậy, việc mang thêm vector biểu chứa gen dps mã hóa cho enzym decaprenyl diphosphate synthase biến nạp có tác dụng tăng khả sinh CoQ10 A tumefaciens EHA 3.8.2 Thiết lập số điều kiện nuôi A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 3.8.2.1 Thành phần môi trường để chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 Để đánh giá khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường khác (môi trường THQ10 môi trường 2) ta tiến hành nuôi chủng môi trường này, pH ban đầu 7,0, lắc 120 vịng/phút, nhiệt độ 30oC, thời gian ni 96 Đo giá trị pH OD600 trước sau nuôi để đánh giá phát triển sinh khối môi trường Sau nuôi tiến hành tách chiết CoQ10 xác định hàm lượng ta thu kết bảng sau: 54 Bảng 3.2 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường khác Nồng độ Môi trường CoQ10 (mg/L) OD600 pH nuôi 96 nuôi 96 nuôi nuôi THQ10 7,23 0,113 7,52 8,8 Môi trường 6,45 0,283 6,48 8,2 Ta nhận thấy sau 96 nuôi A tumefaciens EHA tái tổ hợp, môi trường THQ10 cho hàm lượng CoQ10 cao so với môi trường (7,23 mg/L so với 6,45 mg/L), điều tương ứng với lượng sinh khối thu từ môi trường THQ10 nhiều so với môi trường (tương ứng 0,41 g/50 mL so với 0,30 g/ 50mL, đồng thời thể qua giá trị OD600 môi trường THQ10 cao môi trường 2) Giá trị pH sau 96 nuôi môi trường THQ10 môi trường 8,8 8,2 Điều giải thích lý do: là, mơi trường THQ10 trình phát triển sinh khối sinh tổng hợp CoQ10 mạnh nên làm tăng pH mạnh so với môi trường 2; hai là, môi trường có thành phần muối KH2PO4 K2HPO4 có tính đệm hóa mơi trường giúp tăng pH bị kìm hãm Như vậy, mơi trường THQ10 mơi trường giúp cho A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh trưởng sinh tổng hợp CoQ10 tốt so với mơi trường 3.8.2.2 Nhiệt độ thích hợp để chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 Tiến hành nuôi A tumefaciens EHA tái tổ hợp điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC 37oC, mơi trường THQ10, pH 7, lắc 120 vịng/phút, thời gian nuôi 96 Sau nuôi, tách chiết CoQ10 xác định hàm lượng, ta có bảng sau: 55 Bảng 3.3 So sánh khả sinh tổng hợp CoQ10 nhiệt độ khác Nhiệt độ (oC) Nồng độ CoQ10 (mg/L) OD600 pH nuôi 96 nuôi nuôi 96 nuôi 25 7,01 0,120 7.42 8,5 30 7,23 0,113 7,52 8,8 37 0.97 0,118 2.91 7,7 Ta nhận thấy 25oC 30oC, chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh trưởng sinh tổng hợp CoQ10 tốt Nuôi 30oC cho kết tốt với nồng độ CoQ10 thu 7,23 mg/L; 25oC thu hàm lượng CoQ10 7,01 mg/L Ở 37oC, chủng tái tổ hợp gần không phát triển không sinh tổng hợp CoQ10 (hàm lượng CoQ10 0,97 mg/L, giá trị OD600, pH tăng ít) Như vậy, 30oC nhiệt độ thích hợp để chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 3.8.2.3 pH ban đầu môi trường nuôi để chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 Nhân nuôi chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường THQ10, nhiệt độ 30oC, lắc 120 vòng/phút, giá trị pH ban đầu khác nhau: pH 6, Sau nuôi 96 giờ, tiến hành tách chiết định lượng CoQ10, ta thu bảng số liệu sau: Bảng 3.4 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường có giá trị pH ban đầu khác Nồng độ pH CoQ10 (mg/L) pH OD600 nuôi 96 nuôi nuôi 96 nuôi 6,69 0,115 7,04 8,1 7,23 0,113 7,52 8,8 4,18 0,204 6,34 7,8 56 Có thể đánh giá mơi trường trung tính axít nhẹ chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh trưởng tổng hợp CoQ10 tốt so với môi trường kiềm Chủng sinh trưởng sản xuất CoQ10 tốt pH (với nồng độ CoQ10 thu là7,23 mg/L, OD600 = 7,52); pH cho hàm lượng CoQ10 6,69 mg/L, OD600 đạt 7,04; điều kiện pH mơi trường ban đầu chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh trưởng tổng hợp CoQ10 (hàm lượng CoQ10 4,18 mg/L, sau 96 nuôi OD600 = 6,34) Như vậy, chủng tái tổ hợp A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh trưởng tổng hợp CoQ10 tốt điều kiện pH = 57 KẾT LUẬN Tách thành công DNA tổng số từ A tumefaciens EHA khuếch đại đoạn gen dps mã hóa Decaprenyl Diphosphate Synthase từ Agrobacterium tumefaciens EHA Xác định trình tự gen dps nguồn gốc từ Agrobacterium tumefaciens bao gồm 1077 bp, mã hóa cho protein có 358 axit amin Tách dịng thành cơng gen dps từ A tumefaciens EHA cấu trúc biểu pCAM-pds Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens EHA mang cấu trúc biểu pCAM-dps Chủng tái tổ hợp biểu khả tổng hợp CoQ10 cao gấp 1,6 lần so với chủng gốc A tumefaciens EHA Khảo sát chọn số điều kiện thích hợp chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10: Nhiệt độ 30oC, pH môi trường 7, môi trường THQ10 bao gồm thành phần (g/100 mL): Sucrose: 5; Peptone: 2; Cao nấm men: 2,5; NaCl: 0,75; MgSO4.7H2O: 0,025 58 KIẾN NGHỊ Khảo sát thêm điều kiện nhân nuôi chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp để thu lượng CoQ10 cao nhất: bổ sung thành phần môi trường, tốc độ lắc, dải nhiệt độ,… Thực nghiên cứu tối ưu hóa q trình tách chiết, tinh CoQ10 hồn thiện sản phẩm để đưa CoQ10 vào ứng dụng thực tế 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Đ Th Lương, Tr Th L Quyên (2009), Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm phân loại chủng nấm men sinh coenzyme Q10 phân lập Việt nam, Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học, Số 5- 2009:8-14 Tr Th L Quyên, Đ Th Lương (2010), Phân loại nghiên cứu điều kiện ni thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp CoQ10 chủng nấm men PL5-2, Di truyền học ứng dụng-Chuyên san Công nghệ sinh học, Số 6-2010:7-13 K H Thanh (2006), Kỹ thuật gen- Nguyên lý Ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà nội, tr 170-171, 178 Tài liệu Tiếng Anh: Adarsh K , Harharpreet K., Pushpa D., Varun M (2009), Role of coenzyme Q10 (CoQ10) in cardiac disease, hypertension and Meniere-like syndrome, Pharma cology & Therapeutics 124 (2009) 259 –268 Barker JL, Frost JW (2001), Microbial synthesis of p-hydroxybenzoic acid from glucose, Biotechnol Bioeng 76:376 –390 Bing Ch., Qi-peng Y., Xin-xiao S Wen-jin L (2008), Enhanced Production of Coenzyme Q10 by Overexpressing HMG-CoA Reductase and Induction with Arachidonic Acid in Schizosaccharomyces pombe, Appl Biochem Biotechnol (2010) 160:523–531 Catarina M Q., Salvatore D., Michio H (2007), Human Coenzyme Q10 Deficiency, Neurochem Res (2007) 32:723–727 Catherine E C (2000), New advances in coenzyme Q biosynthesis, Protopiasma (2000) 213:134-147 Choi J., Ryu Y., Park Y., Seo J (2009), Synergistic effects of chromosomal ispB deletion and dxs overexpression on coenzyme Q 10 production in recombinant Escherichia coli expressing Agrobacterium tumefaciens dps gene, J Biotechnol 144(1):64 – 69 60 10 Corinne P C., Adam M B Vincent J J M (2007), Current prospects for the production of coenzyme Q10 in microbes, TRENDS in Biotechnology Vol.25 No.11 11 Corpet F (1988), Multiple sequence alignment with hierarchical clustering, Nucl Acids Res., 16 (22): 10881-10890 12 Daves G D Jr., Muraca R F., Whittick J.S., Friis P., Folkers K (1967), Discovery of ubiquinones-1,-2,-3, and -4 and the nature of biosynthetic isoprenylation, Biochemistry 6:2861 – 2866 13 Dawei Z., Binaya S., Zhaopeng L., Tianwei T (2007), Ubiquinone-10 Production Using Agrobacterium tumefaciens dps Gene in Escherichia coli by Coexpression System, MOLECULAR BIOTECHNOLOGY (35), 2007 14 Dawei Z., Zheng L., Fenghuan W., Binaya S., Pingfang T., Tianwei T (2007), Expression of various genes to enhance ubiquinone metabolic pathway in Agrobacterium tumefaciens, Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 772–779 15 E L Crane (2000), New functions for coenzyme Q, Protoplasma (2000) 213:127-133 16 Elliot R., Inger M N., Thomas M F., Karl F (1968), Determination and levels of coenzyme Q10 in human blood, Analytical Biochemistry 23, 132140 17 Gi-Sub C., Yong-Sung K., Jin-Ho S., Yeon-Woo R (2005), Restricted electron flux increases coenzyme Q10 production in Agrobacterium tumefaciens ATCC4452, Process Biochemistry 40 (2005) 3225–3229 18 Gu S.B., Yao J.M., Yuan Q.P., Xue P.J., Zheng Z.M., Wang L., Yu Z.L (2006), A novel approach for improving the productivity of ubiquinone-10 producing strain by low-energy ion beam irradiation, Appl Microbiol Biotechnol 72:456 – 461 19 Hossein S Z., Sang H Y., Jay D K., Si H L., Seon W K., Sung C Y., Yong C S (2006), Coenzyme Q 10 production in recombinant Escherichia coli 61 strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway, Metabolic Engineering (2006) 406 – 416 20 Jin-Ho C., Yeon-Woo R., Yong-Cheol P., Jin-Ho S (2009), Synergistic effects of chromosomal ispB deletion and dxs overexpression on coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli expressing Agrobacterium tumefaciens dps gene, Journal of Biotechnology 144 (2009) 64–69 21 Kim S.J., Kim M.D., Choi J.H., Kim S.Y., Ryu Y.W., Seo J.H (2006), Amplification of 1-deoxy-D-xyluose 5-phosphate (DXP) synthase level increases coenzyme Q10 production in recombinant Escherihia coli, Appl Microbiol Biotechnol 72:982 – 985 22 Lee J.K., Her G., Kim S.Y., Seo J.H (2004), Cloning and functional expression of the dps gene encoding decaprenyl synthase from Agrobacterium tumefaciens, Biotechnol Progdiphosphate 20:51– 56 23 Lee J.K., Oh D.K., Kim S.Y (2007), Cloning and characterization of the dxs gene, encoding 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase from Agrobacterium tumefaciens, and its overexpression in Agrobacterium tumefaciens, J Biotechnol 128:555 –566 24 Marimuthu J., Hee- Jung M., Jeong-Lim L., In-Won K Jung-Kul L (2010), Current state of coenzyme Q 10 production and its applications, Appl Microbiol Biotechnol (2010) 85:1653– 1663 25 Matsuda H., Kawamukai M., Yajima K., Ikenaka Y (2003), Process for producing coenzyme Q 10, Patent EP 354 957 A 26 Okada K., Kainou T., Tanaka K., Nakagawa T., Matsuda H., Kawamukai M (1998), Molecular cloning and mutational analysis of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Gluconobacter suboxydans, Eur J Biochem 255:52 – 59 27 Okada K., Suzuki K., Kamiya Y., Zhu X., Fujisaki S., Nishimura Y., Nishino T., Nakagawa T., Kawamukai M., Matsuda H (1996), Polyprenyl 62 diphosphate synthase essentially defines the length of the side chain of ubiquinone, Biochim Biophys Acta 1302:217–223 28 Park Y.C., Kim S.J., Choi J.H., Lee W.H., Park K.M., Kawamukai M., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans, Appl Microbiol Biotechnol 67:192 –196 29 Prafull R., Alka M., Saji G (2011), Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii -ATCC20490 for biotechnological production of Coenzyme Q10, International Journal of Chemical Engineering and Applications, Vol 2, No 3, June 2011 30 Richard G B (2011), High degree of efficacy in the treatment of cyclic vomiting syndrome with combined co-enzyme Q10, L-carnitine and amitriptyline, a case series, Boles BMC Neurology 2011, 11:102 31 S Suzuki, Y Hinokio, M Ohtomo, M Hirai, A Hirai, M Chiba, S Kasuga, Y Satoh, H Akai, T Toyota (1998), The effects of coenzyme Q10 treatment on maternally inherited diabetes mellitus and deafness, and mitochondrial DNA 3243 (A to G) mutation, Diabetologia (1998) 41: 584±588 32 Sakato K., Tanaka H., Shibata S., Kuratsu Y (1992), Agitation –aeration studies on coenzyme Q10 production using Rhodopseudomonas spheroides, Biotechnol Appl Biochem 16:19 –22 33 Suk-Jin H., Sang-Yong K., Jin-Ho S., Hee- Jung M., Kyoung-Mi L., Jung-Kul L (2007), Controlling the sucrose concentration increases Coenzyme Q10 production in fed-batch culture of Agrobacterium tumefaciens, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:109 –11 34 Suk-Jin H., Sang-Yong K., Jin-Ho S., Deok-Kun O., Jung-Kul L (2007), Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q 10 production by Agrobacterium tumefaciens, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:974– 980 63 35 Suk-Jin H., Sang-Yong K., Jin-Ho S., Won-Il S., Hee-Jung M., Jung-Kul L (2008), Lactate increases coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens, World J Microbiol Biotechnol (2008) 24:887–890 36 Suzuki K., Okada K., Kamiya Y., Zhu X.F., Nakagawa T., Kawamukai M., Matsuda H (1997), Analysis of the decapreny l diphosphate synthase (dps) gene in fission yeast suggests a role of ubiquinone as an antioxidant, J Biochem 121:496– 505 37 Takahashi S., Nishino T., Koyama T (2003), Isolation and expression of Paracoccus denitrificans decaprenyl diphosphate synthase gene for production of ubiquinone-10 in Escherichia coli, Biochem Eng J 16:183 – 190 38 Xinyi L., Haizhen W., Jiang Y., Qinsheng Y., Huizhan Z (2006), Cloning and characterization of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter capsulatus B10, Can J Microbiol Vol 52, 2006 39 Yoon S.H., Kim J.E., Lee S.H., Park H.M., Choi M.S., Kim J.Y., Lee S.H., Shin Y.C., Keasling J.D., Kim S.W (2007), Engineering the lycopene synthetic pathway in E coli by comparison of the carotenoid genes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis, Appl Microbiol Biotechnol 74:131 –139 40 Yoon S.H., Lee Y.M., Kim J.E., Lee S.H., Lee J.H., Kim J.Y., Shin Y.C., Keasling J.D., Kim S.W (2006), Enhanced lycopene production in Escherichia coli engineered to synthes ize isopentenyl diphos-phate and dimethylallyl diphosphate from mevalonate, Biotech-nol Bioeng 94:1025– 1032 41 Yoshida H., Kotani Y., Ochiai K., Araki K (1998), Production of ubiquinone10 using bacteria, J Gen Appl Microbiol 44:19– 26 42 Yuting T., Tianli Y., Jinjin P., Yahong Y., Juhai L Y Martin Lo (2010), Effects of Cell Lysis Treatments on the Yield of Coenzyme Q 10 Following 64 Agrobacterium tumefaciens Fermentation, Food Sci Tech Int 2010;16(2):0195–9 43 Zahiri H.S., Yoon S.H., Keasling J.D., Lee S.H., Won Kim S., Yoon S.C., Shin Y.C (2006 ) Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway, Metab Eng 8:406– 416 44 Zhu X., Yuasa M., Okada K., Suzuki K., Nakagawa T., Kawamukai M., Matsuda H (1995), Production of ubiquinone in Escherichia coli by expression of various genes responsible for ubiquinone biosynthesis, J Ferment Bioeng 79:493 – 495 65 ... nghiên cứu: - Tách DNA tổng số từ A tumefaciens EHA - Phân lập gen dps mã hóa decaprenyl diphosphate synthase từ A tumefaciens EHA - Tách dòng gen dps vào vector biểu - Tạo chủng A tumefaciens. .. cứu tách dịng gen dps biểu chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang plasmid chứa gen dps sinh tổng hợp CoQ10 Gen dps tách dịng thành cơng từ A tumefaciens mã hóa cho decaprenyl diphosphate synthase vào... tài: ? ?Tách dòng biểu gen dps mã hóa Decaprenyl Diphosphate Synthase từ Agrobacterium tumefaciens? ?? phục vụ phát triển chủng A tumefaciens tái tổ hợp cho sản xuất CoQ10, với mục tiêu sau: - Tách