Theo dõi hàm lượng oxy trans resveratrol và moracin m trong cây dâu tằm (morus alba l moraceae) theo bộ phận và mùa thu hái bằng phương pháp uplc pda

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG THEO DÕI HÀM LƯỢNG OXY-TRANS-RESVERATROL VÀ MORACIN M TRONG CÂY DÂU TẰM (Morus alba L Moraceae) THEO BỘ PHẬN VÀ MÙA THU HÁI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-PDA Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Huỳnh ngọc Thụy Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG THEO DÕI HÀM LƯỢNG OXY-TRANS-RESVERATROL VÀ MORACIN M TRONG CÂY DÂU TẰM (Morus alba L Moraceae) THEO BỘ PHẬN VÀ MÙA THU HÁI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-PDA Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 NGHIỆM THU ĐỀ TÀI 2018 “Theo dõi hàm lượng Oxy-trans-resveratrol Moracin M Dâu tằm (Morus alba L Moraceae) theo phận mùa thu hái phương pháp UPLC-PDA” Phan Bảo Xuyên, Huỳnh Ngọc Thụy Cây Dâu tằm (Morus alba L.) khẳng định có tiềm phát triển lớn lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm thực phẩm chức Trong đó, Oxy-transresveratrol (MA-4) Moracin M (MA-1) hai chất có nhiều tác dụng dược lý quan trọng nghiên cứu nhiều Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Thân, rễ Dâu tằm thu hái tỉnh: Huế, Bình Định, Lâm Đồng, Đăk Lăk, Long An, Bến Tre, Sóc Trăng, An Giang vào tháng: 12/2016, 3/2017 06/2017 Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng quy trình định lượng phương pháp UPLC-PDA Đánh giá quy trình định lượng theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của ICH Ứng dụng quy trình đánh giá hàm lượng MA-4 MA-1 thân rễ của Dâu tằm thu hái số tỉnh của Việt Nam Kết − Thu thập tổng cộng 72 mẫu thân, rễ của Dâu tằm Kết cho thấy quy trình đạt yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn của ICH với khoảng tuyến tính của MA-4 MA-1 1-250 µg/ml 1-250 µg/ml; độ hồi phục 99,80-104,35% với RSD 0,69-1,80% 101,79104,17% với RSD 2,51-3,50%; giới hạn phát hiện giới hạn định lượng của MA4 500 ng/ml 1000 ng/ml, của MA-1 50 ng/ml 200 ng/ml Kết cho thấy hàm lượng MA-4 MA-1 thay đổi tỉnh, thân rễ, tháng thu hái Trong đó, tháng năm, hàm lượng hoạt chất có thân thay đổi nhiều cịn rễ thay đổi Hàm lượng MA-4 có rễ Bịnh Định cao Hàm lượng MA-1 có rễ Huế cao Lá khơng có MA4 MA1 “Subscribe content of Oxy-trans-resveratrol and Moracin-M in Mulberry trees (Morus alba L Moraceae) seasonal collection by UPLC-PDA method " Phan Bao Xuyen, Huynh Ngoc Thuy Introduction Morus alba L tree was confirmed having large potential in the field of pharmaceuticals, cosmetics and functional foods In particular, Oxy-trans-resveratrol (MA-4) and Moracin M (MA-1) are two substances, which have important pharmacological effects and have been studied very much Materials and research method Materials: Morus alba L.’s stems and roots were collected in: Soc Trang, Ben Tre, An Giang, Bình Định, Long An, Lam Dong, Đăk Lăk, Hue provinces in December, April and May 2016 Research method: Oxy-trans-resveratrol (MA-4) and Moracin M (MA-1) were isolated from Morus alba L by Pharmacology department Evaluate quantification based on the analysis process under guidance of the ICH Apply process to assess MA-4 and MA-1 contents in the Morus alba L.’s stems and roots what were collected in several provinces of Vietnam Results − 72 samples of Morus alba L.’s stems, roots and leaf were collected Results show that the process has achieved the evaluated requirements based on the guidance of ICH: the linear range of MA-4 and MA-1 are 1-250 µg/ml and 1-250 µg/ml, respectively; Recovery level are 99,80-104,35% with RSD 0,69-1,80% and 101,79-104,17% with RSD 2,51-3,50%: 2,05-2,35%, respectively; limit of detection and limit of quantification of MA-4 are 500 ng/ml and 1000 ng/ml, the ones of MA1 are 50 ng/ml and 200 ng/ml Results showed that the concentration of MA-4 and MA-1 have changed between provinces, between stems and roots and between seasons of collection In particular, between the months of year, the change of MA-4 and MA-1 in the stem is more than in the root The concentration of MA-4 and MA-1 are the most in the stem and roots in Binh Dinh and the least in stems in Hue MỤC LỤC CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thực vật 2.1.1 Họ Dâu tằm (Moraceae) 2.1.2 Chi Morus 2.1.3 Đặc điểm thực vật học loài Morus alba L 2.2 Thành phần hóa học .8 2.3 Tác dụng dược lý 10 2.3.1 Tác dụng dược lý theo y học cồ truyền: 10 2.3.2 Tác dụng dược lý theo y học hiện đại: 11 2.4 Một số nghiên cứu phân tích dâu tằm 23 2.4.1 Phân tích thành phần chức cành Dâu Tằm (Morus alba L.) theo giống khác nhau, vùng trồng trình chế biến 23 2.4.2 Các tác dụng chống oxy hoá và hàm lượng polyphenol của chiết xuất Morus alba thu thập từ vùng khác 23 2.4.3 Theo dõi hàm lượng Oxy- Trans-Resveratrol Moracin M dâu tằm (Morus alba L Moraceae) theo mùa phương pháp UPLC_PDA” .24 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 3.1 Đối tượng nghiên cứu 25 3.1.1 Nguyên liệu .25 3.1.2 Dung môi 26 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 26 3.1.4 Thiết bị nghiên cứu 26 3.1.5 Thiết bị sắc ký 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu .27 3.2.1 Xây dựng quy trình định lượng 27 3.2.2 Đánh giá quy trình định lượng theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của ICH 28 3.2.3 Đánh giá hàm lượng MA-4 MA-1 thân rễ của Dâu tằm thu hái số tỉnh của Việt Nam 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 i 4.1 Kết khảo sát xây dựng quy trình định lượng: .32 4.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 32 4.1.2 Quy trình chuẩn bị mẫu: 40 4.2 Đánh giá quy trình định lượng theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của ICH 43 4.2.1 Tính tương thích hệ thống 43 4.2.2 Tính tuyến tính 45 4.2.3 Độ đặc hiệu 48 4.2.4 Độ lặp lại 48 4.2.5 Độ .49 4.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 51 4.3 Ứng dụng qui trình xây dựng để đánh giá hàm lượng MA-4 MA-1 thân rễ của Dâu tằm thu hái số tỉnh của Việt Nam 51 4.3.1 Hàm lượng MA-4 phận theo mùa khu vực .52 4.3.2 Hàm lượng MA-1 phận theo mùa khu vực 55 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .60 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị .61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 68 DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Thành phần hóa học của dâu tằm[5], [9], [40], [41] Bảng 3.2 Nồng độ giai mẫu chất đối chiếu 29 Bảng 4.3 Điều kiện khảo sát pha động f .36 Bảng 4.4 Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử 40 Bảng 4.5 Tóm tắt kết khảo sát tính tương thích hệ thống MA-4 MA-1 44 Bảng 4.6 Mối tương quan nồng độ diện tích pic của MA-4 46 Bảng 4.7 Kết xử lý thống kê 46 Bảng 4.8 Kết khảo sát độ lặp lại .49 Bảng 4.9 Kết khảo sát độ của MA-4 49 Bảng 4.10 Kết khảo sát độ của MA-1 50 Bảng 4.11 Kết khảo sát của LOD LOQ chuẩn MA-4 MA-1 51 Bảng 4.12 Hàm lượng MA-4 có dược liệu Dâu tằm .52 Bảng 4.13 Hàm lượng MA-1 có dược liệu Dâu tằm .55 DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Các phận của Dâu tằm[6] Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của số chất có Dâu tằm Hình 4.3 Chương trình rửa giải sắc kí đồ khảo sát a 33 Hình 4.4 Chương trình rửa giải sắc kí đồ khảo sát b 34 Hình 4.5 Chương trình rửa giải sắc kí đồ khảo sát c 34 Hình 4.6 Chương trình rửa giải sắc kí đồ khảo sát d 35 Hình 4.7 Chương trình rửa giải sắc kí đồ khảo sát e 36 Hình 4.8 Chương trình rửa giải sắc kí đồ khảo sát f .37 Hình 4.9 Phổ UV của chất đối chiếu MA-4 MA-1 377 Hình 4.10 SKĐ mẫu thử quan sát bước sóng 215 nm, 254 nm, 310 nm, 360 nm 38 Hình 4.11 Kết khảo sát tốc độ dịng .39 Hình 4.12 Kết khảo sát nhiệt độ cột .39 Hình 4.13 SKĐ của mẫu thử với chương trình rửa giải chọn 41 Hình 4.14 Phổ 3D của mẫu thử với chương trình chọn 41 Hình 4.15 Phổ UV và độ tinh khiết pic cần định lượng 42 Hình 4.16 Phổ UV của chất đối chiếu MA-4 MA-1 42 Hình 4.17 SKĐ Tương thích hệ thống góc nhìn 60ο 44 Hình 4.18 SKĐ Tính tuyến tính của MA-4 .45 Hình 4.19 SKĐ tính tuyến tính của MA-1 45 Hình 4.20 Đường tuyến tính của MA-4 MA-1 47 Hình 4.21 Kết khảo sát độ đặc hiệu .48 Hình 4.22 SKĐ khảo sát độ lặp lại .49 Hình 4.23 SKĐ (LOD), (LOQ) của MA-4 MA-1 .51 Hình 4.24 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-4 thân tháng 12/2016; 3, 6/ 2017 tỉnh .52 Hình 4.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-4 có rễ tháng 12/2016; 3, 6/2017 tỉnh 53 Hình 4.26 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-4 thân rễ tháng 12 năm 2016 tỉnh 54 Hình 4.27 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-4 thân rễ tháng năm 2017 tỉnh 54 Hình 4.28 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-4 thân rễ tháng năm 2017 tỉnh 55 i Hình 4.29 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-1 thân tháng 12/2016; 3, 6/ 2017 tỉnh 56 Hình 4.30 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-1 rễ tháng 12/2016; 3, 6/ 2017, tỉnh 56 Hình 4.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-1 thân rễ tháng 12 năm 2016 tỉnh 57 Hình 4.32 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-1 thân rễ tháng năm 2017 tỉnh 57 Hình 4.33 Biểu đồ so sánh hàm lượng MA-4 thân rễ tháng năm 2017 tỉnh 58 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MA-4 Oxy-trans-resveratrol MA-1 Moracin M SKĐ Sắc ký đồ HPLC High Performance Liquid Chromatography UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography MeOH Methanol EtOH Ethanol TB Trung Bình SD Standard deviation RSD Relative standard deviation ST Sóc Trăng BT Bến Tre AG An Giang ĐL Đăk Lăk LĐ Lâm Đồng BĐ Bình Định LA Long An H Huế Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 Phụ lục Định lượng tháng 12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 Phụ lục Định lượng thân tháng 12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 Phụ lục Định lượng rễ tháng 12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 87 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 88 Phụ lục 10 Định lượng tháng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 89 Phụ lục 11 Định lượng rễ tháng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 90 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 91 Phụ lục 12 Định lượng thân tháng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 92 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 93 Phụ lục 13 Định lượng tháng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 94 Phụ lục 14 Định lượng rễ tháng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 95 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 96 Phụ lục 15 Định lượng thân tháng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 97 XÁC NHẬN Khóa luận tốt nghiệp chỉnh sửa theo yêu cầu của Hội đồng chấm khóa luận GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Ngày18 tháng năm 2017 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ... 2018 ? ?Theo dõi ha? ?m l? ?ợng Oxy- trans- resveratrol Moracin M Dâu t? ?m (Morus alba L Moraceae) theo phận m? ?a thu hái phương pháp UPLC- PDA? ?? Phan Bảo Xuyên, Huỳnh Ngọc Thu? ?y Cây Dâu t? ?m (Morus alba L. )... định l? ?ợng đồng thời Oxy- trans- resveratrol Moracin M Dâu t? ?m (Morus alba L. ) phương pháp UPLC- PDA − Ứng dụng quy trình để đánh giá ha? ?m l? ?ợng Oxy- trans- resveratrol Moracin M Dâu t? ?m theo m? ?a thu. .. chống oxy hoá và ha? ?m l? ?ợng polyphenol của chiết xuất Morus alba thu thập từ vùng khác 23 2.4.3 Theo dõi ha? ?m l? ?ợng Oxy- Trans- Resveratrol Moracin M dâu t? ?m (Morus alba L Moraceae) theo m? ?a