Bài 1: SẢN XUẤT RƯỢU VANG Bài 2: Bài 1: SẢN XUẤT RƯỢU VANG Bài 2: ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ bài 3: THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA bài 3: THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO THỰC HÀNH GVHD: SVTH: TP HCM 01/2020 BÀI SẢN XUẤT RƯỢU VANG 1.1 CƠ SỞ LÍ THUYẾT 1.1.1 Tổng quan rượu rượu nho Rượu vang (từ tiếng Pháp vin) loại thức uống có cồn lên men từ nho Rượu vang đỏ thường lên men từ nước ép vỏ nho, rượu vang trắng lên men từ nước nho Nước từ hoa khác lên men tạo thành rượu, theo luật nhiều nước, từ “rượu vang” cho mục đích thương mại sử dụng cho rượu lên men từ nho loại rượu sản xuất theo quy trình rượu vang goi rượu trái Tại thị trường Việt Nam thường gọi rượu vang trái Rượu vang thu khơng qua chưng cất có hương vị thơm ngon tự nhiên, loại nước uống giàu chất dinh dưỡng Rượu vang có thành phần phức, đến nước có sản xuất rượu vang lâu đời chưa biết hết thành phần cấu tạo rượu vang Thành phần chủ yếu rượu vang : o Cồn ethanol : thành phần quan trọng rượu vang o Đường (62-132g/l) : chủ yếu fructose,glucose galactose Tùy loại đường khử lại rượu vang sau lên men xong mà người ta phân biệt loại: − Rượu vang khô (dưới 10g đường/l) − Rượu vang nửa khô ( 20-30g đường/l) − Rượu vang nửa ( 45g đường/l) − Rượu vang (80-110g đường/l) Lượng đường khử cao lượng cồn phải cao để cân đối độ cồn độ o Các acid vô acid hữu : độ pH rượu vang từ 2.9-3.9 o Các loại muối : có hàm lượng thấp, chất muối rượu vang giữ vai trò quan trọng o Vitamin loại : vitamin rượu vang gồm B1, B2, B6, PP Biotin, B12, acid pantothenic o Chất màu, hương vị : chất màu trích từ nguyên liệu vào sản phẩm Còn hương vị rượu phụ thuộc vào ngun liệu q trình chuyển hóa sản phẩm sinh Ngoài rượu vang cịn có thành phần rượu bậc cao, quan trọng acetaldehyde, este, hợp chất polyphenol Hợp chất polypheno có nhiều vỏ Do rượu vang giàu polyphenol vang trắng nên tốt cho sức khỏe 1.1.2 Cơ chế lên men rượu Q trình lên men rượu q trình chuyển hóa đường thành rượu ethylic CO nhờ số vi sinh vậtt điều kiện kỵ khí, nấm men Saccharomyces ccerevisae đối tượng có khả lên men rượu mạnh ứng dụng nhiều công nghiệp sản xuất rượu bia Nấm mốc vi khuẩn có khả lên men rượu cho suất thấp nên không sử dụng sản xuất Lên men rượu vang lên men đường có nho (trái cây) nấm men Saccharomyces ccerevisae, loại nấm men thực Quá trình chuyển hóa đường thành rượu thực qua chuỗi phản ứng phức tạp liên quan mật thiết đến q trình phosphoryl hóa hợp chất hữu Phương trình chuyển hóa đường thành rượu tổng qt: C6H12O6 + 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Đường chất dinh dưỡng khác môi trường lên men, hấp thụ bề mặt tế bào nấm men, sau khuếch tán qua tế bào (màng bán thấm) vào bên tế bào nấm men Đường chuyển hóa theo chu trình đường phân Embden – Meyerhof – Parnas, qua hàng loạt sản phẩm trung gian để tạo thành acid pyruvic C6H12O6 glucose CH3COCOH Acid pyruvic Acid pyruvic điều kiện yếm khí, tác dụng enzyme pyruvat decacboxylase bị khử thành acetaldehyde CO Sau đó, acetaldehyde bị khử thành rượu ethylic tác dụng enzyme ancoldehydrogenase nấm men Rượu ethylic CO2 tạo thành thoát khỏi tế bào mà khuếch tán môi trường xung quanh CH3COOH CO2 + CH3CHO Acid pyruvic Acetaldehyd CH3CHO + NADH+ + H+ CH3CH2OH + NAD+ Acetaldehyd rượu ethylic Quá trình lên men rượu q trình hơ hấp yếm khí mơi trường acid (pH = – 5) Trong lên men rượu vang, ethanol CO sản phẩm tích tụ chiếm ưu thế, ngồi cịn nhiều sản phẩm phụ khác acid, ester, aldehyd rượu cao phân tử tạo nên hương vị đặc trưng cho rượu vang 1.1.3 Hệ vi sinh vật tham gia lên men rượu Nấm men Như trình bày, nấm men thành phần chủ đạo tham gia trình lên men rượu nói chung Tế bào nấm men có dạng hình ovan, sinh sản cách nảy chồi, hay tạo bào tử, sống kỵ khí khơng bắt buộc, có khả lên men loại đường khác Trong điều kiện hiếu khí, nấm men oxy hóa hồn toàn đường thành CO H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại điều kiện kỵ khí, nấm men khơng tăng sinh khơng tổng hợp sterol cần cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu lượng Các loại nấm men chủ yếu gồm: S cerevvvisiae S elipsoideus S paradoxuc S lactis Nấm mốc Nấm mốc thành phần thường xuất nguyên liệu lên men từ nguồn giàu tinh bột sắn, ngô, khoai, gạo Nấm mốc có vai trị phân giải tinh bột thành đường, sau từ đường nấm men lên men thành rượu Nấm mốc đối tượng phải giàu enzyme phân hủy tinh bột amylase Các lọai thường dùng sản xuất gồm: Aspergillus oryzae: mốc vàng Asp awamori: mốc xám đen Asp usami: mốc xám trắng Asp niger Asp flavus Rhizopus delamar Mucor rousii Vi khuẩn Tuy nấm men đối tượng lên men vi khuẩn có vai trị khơng sản xuất rượu nói chung Vi khuẩn lactic dùng sản xuất rượu cơng nghiệp để tạo pH thích hợp cho lên men tạo hương cho rượu 1.2 NỘI DUNG THỰC HÀNH 1.2.1 Quy trình sản xuất rượu vang trái cây: Nguyên liệu Làm Làm dập/Ép Men giống Pha chế Nhân giống cấp Khử trùng Nhân giống cấp Lên men Trái hư, cuống Bã, hột SO2 Lên men phụ Tách cặn Tàng trữ Phối chế Đóng chai Sản phẩm cặn nấm men Giải thích quy trình cơng nghệ Xử lí nguyên liệu Ở độ chín trái có độ đường cao, hàm lượng vitamin cao, hàm lượng polyphenol thấp, có màu sắc hương vị tốt so với trái có độ chín Trái chọn lựa, bỏ trái dập, thối, phẩm chất Làm để loại bụi bẩn, vi sinh vật dư lượng thuốc trừ sâu Sau đó, với nho sơ ri loại cuống Trái cắt nhỏ, nghiền nhỏ, nghiền nát, tránh làm nát hạt Pha chế dịch lên men Pha lỗng dịch với nước khơng phải áp dụng loại Đối với nho, ta không cần bổ sung, sơri, xồi, mận, mơ,… phải thêm nước từ 20-30% Dịch trái thường thiếu đường, không đủ chất để nấm men lên men tạo độ cồn cần thiết Do đó, chúng tơi sử dụng đường Saccharose bổ sung vào dịch lên men để điều chỉnh nồng độ chất khô 25 Bx Lượng đường cần thiết bổ sung lần: − Lần thứ I bổ sung 4/7 lượng đường cần bổ sung cho dịch ngày đầu lên men − Lần thứ II bổ sung 2/7 lượng đường cần bổ sung cho dịch sau ngày lên men − Lần thứ III bổ sung lượng đường lại cần bổ sung cho dịch vào ngày lên men thứ Dịch điều chỉnh pH CaCO acid citric…pH =3-3,5 tối ưu cho lên men rượu Nếu kiềm trình lên men khơng tạo rượu ethylic mà thay vào hàm lượng glycerol tăng cao Dịch trái có hàm lượng đạm thấp, để tăng lượng nitơ cần thiết cho nấm men sử dụng giai đoạn phát triển sinh khối, sử dụng NH 4Cl bổ sung vào hỗ dịch lên men với hàm lượng 0,2-0,4g/l Bổ sung Na2S2O5 với tỷ lệ 0,16g/l NaHSO3 với tỷ lệ 0,2-0,3g/l nhằm chống oxi hóa, hạn chế phát triển tiêu diệt vi sinh vật có hại cho q trình lên men Lên men Q trình lên men thực nhiệt độ phịng 28-30 0C Khơng nên cho dịch lên men q đầy bình, phải để trống phía khoảng 1/3-1/4 thể tích để đề phịng lên men sủi bọt mạnh, dịch trái không bị trào ngồi nhiễm vi sinh vật khơng mong muốn Cũng khơng nên chừa trống bình q nhiều, tạo mơi trường cung cấp oxi thừa, giảm hiệu suất lên men rượu nấm men Tránh để nhiệt độ thay đổi nhiều, nhiệt độ tăng cao làm nấm men ngừng hoạt động Men giống sau cấy, nhân giống qua cấp bổ sung với nồng độ ban đầu 20 triệu tb/ml Thời gian lên men khoảng tuần, trình lên men theo dõi tạo bọt, khơng đậy nắp q chặt tránh khí tạo nhiều làm bật nắp bình Khi kết thúc lên men tiến hành xác định thông số sau lên men gồm: hàm lượng chất không, pH độ acid, độ cồn rượu Lên men phụ, tàng trữ lọc Sau lên men chính, rượu tách cặn, chiết đầy chai, nút kín trữ 15-180C để ổn định chất lượng rượu Quá trình lên men phụ tàng trữ kéo dài tuần Trong thời gian này, cần tiến hành gạn lọc, để lắng, chiết chai vài lần để loại hết xác nấm men lắng đáy chai, lọc chân khơng (có thể bổ sung bột trợ lọc) để làm rượu nhanh 1.2.2 Kế hoạch thí nghiệm Buổi 1: Chuẩn bị: − Tính tốn pha chế mơi trường Hansen để giữ giống nhân giống, nhóm cần ống Hansen nghiêng, ống chứa 9ml Hansen lỏng 7oBx erlen chứa 45ml Hansen long 45ml dịch trái 12 oBx Lưu ý làm môi trường nhân giống cấp cần đo Bx dịch trái sau phối trộn với môi trường Hansen lỏng để tính tốn lượng đường bổ sung cho đạt 12oBx − Chuẩn bị ống chứa 2ml nước muối sinh lý, ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý bao gói pipet đầu típ để vơ trùng… − Cấy chuyền giữ giống từ ống giống sang ống thạch nghiêng − Nhân giống nấm men: Giống nấm men trước lên men cần nhân giống nhằm tăng sinh khối tăng hoạt lực giống Ở quy mơ phịng thí nghiệm, ta tiến hành nhân giống qua cấp Nhân giống cấp (trước buổi khoảng ngày): cho ml nước muối sinh lý vào ống giống thạch nghiêng, dùng que cấy hịa tồn giống vào nước muối, đổ nước vào ống nghiệm chứa mơi trường Hansen lỏng có nống độ đường 7oBx vô khuẩn 121oC 20 phút Nuôi máy lắc 18-24 Nhân giống cấp (trước buổi khoảng ngày): Sử dụng môi trường Hansen lỏng có bổ sung dịch trái (theo tỷ lệ 1:1) đa vô khuẩn nhằm giúp nấm men quen dần với môi trường dịch lên men Sinh khối nấm men sau nhân giống cấp cấy truyền theo tỷ lệ 1:10 sang môi trườn mới, nuôi máy lắc 18-24 Công thức: Môi trường Hansen để nuôi cấy nấm men Glucose 50 g Pepton 10 g KH2PO4 3g MgSO4 4g Agar 20 g Nước cất 1000 ml pH 6.0 Cách pha: Agar nấu tan, thêm Pepton hịa tan trước nước ấm Cho thêm thành phần lại vào, khuấy Đun sôi trở lại nhấc xuống, phân vào ống nghiệm để làm thạch đứng thạch nghiêng, gắn nút bông, khử trùng atm 15 phút (Môi trường Hansen lỏng khơng cho agar) Buổi 2: Sản xuất rượu vang trái − Kiểm tra chất lượng canh trường men giống (đã nhân giống ngày trước đó): đếm số tế bào nấm men/1ml canh trường, tỷ lệ sống chết, tỷ lệ chồi Hút 1ml dịch nhân giống, pha lỗng đến độ thích hợp, đếm buống đếm hồng cầu (Phụ lục 1) Tính tốn thể tích dịch nhân giống tương ứng với thể tích dịch lên men, dựa theo nguyên tắc men giống bổ sung với nồng độ ban đầu 20 triệu tb/ml − Xử lý nguyên liệu, pha chế dịch lên men Lưu ý, sau ổ sung giống kiểm tra độ Bx dịch lên men tính tốn lượng đường cần bổ sung − Thực hiên lên men bước Buổi 3: Kiểm tra sản phẩm − − − − Cảm quan: độ ngọt, vị chát, màu sắc, độ trong, múi thơm Định lượng độ cồn ethanol theo phương pháp bình tỷ trọng (phụ lúc 2, 3-1, 3-2) Định lượng đường khử theo phương pháp DNS (phụ lục 4) Tính tốn điều chỉnh lượng cồn cồng thực phẩm, đường cho sản phẩm cuối đạt độ cồn 12%v/v độ thích hợp KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM BÀI : SẢN XUẤT RƯỢU VANG - Pha hóa chất Hansen lỏng, rắn - Pha SPW - Pha 45ml Hansen lỏng + 45ml dịch nho vơ bình tam giác - Làm thạch nghiêng để cấy → Ủ → Nhân giống cấp → Nhân giống cấp - Pha lỗng từ bình tam giác sang SPW nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 - Quan sát mật độ nấm men kính hiển vi theo nồng độ pha - Đổ hết dung dịch từ bình tam giác qua hết thùng nho - Đo dịch mẫu ban đầu có độ Bx 13 - Tính tốn lượng đường 300g cho vô thùng nho để độ Bx 25 - Tính thể tích bình tam giác: 2.106 tb/ml → X 2.107 tb/ml → 2,4 lít Vậy X = 240ml BÀI : ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ 2.1 CƠ SỞ LÍ THUYẾT 2.1.1 Giới thiệu chung enzyme pectinase Enzyme pectinase enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester liên kết glucoside có mạch polymer pectin, sản phẩm trình acid galcturonic, galactose,arabinose,methanol,…Đây nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp đứng sau Amylase Protease Enzyme pectinase tự nhiên có thực vật, vi sinh vật Pectinase sản xuất chủ yếu nấm mốc Aspergillus sp, Botryis ,Fusarium moniliforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp , Neurospora crassa,… Ở thực vật, thủy phân pectin tự nhiên thường xảy trái chín Vì enzyme có vai trị quan trọng q trình chín tự nhiên trái hay q trình bảo quản trái rau Enzyme pectinase có vai trị quan trọng q trình bảo quản trái rau Nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme pectinase thường khoảng 45-550C, pH hoạt động thường khoảng 3,5-4 2.1.2 Ứng dụng pectinase công nghệ thực phẩm Pectinase thường sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang; - Sản xuất nước hoa nước uống khơng có cồn; - Sản xuất mặt hàng từ quả: nước cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,… - Sản xuất nước giải khát; - Sản xuất trà, cà phê cà phê hòa tan; - Xử lý tế bào thực vật để tạo tế bào trần Enzym pectinase ứng dụng nhiều chế biến thực phẩm, đặc biệt khả làm nước hoa Việc kiểm sốt enzyme pectinase kiểm sốt độ nhờn sản phẩm Trong sản xuất rượu vang, sản xuất nước nước uống khơng cồn, sử dụng pectinase hiệu Nhờ tác dụng pectinase mà trình ép, làm lọc dịch dễ dàng, làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền khối nghiềm có tình trạng thái keo, ép dịch khơng Nhờ pectinase phân giải chất pectin di mà dịch suốt không bị vẩn đục lọc dễ dàng Khơng vậy, enzym pectinase cịn góp phần chiết rút chất màu, tanin chất hòa tan nữa, làm tăng thêm chất lượng thành phần Ngoài pectinase ứng dụng nhiều lĩnh vực khác trích ly liệu, xử lý môi trường, chế biến thực ăn gia súc,… 2.2 Nội dung thí nghiệm Nguyên liệu Chọn, phân loại Rửa,(gọt vỏ), bỏ lõi, cắt miếng Ngâm Chần Nghiền Xử lý với enzyme Ép Lọc thô Gia nhiệt Lọc tinh Phối trộn Rót chai,ghép mí Thanh trùng Làm nguội Nước thơm Thuyết minh quy trình cơng nghệ: Ngun liệu: Là loại thơm có hình thức chất lượng tốt: trái thơm tươi mới, vừa tới nhiều nước, màu vàng đậm,, vị Gọt vỏ - bỏ lõi, cắt miếng: Gọt bỏ vỏ phần hư Rửa: Nhằm mục đích loại trừ tạp chất học đất cát, bụi bẩn, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật , chất bảo quản làm giảm lượng vi sinh Cắt miếng: Sau gọt vỏ thơm cắt thành miếng nhỏ mỏng khoảng 2-3cm để chuẩn bị cho công đoạn nghiền, ép nước qua tốt Chần: Nước gia nhiệt lên nhiệt độ khoảng 80-900C Thời gian gia nhiệt tuỳ thuộc vào loại quả, thơng thường khoảng 1-3 phút Mục đích làm mềm cấu trúc mơ giúp q trình nghiền diễn dễ dàng Ép: Ép phương pháp chủ yếu để tách dịch bào khỏi nguyên liệu nhằm thu dịch táo sau trình xử lý enzyme Sử dụng thiết bị ép chun dụng sau lọc lại khăn Lọc thơ có tác dụng loại bỏ bã táo lại sau ép Xử lý với enzyme: Đây công đoạn quan trọng giúp phá vỡ màng tế bào định phần lớn độ sản phẩm nước Dịch thơm bổ sung enzyme pectinase (khoảng 1-2%), gia nhiệt đến nhiệt độ (khoảng 40-450C) sau ủ khoảng thời gian thích hợp (khoảng – 4h) phụ thuộc vào độ tinh khiết enzyme hàm lượng sử dụng, nhiệt độ phản ứng biến đổi loại táo chọn Gia nhiệt: Nhằm mục đích vơ hoạt enzyme kết tủa protein, ổn định chất lượng nước sau Gia nhiệt dịch sau ép lên nhiệt độ 900C phút Lọc tinh: Với trợ giúp bột trợ lọc, q trình lọc tinh nhằm loại bỏ hồn tồn bã cịn sót lại hạt, mảnh nhỏ lơ lửng, kết tủa hình thành gia nhiệt để làm suốt dịch nước Ta cho vào khoảng 1% (W/W) chất trợ lọc so với thể tích dịch cần lọc, khuấy tiến hành lọc chân không thu nước Phối trộn: Đây khâu quan trọng định đến chất lượng hình thức sản phẩm Ở cơng đoạn nục đích làm tăng hương vị sản phẩm Dịch syrup nhóm nấu 27 độ brix - Cốc khơng có enzyme Nước dứa 11 độ brix (cho vào 350ml syrup 270brix) Tổng dịch syrup + nước dứa đạt 200Brix (có 650ml thu được) - Cốc có enzyme Nước dứa 11 độ brix (cho vào 500ml syrup 270brix) Tổng dịch syrup + nước dứa đạt 190Brix (có 800ml thu được) Rót chai – Ghép mí: Sử dụng chai thủy tinh suốt loại tốt cho phép dùng thực phẩm, ngăn cản tia xạ chịu nhiệt tốt Chai nắp xử lí qua cơng đoạn rửa Đây công đoạn quan trọng nhằm cách ly thực phẩm với môi trường không khí sinh vật bên ngồi, bảo quản chất lượng sản phẩm nước suốt trình sản xuất lưu hành thị trường Sau rót dịch nước vào chai cần khí trước ghép nắp Bài khí q trình đuổi bớt chất khí tồn chai nhằm: - Giảm áp suất bên chai đựng dung dịch nước trùng - Hạn chế q trình oxy hóa - Hạn chế phát triển vi sinh vật hiếu khí tồn đồ hộp sau trùng, Phạm vi PTN ta khí cách rót nóng thật nhanh đóng nắp chai Yêu cầu nắp chai phải gắn thật kĩ chắn, đảm bảo cho công đoạn trùng không bị bung nắp Thanh trùng – Làm nguội: Công đoạn quan trọng có tác dụng tiêu diệt ức chế hoạt động vi sinh vật có sản phẩm nhằm bảo quản chất lượng sản phẩm lưu hanh thị trường theo thời gian Thời gian nhiệt độ trùng là: Có thể trùng autoclave đun cách thủy nước Sau trùng sản phẩm mau chóng lấy khỏi thiết bị, làm nguội nhanh nước mát (chú ý từ từ tránh sốc nhiệt làm bể chai) Bảo ôn: Sau trùng sản phẩm bảo ơn vịng 1-2 tuần để khảo sát ổn định chất lượng sản phẩm KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM BÀI 2: ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ Nhận xét: - Đánh giá cảm quan với sản phẩm không bổ sung Enzym + Mùi: có mùi thơm nhẹ đặc trưng dịch nước dứa + Vị: chua êm nhẹ, dư vị không kéo dài + Màu sắc: màu vàng đục + Độ trong: có lắng cặn đục, độ khơng nhiều - Đánh giá cảm quan với sản phẩm có bổ sung Enzym + Mùi: có mùi thơm nồng đặc trưng dịch nước dứa + Vị: chua êm nhẹ, dư vị kéo dài không ngấy + Màu sắc: màu vàng + Độ trong: có cặn khơng đục, độ cao Kết luận: bổ sung Enzym làm tăng cảm quan sản phẩm, giúp sản phẩm ngon BÀI THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA 3.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT Cây dứa (Ananas comosus) thuộc họ đơn từ diệp, thuộc họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ Hiện nay, nước ta loại dứa đựợc trồng nhiều Ananas comosa dùng làm nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzyme sử dụng số lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm Phần thân sau thu hoạch làm giấy, lấy sợi làm phân bón Thành phần dứa: Trong dứa chín, nước chiếm đố, hàm lượng 80-86%, cacbonhydrat chiếm 10- 18% (trong saccharose 60 - 67% glucose fructose chiếm 30-40%), protein 2- 3%, axit hữu 0,1- 1.6 (axit citric chiếm 87% axit maleic chiếm 13%), tro 0.3%, sắc tố 0.03- 0,6% hợp chất phenolic (tạo màu) hợp chất tạo mùi, vitamin: A, B, C, enzyme bromelin Enzyme bromelin Đặc điểm Bromelin tên gọi chung nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả phân giải protein thu nhận từ dứa Bromelin chiếm 50% protein dứa, có khả thủy phân mạnh hoạt động tốt pH 6-8 Bromelain có hoạt tỉnh xúc tác phân giải protein tương tự papain mů đu đủ hay ficin thuộc họ Sung Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử lớn khoảng 33000 Da, lớn 1.5 lần so với papain Tính chất Bromelin Thành phần chủ yếu Bromelin có chứa nhóm sulfhydryl, dịch chiết Bromelin có chứa peroxidase, phosphatase acid chất cản protease Hiện người ta ghi nhận thân có chứa thành phần có hoạt tính thủy phân protein Dịch chiết Bromelin toàn phần hoạt động khoảng pH 4,5- 9,8 Bromelin chiết tách từ phận khác dứa có hoạt động sinh lý khác hoạt tính sinh lý giống nhau, Protein khơng ổn định với nhiệt độ trình chiết tách hay điều kiện bảo quản khơng thích hợp Bromelin thấm hoàn toàn qua dày ruột động vật Nồng độ cao máu tìm thấy sau ăn khả thủy phân protein bị bất hoạt nhanh chóng hoạt dong prtease nội sinh yếu tố α - - macroglobulin huyết Cấu tạo hóa học Bromelin Bromelin protease khác papain ficin glycoprotein, phân tử có hiđrocacbon gồm mannose, glucosamin, xylose fructose Sợi hidrocacbon liên kết hoán vị với sợi polypeptid Khi phân tích thành phần amino acid Bromelin thân Bromelin quà tùy theo phương pháp thu nhân mà thành phần axit amin khác Bromelin có thành phần amino axit thay đổi khoảng 321 - 144 Bromelin 283 - 161 amino axit Bromelin thân có sợi polipeptid có amino axit đâu amin valine đâu carbohydrate glicine, Bromelin có amino axit đâu alanine Tính chất vật lý Bromelin Hằng số sa lắng Hảng số khuếch tan Thể tích riêng phẩn Độ nhớt bên Tỷ số ma sát Điểm đẳng điện Sự hấp phụ Trọng lượng phân tử S D V [I] f/fo Pl 280nm 2.73 7,77x10-7cm2/s 0.743ml/g 0.039d1/g 1,26 9,55 20,1 33.200 (tính phương pháp sa lăng khuếch tán) 32.100 (tính từ hẳng số sa lăng độ nhớt bên trong) 35.500 (tính phương pháp Archibald) Hoat tính Bromelain Hoạt tính phân giải Bromelin có hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase Bromelin thân có nhiều chất tự nhiên phân giải chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp Ứng dụng Trong lĩnh vực thực phẩm Bromelain enzyme thủy phân giúp tiêu hóa nhanh chất protein Bromelin ly trích từ thơm dạng tinh khiết cung cấp cho thể từ loại thực phẩm có thêm thơm thực đơn nấu nướng Vì thơm đưa vào thực phẩm để làm mềm thịt Như protease khác, bromelin dùng nhiều cách: tẩm, ướp tiêm vào tĩnh mạch động vật trước giết mổ Bromelin giúp thủy phân nhanh quy trình sản xuất nước mắm (ở số vùng Phú Quốc, Phan Thiết, Nam Ô, Cần Thơ người ta hay dùng mít chín dứa chín thêm vào muối cá) Chồi ngọn, gọt vỏ, trái Giảm đau phủ nề sau phẫu thuật sau chấn thương: Bromelin ngăn chặn việc phóng thích prostaglandin ngun nhân gây sưng viêm Vì bromelin cịn dùng để chống bệnh viêm khớp, xoang mũi quanh hố mũi Làm Làm mau lành vết thương: Việc đấp lại chỗ bromelin làm gia tăng tiêu hủy mơ hoại tử Nghiền ép, xay nhuyễn Ngồi bromelin dùng để điều trị giảm đau nhức cơ, chống rối loạn tim mạch, sung huyết đường hô hấp, cải thiện việc tiêu hóa hấp thu số thuốc Bromelin dùng cho bệnh nhân bị rối loạn tiêu hóa Lọccắt bỏ tụy tạng thiếu enzyme tuyến tụy Bromelin tác động lên hệ miễn dịch, nên giúp gia tăng phịng chống Bã số bệnh hệ tự miễn yếu người lão hóa chống lại thành Ly tâm 6000 v/p, 10 phút lập khối u Các chế phẩm có bromelin dùng ngồi giúp mau lành vết thương dạng kem bơi da Cồn 98% < 4oC (NH4)SO4 Bã Tủa 4oC/1-2 Ly tâm 6000 v/p, 15 phút 3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM Thu tủa Sơ đồ Quy trình thu nhận enzyme Bromelin Sấy khô Bromelin Dịch Thuyết minh quy trình Lưu ý: tồn quy trình cần thực nhiệt độ tháp (nhúng ngập nước đá) Enzyme bromelin thu thân, phần thịt chồi Cân khoảng 100g thơm (Phế liệu dứa chồi, vỏ, thán, củi đứa thịt quả), đem rửa sạch, cắt nhỏ, xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã thu dịch lọc Sau đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút để loại bỏ chất xơ sót thu dịch chiết có chứa Bromelin, từ dịch chiết lấy vài ml de xác định hoạt tỉnh protease theo phương pháp Anson cải tiến Ghí nhận thể tích V, sau chia đơi thể tích V nước thơm vừa thu thành hai phần tiến hành tủa protein hai tác nhân túa khác Tủa Ethanol 98% Ethanol trước cần làm lạnh 4C, sau phối trộn với dịch dứa theo tỉ lệ 1:3 ( dứa: cồn) Chú ý cho cốc chứa dịch đứa ngâm thau nước đá, rót cồn từ tử dọc theo thành cốc, tránh khuấy đảo mạnh Khuấy nhẹ để cồn hòa với dịch enzyme Tủa muối (NH4)2SO4 Để có muối (NH4)2SO4 bão hòa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối 100 rnl nước thơm Sau để yên khoảng 30 phút nhiệt độ - 4°C để tùa hình thành Gạn thu tủa, lấy ta đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút 15 phút Thu tủa vừa ly tâm Đối với tác nhân tủa cồn cần làm bay nhanh chóng hết cồn Sấy khơ tủa 40°C có quạt thơng gió sấy đơng khơ để bảo quản đùng lâu dài Chế phẩm bromelin thô sau ly tâm không làm khổ cần bảo quân 4°C kiểm tra hoạt tính chế phẩm thu phương pháp Anson cải tiến So sánh hoạt tính tổng với dịch dứa ban đầu tính tốn hiệu suất thu hồi 3.3 KẾT QUẢ • Nhận xét lượng chế phẩm thu được: Qua kết thu được, ta thấy khối lượng chế phẩm thu từ muối nhiều so với chế phẩm thu từ phương pháp kết tủa cồn 98% • Giải thích kết quả: Lượng chế phẩm thu từ phương pháp tủa muối nhiều lương bromelin tạo thành có gắn tinh thể muối sunfat Còn chế phẩm thu từ phương pháp kết tủa cồn cồn chất dễ bay hơi, nên cồn bay khỏi sản phẩm, dẫn đến lượng kết tủa tạo thành • So sánh ưu nhược điểm tủa muối tủa cồn ethanol 98% Phương pháp thực Kết tủa (NH4)2SO4 Ưu điểm Lượng chế phẩm thu nhiều hơn.Chế phẩm tạo tan dễ Nhược điểm Tủa không lắng tốt Không tái sử dụng Kết tủa cồn 98% Kết kết tủa tốt so với tủa muối Thực đơn giản Có thể tái sử dụng Cồn chất dễ bay nên lượng dung môi cần sử dụng nhiều Chế phẩm tạo tan khó Phụ lục 5: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME BROMELIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN Nguyên tắc Phương pháp dựa thủy phân protein casein enzym Bromelin có dịch nghiên cứu, tiếp làm vơ hoạt enzyme kết tủa protein chưa bị thủy phân dung dịch acid trichloracetic Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng thủy phân phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosin để tính lượng sản phẩm enzyme xúc tác tạo nên Thực 2.1 Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin Hóa chất Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) Lượng Tyrosin tương ứng (µM) Dung dịch HCl 0.2N (ml) Dung dịch NaOH 0.5N (ml) Ống nghiệm 0.2 0.2 5.0 4.8 10 10 0.4 0.4 4.6 10 0.6 0.6 4.4 10 0.8 0.8 4.2 10 1.0 1.0 4.0 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 Lắc mạnh sau 10 phút đo OD bước sóng 650 nm 3 3 Ống số ống thử khơng (TK), ống cịn lại ống thí nghiệm (TN), vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan lượng Tyrosin OD 2.2 Các bước chuẩn bị mẫu enzyme để đo hoạt tính Dung dịch enzyme mẫu nước dứa mẫu chế phẩm enzyme pha loãng ( cân vài chục mg chế phẩm pha loãng khoảng 5ml, độ hấp thu không lọt vào đường chuẩn cần tính tốn lại độ pha lỗng) Lấy ống nghiệm sạch, khô, tiến hành ống thử thật, ống thử khơng Hóa chất Dung dịch Casein 1% (ml) Dung dịch TCA 5% (ml) Dung dịch enzyme mẫu (ml) Lắc giữ 35.5 oC 10 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 10 phút , lọc lấy dịch Ống nghiệm Thử thật Thử không 5 10 1 Lấy ống nghiệm khác cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử không Tiếp tục cho thêm vào ống 10ml NaOH 0.5N 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Tính OD=Odrr-Odtk sau dựa vào đồ thị chuẩn suy số µM Tyrosin 2.3 Tính kết Mẫu thử khơng 0.113 0.107 0.107 Mẫu thử thật 1.553 1.636 1.633 Nhận xét: Phương pháp tủa tác nhân gây tủa dung môi hữu (aceton, ethanol…): Độ hòa tan protein dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, số số điện mơi dung dịch Nhìn chung, phân tử dung mơi có số điện mơi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) ổn định tương tác chúng với phân tử protein tạo điều kiện thuận lợi cho hòa tan protein dung dịch Ngược lại, dung môi với số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản phân tán phân tử protein môi trường Do đó, độ hịa tan phân tử protein giảm xảy kết tủa làm giảm số điện môi hữu môi trường Điều có cách thêm dung mơi hịa tan nước aceton vào dung dịch chứa protein Sự tủa aceton ethanol (80%, 98% ) có nhiều thuận lợi tương đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế enzyme, nhiệt độ bay dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym phương pháp sấy nhẹ quạt gió Phương pháp tủa muối: Người ta dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein muối vừa làm trung hịa điện (do ion tác động tương hỗ với nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat phân tử protein Các protein khác bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, dùng muối để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng Dựa theo kết thí nghiệm ta thấy hiệu suất thu hồi enzyme muối có kết cao so với cồn Do tủa muối thu lượng chế phẩm cao nhiều so với tủa cồn Tủa muối, lương bromelin tạo thành có gắn tinh thể muối sunfat Còn chế phẩm thu từ phương pháp kết tủa cồn cồn chất dễ bay hơi, nên cồn bay khỏi sản phẩm, dẫn đến lượng kết tủa tạo thành ... không sử dụng sản xuất Lên men rượu vang lên men đường có nho (trái cây) nấm men Saccharomyces ccerevisae, loại nấm men thực Q trình chuyển hóa đường thành rượu thực qua chuỗi phản ứng phức tạp... galactose,arabinose,methanol,…Đây nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp ? ?ứng sau Amylase Protease Enzyme pectinase tự nhiên có thực vật, vi sinh vật Pectinase sản xuất chủ yếu nấm mốc Aspergillus... khoảng 45-550C, pH hoạt động thường khoảng 3,5-4 2.1.2 Ứng dụng pectinase công nghệ thực phẩm Pectinase thường sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang; - Sản xuất nước hoa