¾ Ñoái vôùi thí nghieäm nhaân protocorm söû duïng moâi tröôøng Knudson’C boå sung 2ppm BA vaø 0,5 ppm IAA, thì seõ taïo thaønh nhieàu choài môùi hôn, coù chieàu cao, vaø thích hôïp ch[r]
(1)Tài liệu bạn xem download từ website
WWW.AGRIVIET.COM WWW.MAUTHOIGIAN.ORG
»Agriviet.com website chuyên đề nông nghiệp nơi liên kết thành viên hoạt động lĩnh vực nông nghiệp, thường xuyên tổng hợp tài liệu tất lĩnh vực có liên quan đến nơng nghiệp để chia tất người Nếu tài liệu bạn cần khơng tìm thấy website xin vui lịng gửi yêu cầu ban biên tập website để cố gắng bổ sung thời gian sớm
»Chúng xin chân thành cám ơn bạn thành viên gửi tài liệu cho Thay lời cám ơn đến tác giả cách chia lại tài liệu mà bạn có người Bạn trực tiếp gửi tài liệu bạn lên website gửi cho theo địa email Webmaster@Agriviet.Com
Lưu ý: Mọi tài liệu, hình ảnh bạn download từ website thuộc quyền tác giả,
do chúng tơi khơng chịu trách nhiệm khía cạnh có liên quan đến nội dung tập tài liệu Xin vui lòng ghi rỏ nguồn gốc “Agriviet.Com” bạn phát hành lại thông tin từ website để tránh rắc rối sau
Một số tài liệu thành viên gửi cho không ghi rỏ nguồn gốc tác giả, số tài liệu có nội dung khơng xác so với tài liệu gốc, bạn tác giả tập tài liệu liên hệ với chúng tơi có u cầu sau :
• Xóa bỏ tất tài liệu bạn website Agriviet.com • Thêm thơng tin tác giả vào tài liệu
• Cập nhật nội dung tài liệu
(2)Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Mở đầu
PHẦN I: GIỚI THIỆU
Trong năm gần với sách mở rộng đầu tư mặt Nhà nước, đời sống vật chất tinh thần người dân ngày cải thiện nâng cao Song song với nhu cầu vật chất nhu cầu tinh thần đặc biệt thiếu Từ lâu người thích trồng hoa, cảnh vừa để trang trí cho đẹp, vừa để giải trí tinh thần Mỗi người thích trồng lồi hoa khác nhau, việc lựa chọn loài hoa thường tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu vùng đó, vẻ đẹp hoa, hoa trồng chăm sóc hay khơng Hoa lan nhiều người ưa thích, lẽ hoa lan có cấu trúc kiêu kì phức tạp, phận mơi có nét chạm trổ tinh vi, lại phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam, dễ chăm sóc người chọn loại hoa lan thích tuỳ theo túi tiền mà thoả mãn thú vui tao nhã
Phong lan nước ta phong phú đa dạng, có nhiều giống khác như:
Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng cho hoa
rất đẹp mang nhiều màu sắc khác Nó dùng để trang trí, trưng bày, làm đẹp, dùng buổi lễ… hay người ta bán hoa cắt cành-kinh doanh Trong số có lẽ Dendrobium giống đặc sắc từ màu sắc, dạng hoa giống loài Mặc khác, Dendrobium dễ trồng, siêng hoa lâu tàn Do ưa chuộng trồng phổ biến nước ta nhằm phục vụ cho nhu cầu sống
Các nhà trồng lan không ngừng tìm kiếm giống lan để thõa mãn hiếu kì đem bán Có hai cách để có giống lan Một là, sưu tập giống lan hoang dại rừng đem hóa, tạo điều kiện nhân tạo giống tự nhiên để lan hóa Phương pháp gặp nhiều rủi ro điều kiện môi trường không thuận lợi cho lan phát triển Hai là, tạo giống lan lai mới, lan lai mang đặc tính tốt vựơt trội bố mẹ, thỏa mãn nhu cầu người thưởng thức lan Tuy nhiên hai lan lai với đạt kết tạo trái cần phải kết hợp với phương pháp gieo hạt ống nghiệm để hạt lan nẩy mầm dễ dàng Có kiểm tra kết việc lai hai lan
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, phạm vi đề tài tiến hành nghiên cứu:
(3)PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I Giới thiệu họ lan: 1.1 Đặc điểm chung:
Các họ lan đánh giá loài hoa cao cấp vương quốc thảo mộc, bao gồm 25.000 ngàn loài khác nhau, với lồi khám phá mơ tả theo năm Do chúng phân bố vùng rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo Bắc cực, từ đồng vùng núi băng tuyết, loài lan khác biệt nhau: Lan đất (phát triển mọc đất kháng nước); thực vật biểu sinh thực vật phụ sinh (phát triển phía mặt đất sống bám loại thảo mộc khác, thu hút chất dinh dưỡng nước từ môi trường xung quanh); thực vật phát triển mặt đá mặt đất (phát triển bề mặt môi trường cấy trồng)
Những nhà sáng lập ngành Lan học đáng kể triết gia người Hy Lạp Theophrastus (372-287 trước Công nguyên) sau nhà thực vật học người Thụy Điển Linnaeus (1707-1778) Chính Theophrastus người sử dụng từ Hy Lạp “Orchis” để nhóm Lan [4]
1.2 Đặc điểm hình thái: 1.2.1 Cơ quan dinh dưỡng:
Giả hành (thân giả): xuất loài lan đa thân Giả hành
bộ phận cần thiết cho sinh trưởng phát triển lan Giả hành thân lại chứa diệp lục, phận dự trữ nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển giả hành Giả hành quan dự trữ nước[11]
Thân: Thân vẩy giả có nhiều hình dáng khác tùy theo giống lan
Trên thân có đốt, đốt mọc nhánh lá bao Thân quan dự trữ nước chất dinh dưỡng, mầm hoa mầm mọc từ phần gốc phận thân rễ[12] Chỉ có loài đơn thân số loài giống Dendrobium Epidendrum vừa có giả hành, vừa có thân Các lồi lan có thân thường khơng có quan dự trữ nước chất dinh dưỡng[11]
Lá: quan dinh dưỡng hoa lan, xưởng chế tạo chất dinh dưỡng
bằng quang hợp Phiến thường có hình lưỡi kiếm dài, số lượng hình dạng khác tùy chủng loại lan khác [12] Lá mọc đối xứng qua gân hay khơng, sát gốc hay xếp cách có bẹ úp lên nhau, chia đốt đặn, có thối hóa thành vẩy hay phình lên, mọng nước, hình dạng khác [11]
Căn hành (thân-rễ): gặp lan đa thân Căn hành nơi cấu tạo
(4)Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
hưu niên Mắt nơi hình thành mang nhiều rễ để nuôi sống lan [11]
Rễ: lan đa thân, rễ thường hình thành từ hành Ơû loài đơn
thân rễ mọc thẳng từ thân thường xen kẽ với Rễ khơng lồi lan phụ sinh có trục bao quanh mơ không chặt, giống bọt biển bao quanh gọi mạc Mạc hấp thụ nước khơng khí, tích trữ nước mưa sương đọng [11]
1.2.2 Cơ quan sinh sản:
Hoa: tập hợp thành cụm hoa chùm hay bơng Hoa lưỡng tính, đối xứng
hai bên Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành vịng: mảnh vịng ngồi (đài hoa) mảnh vòng (cánh hoa) bé mảnh thứ vịng Mảnh có hình dạng màu sắc khác hẳn, gọi cánh môi [13]
Quả: khô, mở thành 3-6 mảnh Hạt nhỏ nhiều, thường khơng
có nội nhũ Do nhẹ nên hạt dễ phát tán nhờ gió Ơû nhiều lồi, có lơng hút nước dùng để bắn hạt Phôi hạt phát triển yếu, khơng phân hóa thành quan Hạt muốn nẩy mầm cần có nấm cộng sinh [13]
1.3 Đặc điểm phân loại
Orchidaceae họ lớn thuộc lớp Đơn tử diệp, phân bố khắp nơi giới [16]
Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống đất địa lan; số lồi hoại sinh khơng diệp lục sống nhờ vào chất mục nát đất; có lồi Úc Châu sống ngầm đất nấm
Ơû vùng nhiệt đới, ta gặp nhiều loài phụ sinh sống khác
Cattleya, Oncidium, Laelia tập trung nhiều vùng Trung Mỹ; Đông
Nam Á đặc sắc Dendrobium có Cypripedium,
Phalaenopsis, Cymbidium có nguồn gốc Indonesia
Một số loài lan sống đá thạch lan Cây lan chia làm hai nhóm [11]:
Nhóm đơn thân: nhóm tăng trưởng chiều cao làm dài Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ:
- Nhóm phụ mọc đối (Sarcanthinae): nhóm xếp thành hàng mọc đối nhau, hàng xen kẻ với hàng Gồm giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis… - Nhóm phụ dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae):
Papilionanthe, Luisia…
(5)- Nhóm hoa phía như: Cymbidium, Dendrobium, Oncidium… - Nhóm hoa đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum…
Ngồi cịn có số giống mang tính chất trung gian như:
Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea…
Hình 2.1: Cấu tạo quan sinh sản a Cấu tạo hoa chi tiết b Quả lan chín
(6)Khố luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
II Giới thiệu Dendrobium 2.1 Nguồn gốc phân bố:
Giống lan đặt tên vào năm 1799 Chữ Dendrobium có nguồn gốc chữ Hy Lạp Dendro có nghĩa gỗ, lớn; bio sống, tất lồi
Dendrobium phụ sinh sống bám gỗ [16]
Dendrobium phong phú chủng loại, lớn thứ nhì họ Lan với
khoảng 1.600 loài phân bố vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều Đông Nam Á Úc châu [16]
Điều kiện sinh thái Dendrobium đa dạng có nhiều loài mọc hoa vùng lạnh, có lồi vùng nóng, có lồi trung gian, có lồi thích nghi với điều kiện khí hậu [11]
2.2 Vị trí phân loại: Lan Dendrobium thuộc:
- Ngaønh : Angiospermatophyta
- Lớp : Liliopsida (Monocotyledones) - Lớp phụ : Liliidae
- Bộ : Orchidales - Họ : Orchidaceae - Gioáng : Dendrobium sp
(7)2.3 Đặc điểm hình thái
Dendrobium loài đa thân với nhiều giả hành, giả hành thường mang
thân với nhiều mọc xen kẽ, thân có nhiều mắt ngủ Căn hành với khoảng cách mắt ngắn Cattleya Hoa mọc từ thân thành chùm hay hoa độc [11] Hoa có màu trắng, vàng đến tím Thường đài sau nằm mình, đài bên dài dính lại với mép dính vào đáy trụ tạo thành phần chân trụ phía gọi cằm Môi gắn vào cằm, kéo dài phía sau tạo thành cựa, móc hay túi Mơi ngun hay có thùy, gai, sọc có lơng hay khơng cánh hoa bên giống đài Trụ thấp Phần đực đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ ngắn phái sau khối phấn nhỏ dính lại với cặp, khơng vĩ, khơng gót
Dendrobium chia làm nhóm theo dạng thân chúng:
- Dạng thòng hay Nobile dạng thân mềm thường vùng lạnh Đà Lạt
- Dạng đứng hay Phalaenopsis dạng thân cứng thường sống vùng có khí hậu nóng
Cả Dendrobium nobile Dendrobium phalaenopsis có chung đặc điểm việc tạo lập giả hành biệt hóa chồi sơ khởi nách dọc theo giả hành; chúng lại khác biệt việc việc tạo lập chồi hoa
- Ơû Dendrobium nobile hoa từ chồi sơ khởi giả hành trưởng thành Như Long tu, Giả hạc chúng hoa với giả hành rụng hết
- Ơû Dendrobium phalaenopsis hoa mọc giả hành cũ lẫn giả hành Ơû giả hành mới, chồi non gần chồi phát triển thành vịi hoa
Hình dạng Dendrobium biến thiên:
- Nhóm có giả hành dài mang dọc theo chiều dài giả hành ấy, thường rụng hết hoa Long tu (Dendrobium primulinum), Ý thảo (Dendrobium gratio sissimum)…
- Nhóm giả hành to ngắn , tận thường có 2-3 dai, bền, không rụng Phát hoa tập trung phần tạo thành chùm đứng hay thòng như: Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium
thyrisflorum), Vaûy cá (Dendrobium lindleyi)…
- Nhóm cá giả hành mảnh mai, dài hay ngắn, có dọc theo chiều dài chúng, dai bền không rụng Hoa thường cô độc nách Hương duyên (Dendrobium revolutum)…
Ngồi cịn có số lồi Dendrobium khác thường trồng:
(8)Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
- Nhất điểm hồng (Dendrobium dracoins): Hoa trắng bóng sáp với môi sọc đỏ đáy
- Thạch hộc (Dendrobium crumenatum): Hoa trắng, mơi có bớt vàng, thơm mau tàn, hoa nở rộ lúc
- Giả hạc (Dendrobium anosmum, Dendrobium superbum): Hoa màu hường, có hai bớt đậm màu trắng hay tuyền Rất thơm [16]
2.4 Các điều kiện để nuôi trồng lan Dendrobium sp.: 2.4.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ tác động lan qua đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% tốc độ quang hợp tăng lên gấp đơi Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoa số loài lan lan Bạch câu
Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-60C vài giây
ngày sau chúng nở hoa đồng loạt Ơû 18,50 Dendrobium nobile tăng trưởng mà
không hoa chúng hoa nhiệt độ hạ xuống 130C hay thấp [16]
Căn vào nhu cầu nhiệt độ, tạm chia Dendrobium thành hai nhóm chính:
- Nhóm ưa lạnh sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ lý tưởng 150C,
gồm giống lấy từ vùng cao nguyên độ cao 1.000m loài trồng nhiệt độ cao 250C,
vẫn sống, sống hoa
- Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho lồi nhóm 250C,
gồm đa số giống Dendrobium vùng nhiệt đới, loài giống
Dendrobium lai trồng thành phố Hồ Chí Minh tỉnh
phía Nam…
- Ngồi ra, cịn có nhóm Dendrobium trung gian sống vùng lạnh vùng nóng, vùng lạnh sinh trưởng hoa nhiều Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng loài 200C [11]
2.4.2 Aåm độ
Các lan, phong lan, sống bám cao, chúng lấy nước từ trận mưa, từ nước khơng khí Chính ẩm độ định diện lồi phong lan [16]
Thơng thường ẩm độ tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho tăng trưởng nhiều loài Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng ẩm độ vùng xứ mà lồi lan tìm thấy
Dendrobium đa số giống lan khác phát triển tốt không
(9)2.4.3 nh sáng
Aùnh sáng điều kiện cần thiết cho sinh trưởng phát triển lan thông qua trình quang hợp Đây yếu tố định trổ hoa lan [16]
Dendrobium giống ưa sáng, trồng điều kiện ánh sáng trực tiếp
hay khuếch tán Aùnh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium 70%
Nếu thừa ánh sáng, bị vàng lá, giả hành bị teo lại, xấu thích nghi dần, hoa nhiều đẹp Nếu thiếu ánh sáng, bị thối hóa rõ rệt, èo uột số lượng hoa [11]
2.4.4 Nhu cầu phân bón
Dendrobium thân đứng địi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần nhiều phân bón
và dùng nhiều dạng phân bón khác Còn loại Dendrobium thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng
Các loại phân hữu như: phân heo, bánh dầu khơ, phân tơm cá, phân trâu bị khơ… dùng tốt cách pha loãng với nước tưới, vò chặt viên đặt bề mặt giá thể, rễ lan hấp thụ dưỡng chất phóng thích qua q trình tưới nước
Các loại phân vô dùng thường có cơng thức 30-10-10 dùng lần/tuần với nồng độ muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10-20-30 làm lần/tuần để tạo sức chịu đựng cho trước bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10 phân 10-20-20 với chu kỳ bón hoa tàn
Trong mùa nghỉ hồn tồn khơng bón phân cho Dendrobium, hay giảm khơng bón phân cho Dendrobium hồn tất thời kì tăng trưởng năm
Khơng nên dùng loại phân riêng rẽ, thường phân bón dùng dạng hỗn hợp bổ sung thêm chất phụ gia sinh tố nguyên tố vi lượng
2.4.5 Sâu bệnh vấn đề khác
Vì lan Dendrobium cần bón nhiều loại phân hữu khác môi trường sơ dừa mục nát sau thời gian ngắn trồng Đây nguyên nhân gây nhiều sâu bệnh hại
Một loại rệp dính màu vàng, kích thước bé thường xuất bề mặt Loại gây tác hại qua việc hút nhựa
Đối với lồi trùng cắn phá Dendrobium loại trừ chúng tương đối dễ dàng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500
(10)Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
(11)III Các phương pháp nhân giống 3.1 Nhân giống ngồi thiên nhiên
3.1.1 Nhân giống vô tính
a Tách bụi: phương pháp nghệ nhân sử dụng đối với giống lan đa thân Cattleya, Dendrobium, Cymbidium,
Paphiopelium…ở Cattleya, Dendrobium, giống tương tự:
mỗi gốc giả hành thường có mắt ngủ nên tách hành giả thành đơn vị để trồng
b Chiết cành: Dendrobium thường tạo giả hành (Keiki) cách tự nhiên Khi mạnh, có rễ tốt, tách khỏi giả hành để trồng
3.1.2 Nhân giống hữu tính
a Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên thụ phấn lan côn trùng thực Cấu trúc hoa lan hồn tồn để thích ứng cho thụ phấn
Có hai phương pháp thụ phấn:
- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa hoa rơi vào nuốm hoa Điều xảy tự nhiên hoa lan cấu trúc phận sinh dục đực hoa lan
- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa hoa để vào nuốm hoa khác hay lồi (thường xảy thiên nhiên trùng thực hiện), khác loài, khác giống (thường người thực hiện)
b Quả lan: Nếu thụ phấn có kết quả, ngày hay sang ngày hôm sau, phiến hoa xụ lại không rụng Và để trành thụ phấn khác côn trùng người ta dùng bao nilong trùm hoa lại, khơng buộc kín miệng hầm làm hư trái Sau thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to thành trái Mỗi trái chứa hàng ngàn hay đến triệu hột Khi traí từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục nên hái trái
c Gieo hạt:
Trong thiên nhiên muốn hạt lan nẩy mầm hạt lan phải nhiễm loại nấm kí sinh Người ta khám phá số loài nấm giúp nẩy mầm hạt lan, loài giúp nẩy mầm số giống lan mà
- Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Laelia,
(12)Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
- Rhizoctonia mucoroides giúp nẩy mầm Vanda, Phalaenopsis - Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hột nẩy mầm Oncidium,
Odontoglossum vaø Miltonoa [16]
3.2 Nhân giống phòng thí nghiệm
Trong phịng thí nghiệm lan Dendrobium chúng tơi nhân giống phương pháp gieo hạt in-vitro Trong thiên nhiên, hột lan q nhỏ, khơng chứa chất dự trữ có phơi chưa phân hóa, nên khơng thể phát triển theo phương cách bình thường mà việc cho hột lan nẩy mầm phát triển thành lan trưởng thành vấn đề khó khăn Người trồng lan tìm nhiều cách gieo hạt không thành công Năm 1922, Knudson Mỹ, thành công việc thay nấm đường môi trường thạch để gieo hạt [16] Phương pháp có nhiều ưu điểm như:
- Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo nhiều giống lan cung cấp cho thị trường
- Giúp bảo tồn loài lan quý, nhân nhanh số lượng giúp cho công tác bảo tồn
IV Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa môi trường xác định điều kiện vô trùng [5] Kỹ thuật in vitro dựa nguyên lý tế bào thực vật có tính tồn thể, nghĩa từ mô, quan tế bào phận phát triển thành hồn chỉnh ni mơi trường thích hợp [6]
4.1 Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật
a u cầu phịng ni cấy mơ phải đảm bảo vô trùng Khái niệm vô trùng bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy bảo đảm cho mẫu nuôi cấy hồn tồn vơ trùng b Các u cầu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Khi thiết lập phịng ni cấy mơ thực vật phải đảm bảo tính liên tục thuận lợi cho thao tác, giai đoạn suốt trình ni cấy mơ
- Đảm bảo vệ sinh (tính vơ trùng) sản phẩm cuối
- Chuẩn bị môi trường cách, chọn môi trường cho loại thực vật giai đoạn ni cấy
- Chọn xử lý mơ thích hợp trước cấy [7]
(13)c Các thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm: nước, muối khoáng (đa lượng vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, agar (đối với môi trường rắn) [14]
- Nước: nước dùng môi trường nuôi cấy nước cất, nước khử ion, tốt nước cất hai lần từ máy cất nước hoàn toàn thủy tinh
- Đường: tạo nguồn cacbon giúp mô tổng hợp nên cacbohydrat cho mà quanh hợp mô tạo nên; đường sử dụng phổ biến saccarose (1-6%w/
v), glucose (2% w/
v)
- Các muối khống đa lượng: ni cấy mơ thực vật đòi hỏi lượng định nguyên tố đa lượng N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, …
- Các muối khống vi lượng có vai trò quan trọng đời sống thực vật Chúng tham gia vào q trình sinh hóa tế bào, tham gia vào trung tâm hoạt tính enzyme vitamin, tăng tính chống chịu thực vật với điều kiện môi trường bất lợi Các vi lượng thông dụng Mn, B, Zn, Cu, Co, I, nồng độ sử dụng môi trường thấp
- Vitamins: chủ yếu myo-inositol, acid nicotinic, puridoxin HCl (B6), thiamin HCl (B1)…Các vitamin dễ bị hỏng nhiễm tạo
nên cần giữ t0< 00C [9]
- Chất điều hịa tăng trưởng: tùy theo mục đích ni cấy chọn nồng độ tổ hợp nồng độ tổ hợp chất điêu hòa sinh trưởng phù hợp Các chất điều hòa sinh trưởng thường dùng IAA, NAA, 2,4D, Kinetin, BAP, IBA…[14]
- Agar(đối với môi trường đặc): polisacarit làm từ rong biển Agar tan 1000C nguội đông đặc lại Hàm
lượng sử dụng từ 8-10g/l tùy hãng chế tạo[10] d Nhiệt độ, ánh sáng pH ảnh hưởng đến trình cấy:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phịng ni cấy thường điều chỉnh ổn định từ 22-250C tế bào thực vật khác
nhiệt độ nuôi cấy khác [5]
- Aùnh sáng: có ảnh hưởng đến q trình phát sinh hình thái nuôi cấy Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: cường độ, chu kỳ, thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ: 1000-2500 lux dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô [5] - pH: yếu tố quan trọng Sự ổn định pH mơi trường
(14)Khố luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
pH mơi trường dùng dung dịch 10% 1N NaOH 1N HCl [14]
4.2 Kỹ thuật gieo hạt ống nghiệm a Đặc điểm hạt lan
Không giống loại hạt khác, hạt lan nhỏ, hạt bụi không chứa nguồn dự trữ thức ăn Trong tự nhiên, hạt nẩy mầm khơng phát triển khơng có tác động nấm mycorrhizal [22] Loại nấm tiêu hóa vật chất hữu chủ đất, chuyển hóa thành đường đơn giản giúp hạt lan nẩy mầm giúp phôi phát triển [23] Khi hạt lan nẩy mầm, tạo lượng lớn tế bào khơng phân hóa gọi protocorm Nếu tất tốt, protocorm tiếp tục vài tuần, vài tháng, chí năm tùy loài, đủ lớn để tạo thân rễ Ơû lồi lan đất, trì mối quan hệ cộng sinh quan trọng suốt giai đoạn cây, protocorm nằm đất nên tự tổng hợp thức ăn Ơû lồi lan phụ sinh, protocorm thường xanh, tự tổng hợp thức ăn [22]
b Khử trùng trái lan
Việc khử rùng trái lan thực theo hai phương pháp:
- Quả lan sau mổ ra, hạt thu trước đem gieo cần tuyển chọn hạt chắc, hạt lép không thụ tinh cần phải loại bỏ cách đem ly tâm nước cất; hạt lan tốt lắng phía ống nghiệm, hạt lép lên trên, gạn bỏ Các hạt tốt tiếp tục khử trùng Hypochlorite de calcium 10%
Sau đấy, cho hạt lan nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, để yên vịng 10 phút, sau đổ nước khử trùng ống hút, tiếp tục rửa hạt lan lần nước cất vô trùng Cuối hạt lan khử trùng gieo vào bình chứa môi trường
- Khi lan cắt cây, mang vào phịng thí nghiệm, cần để nơi sẽ, thoáng mát Nếu chưa gieo hạt giữ tủ lạnh, vịng 3-4 ngày
Khi gieo hạt, trước tiên lan cần cắt bỏ cuống dài, cịn sót lại đài, cánh hoa…Dùng bơng gịn có tẩm alcol 700 để lau toàn mặt
Một vào tủ cấy vô trùng, lan được:
- Nhúng vào alcol 90-960, phút, hơ nhanh qua lửa
(15)Sau lan cắt gọt hai đầu, dùng dao mổ xẻ dọc lan (mổ hai đường đối diện nhau), tách làm hai lan, dùng pince dao mổ để giữ lấy tất hạt có hai nửa lan, cách gõ nhẹ lên phần vỏ Nếu thụ tinh tốt, tất hạt có màu vàng rơi xuống đĩa petri dùng để hứng lấy hạt Sau người ta dùng muỗng dụng cụ inox dùng để gieo hạt vào bình chứa mơi trường [8]
c Kỹ thuật gieo hạt ống nghiệm: hạt nẩy mầm ống nghiệm thủy tinh hay nhựa mơi trường rắn có chứa đường loại chất khoáng cần thiết để hạt nẩy mầm phát triển Đối với lan có hai kiểu nẩy mầm bản: nẩy mầm cần nấm cộng sinh nẩy mầm không cộng sinh
- Trong kiểu nẩy mầm cộng sinh, hạt gieo với lượng nhỏ nấm mycorrhizal thích hợp Nấm phát triển mơi trường, bao phủ hạt nẩy mầm mối quan hệ cộng sinh xuất trì sức sống protocorm tạo có khả tự dưỡng Kỹ thuật sử dụng rộng rãi để nhân giống loại lan đất vùng ơn đới Kỹ thuật có lợi môi trường sử dụng đơn giản (một dạng phổ biến bao gồm bột yến mạch dịch chiết nấm men), sinh thường khỏe có khả để kháng với tác động nấm tốt đối chứng nẩy mầm khơng cần nấm Kỹ thuật có nhược điểm cần phải có chủng nấm mycorrhizal khiết, quan hệ cộng sinh không phát triển, trở thành ký sinh hạt gieo chết Có nghiên cứu thực lồi nấm mycorrhizal loài lan nhiệt đới, nên kỹ thuật áp dụng
- Kiểu nẩy mầm không cộng sinh thường sử dụng để nhân giống lồi lan nhiệt đới Mơi trường sử dụng phức tạp bao gồm muối khoáng, chất hữu đường với lượng thích hợp để hạt lan nẩy mầm mà không cần nấm [22]
d Ưùng dụng việc gieo hạt
- Gia tăng lượng hoa lan thị trường
- Nhân giống loài lan nhằn nhân nhanh số lượng tự nhiên chương trình bảo tồn
- Cung cấp để bán, giúp hạn chế khai thác hoang dại, kích thích quan tâm công chúng tạo nguồn thu ngân sách
(16)Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
V Các cơng trình ngiên cứu gieo hạt lan ống nghiệm 5.1 Trong nước:
Dương Công Kiên cộng nghiên cứu lai tạo gieo hạt lan Dendrobium ống nghiệm [8]
5.2 Ngoài nước:
Năm 1844, Neumann, người Pháp làm vườn, làm nẩy mầm số hột lan cách rải đại hột lan cục đất quanh gốc lan lớn
Năm 1899, Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp, khám phá bí mật việc nẩy mầm hột lan ông khảo sát hột Neottia nidus-avis nẩy mầm tự nhiên rừng Năm 1904, ông cộng tác với Burgeff để đưa phương pháp gieo hột lan có nhiễm nấm chai thạch [16]
Năm 1909, Hans Burgeff làm nẩy mầm Laeliocattleya môi trường dinh dưỡng gồm 0,33% saccarose (đường mía)
Năm 1922, Lewis Knudson làm nẩy mầm Cattleya mossiae môi trường Pfefferds 1% saccarose (đường mía) [11]
VI Mục đích gieo hạt lan Dendrobium ống nghiệm
Hình 2.5: Quaû lan Dendrobium
Các nhà trồng lan khơng ngừng tìm kiếm giống lan để thõa mãn hiếu kì đem bán Có hai cách để có giống lan Một là, sưu tập giống lan hoang dại rừng đem hóa, tạo điều kiện nhân tạo giống tự nhiên để lan hóa Phương pháp gặp nhiều rủi ro điều kiện môi trường không thuận lợi cho lan phát triển Hai là, tạo giống lan lai mới, lan lai mang đặc tính tốt vựơt trội bố mẹ, thỏa mãn nhu cầu người thưởng thức lan Tuy nhiên hai lan lai với đạt kết tạo trái cần phải kết hợp với phương pháp gieo hạt ống nghiệm để hạt lan nẩy mầm dễ dàng Có kiểm tra kết việc lai hai lan
Đối với số giống lan quý cần phải bảo vệ phương pháp gieo hạt
(17)PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
I Vật liệu điều kiện gieo hạt ống nghiệm 1.1 Mẫu gieo hạt
Vật liệu lan Dendrobium lai dài từ 4-5 cm lấy từ ngồi thiên nhiên, vườn thầy Dương Cơng Kiên, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh
1.2 Mơi trường nuôi cấy
Môi trường Knudson C (1946), bổ sung thêm: - Nước dừa 15%
- Than hoạt tính 0.5g/l, tùy theo mục đích thí nghiệm - Đường 30g/l
- Agar 8,5 g/l - pH = 5.7 –
Môi trường MS (Murashige Skoog, 1962), bổ sung thêm: - Nước dừa 15%
- Than hoạt tính 0.5g/l, tùy theo mục đích thí nghiệm - Glycin 0.5g/l
- myo-Inositol 0.1mg/l - Đường 30g/l
- Agar 8,5 g/l - pH = 5.5 – 5.7
Sử dụng chai thủy tinh 100 ml 500 ml để nuôi cấy
Tất môi trường hấp khử trùng 1atm, 1210C thời gian 20
phút
1.3 Điều kiện nuôi cấy
Thí nghiệm thực từ ngày 20/01/2005 đến ngày 26/05/2005, công ty Văn Thành Tài, 114 Hồng Hà, Quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh, với điều kiện nuôi cấy sau:
- Nhiệt độ phịng ni: 24-280C
(18)Khố luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
II Hướng đề tài
Đối với đề tài, chúng tơi hướng mục đích nhân giống lan Dendrobium lai phương pháp gieo hạt in-vitro nhằm:
- Cung cấp giống lan cho phòng nuôi cấy mô - Tạo khỏe, bệnh, để trồng vườn ươm - Kiểm tra kết lai
Với thời gian ngắn, từ nguyên liệu ban đầu lan, chúng tơi thực giai đoạn:
- Khử trùng - Nhân protocorm - Ra rễ
III Bố trí thí nghiệm:
3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng a Mục đích thí nghiệm:
- Tìm phương pháp khử trùng thích hợp
- Tìm nồng độ Hypochloride calcium Ca(OCl)2 thời gian khử
trùng thích hợp lan
- Theo dõi biểu hạt b Phương pháp hóa chất sử dụng:
- Phương pháp đốt cồn
- Phương pháp hóa chất: dùng Ca(OCl)2
c Bố trí thí nghiệm:
- Mẫu lấy từ thiên nhiên
- Rữa mẫu nước chảy khoảng 10 phút - Rửa mẫu xà phòng pha loãng - Rửa lại nhiều lần nước cất Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng
- Rửa mẫu cồn 700 1-2 phút
- Rửa mẫu lại nước cất vô trùng khoảng 2-3 lần - Ngâm mẫu Ca(OCl)2
và thường xuyên lắc mẫu - Rửa lại mẫu nhiều lần
bằng nước cất vơ trùng
- Nhúng vào cồn 900 hô nhanh
qua lửa
- Nhanh chóng đặt lan vào đĩa petri vào đậy nắp lại
(19)- Sau lan cắt gọt đầu, dùng dao mổ xẻ dọc lan, tách làm
- Dùng dao giữ phần vỏ quả, dùng kẹp lấy hết hột đĩa petri - Gieo hạt vào môi trường
- Thí nghiệm lặp lại lần, lần d Chỉ tiêu theo dõi
(20)Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
Hình 3.1: Quy trình khử mẫu
(21)3.2 Thí nghiệm 2: Tìm mơi trường thích hợp để gieo hạt a Mục đích thí nghiệm
Tìm mơi trường khống thích hợp để gieo hạt
b Môi trường gieo hạt
- Mơi trường MS khơng bổ sung kích thích tố, ký hiệu Mo
- Môi trường MS bổ sung 1ppm BA, ký hiệu M1
- Môi trường Knudson’C khơng bổ sung kích tố ký hiệu Ko
- Môi trường Knudson’C bổ sung 1ppm BA, ký hiệu K1
c Bố trí thí nghiệm
- Các lan khử trùng từ thí nghiệm 1, gieo vào loại môi trường thử nghiệm
- Theo dõi ghi nhận kết sau 2-4 tuần
- Thí nghiệm lặp lại lần , lần 15 chai 100ml d Chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian hạt nẩy mầm
(22)Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
3.3 Thí nghiệm 3: Tạo Protocorm a Mục đích thí nghiệm
- So sánh thành lập protocorm hai môi trường khác
và bổ sung nồng độ kích thích tố
- Tìm mơi trường thích hợp cho thí nghiệm sau b Mơi trường nuôi cấy
- Môi trường MS không bổ sung kích thích tố, ký hiệu Mo
- Mơi trường MS bổ sung 2ppm BA, ký hiệu M2
- Mơi trường Knudson’C khơng bổ sung kích tố ký hiệu Ko
- Môi trường Knudson’C bổ sung 2ppm BA, ký hiệu K2
c Bố trí thí nghiệm
- Những mẫu hạt phình to ra, có màu xanh, khơng nhiễm từ thí nghiệm
- Theo dõi ghi nhận kết sau 2-4 tuần ni cấy - Thí nghiệm lặp lại lần, lần chai 100ml d Chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian tạo protocorm
- Môi trường tạo protocorm tốt - Tình trạng phát triển prorocorm
(23)3.4 Thí nghiệm 4: Nhân protocorm a Mục đích thí nghiệm
So sánh nhân protocorm loại môi trường với nồng độ kích thích tố thay đổi
b Môi trường nuôi cấy
- Môi trường Knudson’C đối chứng khơng bổ sung kích thích tố ký hiệu K0
- Môi trường Knudson’C bổ sung BA với nồng độ 1ppm:2ppm:3ppm, ký hiệu K1, K2, K3
- Môi trường Knudson’C bổ sung 2ppm BA IAA với nồng độ 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu K4, K5, K6
c Bố trí thí nghiệm
- Sử dụng protocorm tạo thành từ thí nghiệm - Theo dõi ghi nhận kết sau 2-4 tuần ni cấy - Thí nghiệm lặp lại lần, lần chai 500ml d Chỉ tiêu theo dõi
- Nhận xét môi trường nhân nhanh protocorm bật chồi tốt nhất: thời gian ngắn cho có chiều cao 2-3 cm có 2-3 - Sự tạo thành môi trường
- Màu sắc chiều dài
(24)Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
3.5 Thí nghiệm 5: Ra rễ a Mục đích thí nghiệm
Khảo sát mơi trường thích hợp cho rễ
b Môi trường nuôi cấy
- Môi trường Knudson’C đối chứng khơng bổ sung kích thích tố ký hiệu K0
- Môi trường Knudson’C bổ sung NAA với nồng độ 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu KN1, KN2, KN3
- Môi trường Knudson’C bổ sung IAA với nồng độ 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu KI1, KI2, KI3
- Môi trường Knudson’C bổ sung IBA với nồng độ 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu KB1, KB2, KB3
c Bố trí thí nghiệm
- Những có chiều cao từ 2-3 cm có 2-3 tạo thành từ thí nghiệm
- Theo dõi ghi nhận kết sau 3-4 tuần ni cấy - Thí nghiệm lặp lại lần, lần chai 500 ml d Chỉ tiêu theo dõi
- Chiều dài rễ
- Sự tăng trưởng chiều cao
(25)PHẦN IV: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
I Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu
Quả lan sau khử trùng, gieo hạt vào môi trường nuôi cấy, sau tuần kết ghi nhận sau:
Bảng 1: Kết khử trùng mẫu Ca(OCl)2, sau tuần
Sống không nhiễm Chết không nhiễm Nhiễm NT Số lần đốt
Số lượng Tỷ lệ (%)
Số lượng Tỷ lệ (%)
Số lượng Tỷ lệ (%)
1 16 100 0 0
2 10 62,5 37,5 0 Bảng 2: Kết khử trùng mẫu phương pháp đốt, sau tuần
Mẫu hạt lan gieo vào môi trường, sau tuần khử trùng, mẫu bắt đầu có biểu khác nhau:
- Đối với mẫu sống không nhiễm, sau tuần, hạt thích nghi với mơi trường, bắt đầu chuyển sang màu nâu vàng mật ong
- Còn với mẫu hạt bị ảnh hưởng Ca(OCl)2, nhiệt độ
cao, hạt chuyển sang màu trắng nâu đục, không phát triển Kết ghi nhận bảng cho thấy:
- Nồng độ Ca(OCl)2 7%, thời gian khử trùng 15 phút tỷ lệ hạt
sống không nhiễm 75%, mẫu không bị chết tỷ lệ
Sống khơng nhiễm Chết không nhiễm Nhiễm N T Nồng độ Ca(OCl)2 (%) Thời gian
(phút) Số lượng Tỷ lệ (%)
Số lượng Tỷ lệ (%)
Số lượng Tỷ lệ (%)
1 15 12 75 0 25 20 15 93,75 6,25 0
3 15 16 100 0 0
(26)Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết – Thảo luận
nhiễm cao (25%) Còn với thời gian khử trùng 20 phút, tỷ lệ hạt sống cao (93,75%), mẫu hoàn toàn không bị nhiễm, bị chết (6,25%)
- Khi khử trùng nồng độ tăng tỷ lệ mẫu bị chết tăng theo số mẫu nhiễm giảm dần Ơû nồng độ 9%, thời gian khử trùng 15 phút, tỷ lệ hạt sống cao (100%), mẫu hạt gieo hồn tồn khơng bị nhiễm, khơng chết Khi kéo dài thời gian khử trùng 20 phút, tỷ lệ mẫu chết tăng cao (37,5%)
Khi ngâm lan dung dịch Ca(OCl)2, phần vỏ bên tiếp
xúc trực tiếp với dung dịch khử trùng, phần hạt bên không bị ảnh hưởng Khi gieo hạt vào mơi trường, hạt có khả phục hồi nhanh nẩy mầm Tuy nhiên, tăng nồng độ kéo dài thời gian khử trùng, dung dịch ngấm vào bên vỏ quả, nên sau gieo vào mơi trường, hạt phục hồi chậm bị chết (hóa trắng)
Như vậy, với nồng độ Ca(OCl)2 sử dụng loạt thí
nghiệm, nồng độ 9% thời gian 15 phút thích hợp Kết ghi nhận bảng cho thấy:
- Khử trùng lan phương pháp đốt cồn mẫu hạt gieo hồn tồn khơng bị nhiễm Nhưng tiến hành đốt lần tỷ lệ mẫu chết cao (37,5%), tương đương với phương pháp khử trùng Ca(OCl)2 9%, thời gian 20 phút
- Khi đốt lần tỷ lệ mẫu sống 100%, tương ứng với khử trùng Ca(OCl)2 9% thời gian 15phút
Khi nhúng lan vào cồn 900 đốt, phần vỏ bên ngồi
bị ảnh hưởng trực tiếp nhiệt độ cao, đồng thời loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây nhiễm bên vỏ Nhưng tiến hành đốt lần, nhiệt độ cao với thời gian kéo dài gây ảnh hưởng đến hạt bên trong, nên gieo vào môi trường, mẫu hạt phục hồi chậm, hóa nâu, khơng nảy mầm
Như vậy, khử trùng lan Ca(OCl)2 9% thời gian 15
phút đốt cồn lần, tỷ lệ sống, không nhiễm Tuy nhiên, dùng phương pháp đốt cồn hạt gieo phục hồi nẩy mầm nhanh Ngoài ra, phương pháp tiết kiệm nhiều thời gian khử trùng mẫu, thao tác đơn giản hơn, kinh tế
Tóm lại: mẫu khử trùng lan Dendrobium cịn xanh Vì mẫu hạt gieo nằm bên trong, nên tiến hành rửa mẫu kỹ đốt cồn lần loại bỏ hồn tồn tác nhân gây nhiễm Hạt không bị ảnh hưởng gieo vào môi
(27)(28)Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết – Thảo luận
II Thí nghiệm 2:
Các lan sau khử trùng gieo vào loại môi trường khác nhau, theo dõi sau tuần nuôi cấy:
Môi trường Ký hiệu Nồng độ BA (ppm) Số mẫu hóa nâu (1 tuần) % Số mẫu nảy mầm (2 tuần) % Số mẫu hóa xanh (4 tuần) %
M0 100 83,33 93,33
MS
M1 1 100 90 100
K0 100 50 63,33
KC
K1 100 43,33 80
Bảng 3: Sự nảy mầm hạt lan môi trường Knudson’C MS bổ sung ppm BA
- Một tuần sau gieo vào môi trường, tất mẫu hạt lan hóa nâu vàng
- Sau tuần, mẫu bắt đầu có tượng nẩy mầm có khác biệt rõ rệt loại môi trường khác
- Sau tuần, hạt có màu vàng, dần chuyển sang xanh có tiếp xúc với ánh sáng, tạo diệp lục tố
Dựa vào bảng kết quả, nhận thấy:
- Hạt gieo mơi trường MS có tỷ lệ nẩy mầm cao (80-90%), tất mẫu hạt có tượng phình lên chuyển sang vàng Trong đó, mẫu hạt gieo mơi trường Knudson’C, tỷ lệ nẩy mầm thấp (40-50%) Trong thời điểm khơng có khác biệt loại mơi trường có khơng có kích thích tố Có thể thời điểm này, kích thích tố khơng có ảnh hưởng khả nẩy mầm hạt
- Sau tuần, hạt lan hóa xanh Trong mơi trường MS có bổ sung BA 1ppm, tất mẫu hạt hóa xanh khơng có kích thích tố tỷ lệ 93,33% Trong mơi trường KC, tỷ lệ mẫu hóa xanh thấp hơn, có khác biệt rõ rệt mơi trường có khơng có kích thích tố Mơi trường KC có BA tỷ lệ nẩy mầm
(29)gieo mơi trường có kích thích tố, có màu xanh đậm hơn, hạt phình to
Từ kết ghi nhận cho thấy, nồng độ kích thích tố, mơi trường MS có nồng độ khống cao hơn, hạt lan nẩy
mầm nhanh so với môi trường Knudson’C
(30)Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết – Thảo luận
III Thí nghieäm 3:
Các mẫu hạt lan sau hóa xanh, cấy chuyền qua mơi trường khác để tạo protocorm, theo dõi sau tuần ni cấy:
Tình trạng tạo protocorm Mơi trường Ký hiệu Nồng độ BA
(ppm) Sau tuaàn Sau tuaàn
M0 0 +
MS
M2 + +
K0 + ++
KC
K2 2 ++ +++
Bảng 4: Kết tạo protocorm môi trường Knudson’C MS bổ sung ppm BA
Với
0 : khơng có tạo protocorm + : tạo thành protocorm ++ : tạo thành protocorm nhiều +++ : tạo thành protocorm nhiều
- Tuần môi trường không tạo protocorm - Sau tuần, hạt gieo bắt đầu biến đổi tạo thành đám tế bào
coù maøu xanh
- Số lượng protocorm ngày tăng nhanh sau 3-4 tuần, phình to lên, có mầm
Dựa vào bảng kết nhận thấy:
- Hai tuần sau cấy, môi trường MS, hạt lan khơng có biến đổi rõ rệt, tạo thành protocorm Sau bốn tuần, số lượng protocorm tạo thành nhiều, đường kính nhỏ, màu xanh trắng, mầm dài khoảng 3-4 mm
- Trong mơi trường Knudson’C, sau hai tuần tất hạt lan biến đổi rõ rệt, đường kính protocorm khoảng 2mm, protocorm có lơng hút Sau tuần, số lượng protocorm môi trường Knudson’C phát triển nhanh, màu xanh, mầm dài khoảng 5-7 mm
(31)- Trong mođi trường Knudson’C có chứa BA, maịc dù soẫ lượng protocorm táo tương đương với mođi trường khođng chứa BA Nhưng protocorm phát trieơn tương đôi nhanh hơn, tng trưởng cụa protocorm đoăng đeău với nhau, có nhieău maăm khỏe, màu xanh tươi Trong mođi trường có chứa kích thích tô BA, mt cytokinin có khạ nng kích thích đieău chưnh phađn bào, tng chuyeơn hóa chât dinh dưỡng [10]
Tóm lại:
- Từ kết ghi nhận thời gian số lượng protocorm tạo thành ta kết luận rằng: tạo protocorm mơi trường Knudson’C có bổ sung kích thích tố BA tốt
(32)(33)IV Thí nghiệm 4:
Các protocorm tạo thành từ hạt có chất lượng đưa vào thí nghiệm nhân protocorm, sau tuần theo dõi kết ghi nhận sau:
Kích thích tố Nồng độ (ppm) Ký hiệu Số lượng chồi Chiều cao chồi (cm) Chiều dài (cm) Ghi
0 K0 0 Protocorm nhoû,
1 K1 1-2 1,5-2 0,5-0,7 Protocorm xanh,
nhưng K2 4-6 1,5-2,5 0,5-0,7 Protocorm nhiều, to,
xanh, có lông hút BA
3 K3 1-2 1,3-1,5 0,5-0,7 Protocorm nhiều
nhưng nhỏ 0,1 K4 4-6 2-3,5 1,5-2 Protocorm xanh, to,
có lông hút,
0,5 K5 5-7 3-4 2-3 Protocorm xanh,
nhưng
2ppm BA + IBA
1 K6 4-5 2-3 1,5-2,5 Protocorm nhỏ,
vàng, Bảng 5: Kết nhân protocorm mơi trường Knudson’C với kích thích tố
khác
- Sau tuần, bắt đầu xuất protocorm mới, có lơng hút Số lượng kích thước thay đổi tuỳ theo mơi trường
- Sau tuần, có số protocorm bật chồi
- Sau tuần chồi phát triển mạnh, tuỳ theo môi trường mà số lượng chiều cao chồi khác
Dựa vào bảng kết nhận thấy:
- Sau tuần, môi trường K1, không thấy xuất
protocorm Sang đến tuần thứ 3, xuất protocorm Số lượng protocorm tạo thành ít, có màu xanh Một số protocorm bật chồi vào tuần thứ 4, số lượng ít, khoảng 1-2 chồi
- Ơû môi trường K2, nhân protocorm diễn nhanh mạnh
(34)Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết – Thảo luận
tuần thứ 3, có số protocorm bật chồi, số lượng chồi nhiều, chiều cao chồi thấp
- Số lượng protocorm tạo thành nhiều môi trường K3, sau
tuần, xuất protocorm Sang đến tuần 4, số lượng protocorm nhiều, nhiên protocorm nhỏ, có số protocorm có màu trắng Hầu hết protocorm khơng bật chồi
¾ Trong mơi trường K1, K2, K3, tác dụng kích thích tố BA,
các mẫu cấy tạo thành protocorm Các protocorm tạo thành nhiều nồng độ kích thích tố tăng lên, chất lượng protocorm ngược lại (protocorm nhỏ trắng) Như vậy, với nồng độ kích thích tố thích hợp tác động tốt đến phân chia tế bào, nồng độ cao, gây độc
- Sau tuần, môi trường K4, K5, K6, thấy xuất
protocorm Tuy nhiên, sau tuần, số lượng protocorm không đổi Trong môi trường K5 K6, protocorm
có màu xanh mướt, to, có lơng hút Số lượng protocorm mơi trường K6, hơn, protocorm có màu xanh vàng, nhỏ
- Sang đến tuần thứ 3, protocorm bật chồi, sang đến tuần thứ protocorm phát triển mạnh, giai đoạn hầu hết mẫu hạn chế tạo protocorm mà chủ yếu tạo chồi So sánh cacù mơi trường, mơi trường K5 tạo thêm nhiều chồi hơn,
các chồi có màu xanh mướt, bật chồi chồi xanh tốt đồng loạt hai mơi trường cịn lại, có số chồi có rễ nhỏ, màu trắng, dài từ 0,1-0,3 cm
¾ Có khác biệt rõ rệt số lượng chồi mới, chiều cao chồi chiều dài môi trường có kích thích tố BA, mơi trường có BA IAA Ơû mơi trường có BA, sang đến tuần thứ 4, protocorm bật chồi, số lượng ít, chồi phát triển chậm, thấp Các môi trường chủ yếu tạo thêm protocorm mới, tạo chồi Trong đó, mơi trường có BA IAA, mẫu cấy chủ yếu tạo chồi, hạn chế việc tạo thành protocorm Như vậy, nhận thấy, kết hợp BA IAA có lợi cho viêc tạo chồi mới, phát triển để sử dụng cho thí nghiệm sau Tóm lại:
- Đối với thí nghiệm nhân protocorm, sử dụng mơi trường K2
và K5 tốt, sử dụng mơi trường K5, tạo
(35)Cụm chồi ban đầu tách làm 3, cấy chuyền sang môi trường K5 Sau tuần, từ cụm chồi, thu chồi cao
3-4 cm Như mặt lý thuyết, ta tính hệ số nhân chồi 3x412 chồi/năm
Sau tuần, có chiều cao 3-4 cm có 2-3 tách để đưa vào thí nghiệm tạo rễ Các chồi thấp tách ra, tiếp tục đưa vào môi trường K5, để phát triển chiều cao Các protocorm lại đựơc tách
(36)(37)V Thí nghiệm 5:
Những thí nghiệm có chiều cao từ 3-4 cm, có từ 2-3 cấy vào môi trường rễ, sau tuần theo dõi kết ghi nhận sau:
Kích thích tố
Nồng độ (ppm)
Ký hiệu Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm)
Tỷ lệ rễ(%)
Ghi
0 K0 1-3 0,3-0,7 63,9 Phát triển chiều
cao
0,1 KN1 2-4 0,7-2 83,33 Cây thấp, phát
triển khơng
0,5 KN2 4-6 2-4 94,44 Lá dài, xanh, phát
triển tốt đồng
NAA
1 KN3 3-4 1-5 90,22 Thân ốm, rễ
dài
0,1 KI1 1-3 0,5-1,2 62,5 Ít rễ,
ngắn
0,5 KI2 2-3 1-4,5 69,44 Phát triển tốt,
nhưng khơng đều, thân thấp, rễ dài IAA
1 KI3 1-3 1,5-3,5 66,67 Caây thấp, rễ ít,
dài
0,1 KB1 2-4 2-3 77,78 Ít lá, phát triển
khơng
0,5 KB2 1-3 1-2,5 91,67 Lá màu xanh phát
triển tốt, đồng
IBA
1 KB3 1-3 1-5 72,22 Nhiều lá, thân
ngắn, rễ dài Bảng 6: Kết thí nghiệm tạo rễ mơi trường Knudson’C, bổ sung NAA,
IAA, IBA với nồng độ khác (sau tuần)
- Hai tuần sau cấy vào môi trường rễ, bắt đầu tăng chiều cao rễ xuất
(38)Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết – Thảo luận
Dựa vào bảng kết nhận thấy:
- Trong môi trường đối chứng K0 , sau tuần, chồi rễ chậm,
có 1-3 rễ chiều dài từ 0,3-0,7 cm
Trong mơi trường có bổ sung kích thích tố, kích thước rễ có biến đổi rõ rệt tùy theo tùy loại kích thích tố nồng độ
- Trong môi trường bổ sung kích thích tố IAA, khơng có chênh lệch tỷ lệ rễ, tỷ lệ thấp 60% Số lượng rễ khoảng 1-3, mập dài Cây thấp, số lượng ít, 2-3 lá, có màu xanh đậm
- Các mơi trường KB1, KB2, KB3, tỷ lệ rễ cao, có
chênh lệch rõ ràng Mơi trường KB2 có tỷ lệ rễ cao hơn,
nhưng rễ ngắn có so với môi trường KB3
- Trong môitrường KN1, KN2, KN3, có tỷ lệ rễ cao Các
cây có nhiều lá, dài, có màu xanh mướt Cây cao, khoẻ có nhiều rễ, dài Trong môi trường KN2, tỷ lệ rễ
cao (94,44%), rễ dài, mập, có màu xanh Cây có nhiều lá, khoẻ mạnh phát triển tốt chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp trước vườn ươm
¾ Nhìn chung, tác dụng kích thích tố NAA, IAA, IBA auxin, gây giảm độ pH thành tế bào nên hoạt hoá enzym phân huỷ polysaccharide pectinmetylesteraza liên kết sợi cellulose làm chúng lỏng lẻo Vách tế bào mềm ra, trở nên lỏng lẻo làm tế bào kéo dài Do với hàm lượng auxin tăng dần số lượng chiều dài rễ tăng theo Trong auxin NAA, IBA sử dụng nhiều mơi trường ni cấy mơ IAA sử dụng bền hấp khử trùng mơi trường [10]
(39)(40)Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Kết luận – Đề nghị
PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
I Kết luận
Từ kết đạt được, đưa số kết luận sau:
¾ Mẫu khử trùng lan Dendrobium cịn xanh Vì mẫu hạt gieo nằm bên trong, nên tiến hành rửa mẫu kỹ đốt cồn lần loại bỏ hồn tồn tác nhân gây nhiễm Hạt không bị ảnh hưởng gieo vào môi trường phục hồi nhanh
¾ Mơi trường MS có ppm BA cho nẩy mầm hạt lan Dendrobium tốt so với mơi trường Knudson’C
¾ Sự tạo protocorm mơi trường Knudson’C có bổ sung kích thích tố BA tốt
¾ Đối với thí nghiệm nhân protocorm sử dụng môi trường Knudson’C bổ sung 2ppm BA 0,5 ppm IAA, tạo thành nhiều chồi hơn, có chiều cao, thích hợp cho thí nghiệm rễ sau Với hệ số nhân chồi 3x412
chồi/năm
¾ Mơi trường tốt cho tạo rễ lan Dendrobium môi trường Knudson’C bổ sung 0,5ppm NAA
Từ kết nghiên cứu chúng tơi đưa quy trình nhân giống lan
(41)(42)Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Kết luận – Đề nghị
II Đề nghị:
Do thời gian thực đề tài có hạn nên chúng tơi hoàn thành giai đoạn gieo hạt nhân giống in-vitro Trong thời gian tới, có điều kiện chúng tiến hành giai đoạn đưa vườn ươm tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm khác như:
- Khảo sát ảnh hưởng độ chín đến nảy mầm hạt
- So sánh khả nhân chồi so với phương pháp nhân giống lan Dendrobium khác