Nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp gieo hạt in - vitro

Nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp gieo hạt in - vitro

Tài liệu bạn đang xem được download từ website

WWW.AGRIVIET.COMWWW.MAUTHOIGIAN.ORG

»Agriviet.com là website chuyên đề về nông nghiệp nơi liên kết mọi thành viên hoạt động trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng tôi thường xuyên tổng hợp tài liệu về tất cả các lĩnh vực có liên quan đến nông nghiệp để chia sẽ cùng tất cả mọi người Nếu tài liệu bạn cần không tìm thấy trong website xin vui lòng gửi yêu cầu về ban biên tập website để chúng tôi cố gắng bổ sung trong thời gian sớm nhất

»Chúng tôi xin chân thành cám ơn các bạn thành viên đã gửi tài liệu về cho chúng tôi Thay lời cám ơn đến tác giả bằng cách chia sẽ lại những tài liệu mà bạn đang có cùng mọi người Bạn có thể trực tiếp gửi tài liệu của bạn lên website hoặc gửi về cho chúng tôi

theo địa chỉ email Webmaster@Agriviet.Com

Lưu ý: Mọi tài liệu, hình ảnh bạn download từ website đều thuộc bản quyền của tác giả,

do đó chúng tôi không chịu trách nhiệm về bất kỳ khía cạnh nào có liên quan đến nội dung của tập tài liệu này Xin vui lòng ghi rỏ nguồn gốc “Agriviet.Com” nếu bạn phát hành lại thông tin từ website để tránh những rắc rối về sau

Một số tài liệu do thành viên gửi về cho chúng tôi không ghi rỏ nguồn gốc tác giả, một số tài liệu có thể có nội dung không chính xác so với bản tài liệu gốc, vì vậy nếu bạn

là tác giả của tập tài liệu này hãy liên hệ ngay với chúng tôi nếu có một trong các yêu cầu sau :

• Xóa bỏ tất cả tài liệu của bạn tại website Agriviet.com

• Thêm thông tin về tác giả vào tài liệu

• Cập nhật mới nội dung tài liệu

www.agriviet.com

Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Mở đầu

PHẦN I: GIỚI THIỆU

Trong những năm gần đây với chính sách mở rộng đầu tư về mọi mặt của Nhà nước, đời sống vật chất và tinh thần của người dân ngày càng được cải thiện và nâng cao Song song với nhu cầu về vật chất thì nhu cầu tinh thần đặc biệt không thể thiếu được Từ lâu con người đã thích trồng hoa, cây cảnh vừa để trang trí cho đẹp, vừa để giải trí tinh thần Mỗi người thích trồng một loài hoa khác nhau, việc lựa chọn loài hoa nào thường tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu của vùng đó, vẻ đẹp của hoa, cũng như là hoa đó có dễ trồng và chăm sóc hay không Hoa lan được nhiều người ưa thích, bởi lẽ hoa lan có cấu trúc kiêu kì và phức tạp, nhất là bộ phận môi có những nét chạm trổ rất tinh vi, lại rất phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, dễ chăm sóc và mỗi người có thể chọn loại hoa lan mình thích tuỳ theo túi tiền của mình mà vẫn thoả mãn được thú vui tao nhã

Phong lan ở nước ta rất phong phú và đa dạng, có nhiều giống khác nhau như:

Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng đều cho hoa

rất đẹp và mang nhiều màu sắc khác nhau Nó có thể dùng để trang trí, trưng bày, làm đẹp, dùng trong các buổi lễ… hay người ta có thể bán hoa cắt cành-kinh doanh Trong

số đó có lẽ Dendrobium là giống đặc sắc nhất từ màu sắc, dạng hoa cho đến giống loài Mặc khác, Dendrobium cũng rất dễ trồng, rất siêng hoa và lâu tàn Do đó nó rất được

ưa chuộng và được trồng phổ biến nhất nước ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống

Các nhà trồng lan không ngừng tìm kiếm các giống lan mới để thõa mãn sự hiếu kì của mình hoặc có thể đem bán Có hai cách để có được giống lan mới Một là, sưu tập những giống lan hoang dại trong rừng đem về thuần hóa, tạo các điều kiện nhân tạo giống tự nhiên để cây lan có thể ra hóa Phương pháp này gặp nhiều rủi ro do điều kiện môi trường không thuận lợi cho cây lan phát triển Hai là, tạo ra những giống lan lai mới, cây lan lai sẽ mang những đặc tính tốt vựơt trội của cả bố mẹ, có thể thỏa mãn được nhu cầu của người thưởng thức lan Tuy nhiên khi hai cây lan lai với nhau đạt kết quả và tạo trái cần phải kết hợp với phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm để hạt lan có thể nẩy mầm dễ dàng Có như vậy mới có thể kiểm tra kết quả của việc lai hai cây lan

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, trong phạm vi đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

Nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp gieo hạt in-vitro

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Giới thiệu họ lan:

1.1 Đặc điểm chung:

Các họ lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương quốc

thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 ngàn loài khác nhau, cùng với những loài mới được

khám phá và mô tả theo từng năm Do bởi chúng được phân bố vùng rộng lớn, trải

dài từ đường xích đạo cho đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng

tuyết, các loài lan rất khác biệt nhau: Lan đất (phát triển mọc trong đất kháng

nước); thực vật biểu sinh hoặc thực vật phụ sinh (phát triển phía trên mặt đất hoặc

sống bám trên các loại thảo mộc khác, thu hút chất dinh dưỡng và nước từ môi

trường xung quanh); thực vật phát triển trên mặt đá hoặc ngay cả dưới mặt đất

(phát triển dưới bề mặt của môi trường cấy trồng)

Những nhà sáng lập ngành Lan học đáng kể là triết gia người Hy Lạp

Theophrastus (372-287 trước Công nguyên) và sau này là nhà thực vật học người

Thụy Điển Linnaeus (1707-1778) Chính Theophrastus là người đầu tiên sử dụng từ

Hy Lạp “Orchis” để chỉ nhóm Lan [4]

1.2 Đặc điểm hình thái:

1.2.1 Cơ quan dinh dưỡng:

Giả hành (thân giả): chỉ xuất hiện trên các loài lan đa thân Giả hành là

bộ phận rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Giả hành

tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, đây là bộ phận dự trữ nhiều chất

dinh dưỡng rất cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Giả hành

cũng là cơ quan dự trữ nước[11]

Thân: Thân vẩy giả có nhiều hình dáng khác nhau tùy theo giống lan

Trên thân có đốt, trên mỗi đốt mọc một nhánh lá hoặc lá bao Thân là cơ

quan dự trữ nước và chất dinh dưỡng, mầm hoa và mầm lá đều mọc từ

phần gốc của bộ phận thân rễ[12] Chỉ có các loài đơn thân và một số

loài của giống Dendrobium và Epidendrum vừa có giả hành, vừa có thân

Các loài lan có thân thường không có cơ quan dự trữ nước và chất dinh

dưỡng[11]

Lá: là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinh dưỡng

bằng quang hợp Phiến lá thường có hình lưỡi kiếm dài, số lượng và hình

dạng lá khác nhau tùy chủng loại lan khác nhau [12] Lá có thể mọc đối

xứng qua gân chính hay không, lá sát nhau ở gốc hay xếp cách có bẹ úp

lên nhau, chia đốt đều đặn, có khi thoái hóa thành vẩy hay phình lên,

mọng nước, hình dạng rất khác nhau [11]

Căn hành (thân-rễ): chỉ gặp ở lan đa thân Căn hành là nơi cấu tạo các

cơ quan dinh dưỡng mới, trên căn hành có nhiều mắt sống, chết hoặc

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

hưu niên Mắt lá nơi hình thành cũng mang rất nhiều rễ để nuôi sống

cây lan [11]

Rễ: ở lan đa thân, rễ thường được hình thành từ căn hành Ơû các loài đơn

thân thì rễ mọc thẳng từ thân và thường xen kẽ với lá Rễ trên không của

các loài lan phụ sinh có một trục chính bao quanh bởi mô không chặt,

giống bọt biển bao quanh gọi là mạc Mạc có thể hấp thụ hơi nước của

không khí, cũng như tích trữ nước mưa và sương đọng [11]

1.2.2 Cơ quan sinh sản:

Hoa: tập hợp thành cụm hoa chùm hay bông Hoa lưỡng tính, đối xứng

hai bên Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành 2 vòng: 3 mảnh vòng

ngoài (đài hoa) và 2 mảnh vòng trong (cánh hoa) bé hơn mảnh thứ 3 ở

vòng trong Mảnh này có hình dạng và màu sắc khác hẳn, gọi là cánh

môi [13]

Quả: khi khô, mở thành 3-6 mảnh Hạt rất nhỏ và nhiều, thường không

có nội nhũ Do nhẹ nên hạt dễ phát tán nhờ gió Ơû nhiều loài, trong quả

có những lông hút nước dùng để bắn hạt đi Phôi trong hạt phát triển yếu,

không phân hóa thành cơ quan Hạt muốn nẩy mầm cần có nấm cộng

sinh [13]

1.3 Đặc điểm về phân loại

Orchidaceae là một họ rất lớn thuộc lớp Đơn tử diệp, phân bố khắp nơi trên thế

giới [16]

Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan; một số loài hoại

sinh không diệp lục và sống nhờ vào chất mục nát trong đất; có loài ở

Úc Châu có thể sống ngầm dưới đất như nấm

Ơû vùng nhiệt đới, ta sẽ gặp nhiều loài phụ sinh sống trên cây khác như

Cattleya, Oncidium, Laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ; ở Đông

Nam Á đặc sắc nhất là Dendrobium và còn có Cypripedium,

Phalaenopsis, Cymbidium có nguồn gốc ở Indonesia

Một số loài lan sống trên đá như thạch lan

Cây lan có thể chia làm hai nhóm [11]:

Nhóm đơn thân: đây là nhóm chỉ tăng trưởng về chiều cao làm cây dài

ra mãi Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ:

- Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): nhóm này lá được xếp

thành 2 hàng mọc đối nhau, lá trên một hàng xen kẻ với lá của

hàng kia Gồm các giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis…

- Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae):

Papilionanthe, Luisia…

Nhóm đa thân: đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng liên tục Căn cứ

- Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dendrobium, Oncidium…

- Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum…

Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như:

Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea…

Hình 2.1: Cấu tạo cơ quan sinh sản

a Cấu tạo hoa chi tiết

b Quả lan chín

Hình 2.2: Một số giống hoa đẹp của họ Orchidaceae

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

II Giới thiệu về Dendrobium

2.1 Nguồn gốc và sự phân bố:

Giống lan này được đặt tên vào năm 1799 Chữ Dendrobium có nguồn gốc của

chữ Hy Lạp Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sống, vì tất cả các loài của

Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ [16]

Dendrobium rất phong phú về chủng loại, nay lớn thứ nhì của họ Lan với

khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều

nhất ở Đông Nam Á và Úc châu [16]

Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng có nhiều loài chỉ mọc và

ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở trung gian, và cũng có loài thích

nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào [11]

2.2 Vị trí phân loại:

Lan Dendrobium thuộc:

- Ngành : Angiospermatophyta

- Lớp : Liliopsida (Monocotyledones)

- Lớp phụ : Liliidae

- Bộ : Orchidales

- Họ : Orchidaceae

- Giống : Dendrobium sp

2.3 Đặc điểm về hình thái

Dendrobium là loài đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang một

thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ Căn hành với khoảng

cách giữa các mắt ngắn hơn Cattleya Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay

từng hoa cô độc [11] Hoa có màu trắng, vàng đến tím Thường lá đài sau nằm một

mình, 2 lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy của trụ tạo

thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm Môi gắn vào cằm, đôi khi

kéo dài về phía sau tạo thành cựa, móc hay túi Môi nguyên hay có thùy, gai, sọc

có lông hay không 2 cánh hoa bên giống như 2 lá đài Trụ thấp Phần đực của đỉnh

trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ 1 chỉ ngắn về phái sau 4 khối phấn nhỏ dính

lại với nhau từng cặp, không vĩ, không gót

Dendrobium được chia ra làm 2 nhóm theo dạng thân của chúng:

- Dạng thòng hay Nobile là dạng thân mềm thường ở vùng hơi lạnh như

Đà Lạt

- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có

khí hậu nóng hơn

Cả Dendrobium nobile và Dendrobium phalaenopsis đều có chung đặc điểm

trong việc tạo lập các giả hành mới và trong sự biệt hóa chồi sơ khởi ở nách lá dọc

theo giả hành; nhưng chúng lại rất khác biệt trong việc trong việc tạo lập chồi hoa

- Ơû Dendrobium nobile ra hoa từ chồi sơ khởi của giả hành đã trưởng

thành Như Long tu, Giả hạc chúng chỉ ra hoa với giả hành đã rụng hết

lá

- Ơû Dendrobium phalaenopsis thì hoa mọc ở giả hành cũ lẫn giả hành mới

Ơû giả hành mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển

thành vòi hoa

Hình dạng của Dendrobium cũng rất biến thiên:

- Nhóm có giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy,

thường rụng hết lá khi ra hoa như Long tu (Dendrobium primulinum), Ý

thảo (Dendrobium gratio sissimum)…

- Nhóm giả hành to ngắn , tận cùng thường có 2-3 lá dai, bền, không rụng

Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm đứng hay thòng như:

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium

thyrisflorum), Vảy cá (Dendrobium lindleyi)…

- Nhóm cá giả hành rất mảnh mai, dài hay ngắn, có lá dọc theo chiều dài

của chúng, dai bền không rụng Hoa thường cô độc ở nách như Hương

duyên (Dendrobium revolutum)…

Ngoài ra còn có một số loài Dendrobium khác cũng thường được trồng:

- Kim điệp (Dendrobium chysotosum var delacuorii): Hoa vàng tươi, môi

vàng dưới trung tâm đậm

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

- Nhất điểm hồng (Dendrobium dracoins): Hoa trắng bóng như sáp với

môi sọc đỏ ở đáy

- Thạch hộc (Dendrobium crumenatum): Hoa trắng, môi có bớt vàng, thơm

nhưng mau tàn, ít hoa nhưng nở rộ cùng lúc

- Giả hạc (Dendrobium anosmum, Dendrobium superbum): Hoa màu

hường, có hai bớt đậm màu trắng hay tuyền Rất thơm [16]

2.4 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium sp.:

2.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang

hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên

gấp đôi Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch câu

Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-60C trong vài giây thì 9

ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt Ơû 18,50 Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng mà

không ra hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 130C hay thấp hơn [16]

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm

chính:

- Nhóm ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 150C,

gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m

các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 250C, thì cây

vẫn sống, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa

- Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 250C,

gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống

Dendrobium lai hiện đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh

phía Nam…

- Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả

vùng lạnh và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa

nhiều hơn như Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý

tưởng của các loài này là 200C [11]

2.4.2 Aåm độ

Các cây lan, nhất là phong lan, sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước từ

các trận mưa, từ hơi nước trong không khí Chính ẩm độ quyết định sự hiện diện

của các loài phong lan [16]

Thông thường ẩm độ tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăng trưởng của

nhiều loài Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ mà loài lan đó

được tìm thấy

Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong không

khí ẩm và thoáng Aåm độ tương đối cần thiết là 40-70% Cấu tạo giá thể quá ẩm và

2.4.3 Aùnh sáng

Aùnh sáng là điều kiện cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan

thông qua quá trình quang hợp Đây là yếu tố quyết định sự trổ hoa của lan [16]

Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp

hay khuếch tán Aùnh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%

Nếu thừa ánh sáng, cây sẽ bị vàng lá, giả hành bị teo lại, cây xấu đi nhưng cây

sẽ thích nghi dần, vẫn ra hoa nhiều và đẹp Nếu thiếu ánh sáng, cây sẽ bị thoái

hóa rõ rệt, cây èo uột và số lượng hoa sẽ ít đi [11]

2.4.4 Nhu cầu phân bón

Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân bón

và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các loại Dendrobium thân

thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng

Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu bò

khô… có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng

viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng

thích qua quá trình tưới nước

Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30-10-10 dùng 3 lần/tuần

với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân

10-20-30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ

Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10 bằng phân

10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn

Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn

giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng hằng

năm của nó

Không nên dùng các loại phân riêng rẽ, thường phân bón được dùng ở dạng hỗn

hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi lượng

2.4.5 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi

trường sơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng Đây là 2 nguyên nhân

gây ra nhiều sâu bệnh hại

Một loại rệp dính màu vàng, kích thước rất bé thường xuất hiện trên bề mặt lá

Loại này gây tác hại trên cây qua việc hút nhựa

Đối với các loài côn trùng cắn phá Dendrobium thì loại trừ chúng tương đối dễ

dàng bằng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500

Mặc dù Dendrobium là cây kháng bệnh rất mạnh, tuy nhiên cây vẫn bị nấm và

virus tấn công nếu điều kiện vệ sinh quá kém Nguy hiểm nhất là bệnh khô thân

gần gốc giả hành do một loài virus thâm nhập làm cho các giả hành bị khô và chết

Có thể ngừa bệnh bằng cách nửa tháng xịt Topsil, Zineb, Benomyl với nồng độ

1/400 [11]

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

Hình 2.4: Một số dạng hoa đẹp của giống Dendrobium

III Các phương pháp nhân giống

3.1 Nhân giống ngoài thiên nhiên

3.1.1 Nhân giống vô tính

a Tách bụi: đây là phương pháp đã được các nghệ nhân sử dụng đối

với các giống lan đa thân như Cattleya, Dendrobium, Cymbidium,

Paphiopelium…ở Cattleya, Dendrobium, và những giống tương tự: ở

mỗi gốc của giả hành thường có ít nhất một mắt ngủ nên có thể tách mỗi hành giả thành một đơn vị để trồng

b Chiết cành: ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành

(Keiki) một cách tự nhiên Khi các cây con này khá mạnh, có rễ tốt, có thể tách ra khỏi giả hành để trồng

3.1.2 Nhân giống hữu tính

a Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực

hiện Cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích ứng cho sự thụ phấn ấy

Có hai phương pháp thụ phấn:

- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi vào nuốm của chính hoa ấy Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan

- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này được để vào nuốm của hoa khác của cùng cây hay cùng loài (thường xảy ra trong thiên nhiên do côn trùng thực hiện), hoặc khác loài, khác giống (thường do con người thực hiện)

b Quả lan: Nếu sự thụ phấn có kết quả, thì có thể ngay trong ngày hay

sang ngày hôm sau, các phiến hoa xụ lại nhưng không rụng Và để trành sự thụ phấn khác do côn trùng người ta dùng bao nilong trùm hoa lại, nhưng không buộc kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái

Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to ra thành trái Mỗi trái có thể chứa hàng ngàn hay đến cả triệu hột Khi traí từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái

c Gieo hạt:

Trong thiên nhiên muốn hạt lan nẩy mầm thì hạt lan phải được nhiễm một loại nấm kí sinh Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúp nẩy mầm ở hạt lan, mỗi loài chỉ giúp nẩy mầm một số giống lan mà thôi

- Rhizoctonia repens giúp nảy mầm ở Cattleya, Laelia,

Angraecum, Cypripedium (Paphiopedilum)

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

- Rhizoctonia mucoroides giúp nẩy mầm ở Vanda, Phalaenopsis

- Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hột nẩy mầm ở Oncidium,

Odontoglossum và Miltonoa [16]

3.2 Nhân giống trong phòng thí nghiệm

Trong phòng thí nghiệm lan Dendrobium được chúng tôi nhân giống bằng

phương pháp gieo hạt in-vitro Trong thiên nhiên, vì hột lan quá nhỏ, không chứa

chất dự trữ và chỉ có một phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một

phương cách bình thường được và vì vậy mà việc cho hột lan nẩy mầm và phát

triển thành cây lan trưởng thành là vấn đề khó khăn Người trồng lan đã tìm nhiều

cách gieo hạt nhưng không thành công Năm 1922, Knudson ở Mỹ, thành công

trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt [16] Phương

pháp này có nhiều ưu điểm như:

- Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo ra nhiều giống lan mới cung cấp cho thị trường

- Giúp bảo tồn các loài lan quý, và nhân nhanh số lượng giúp cho công tác bảo tồn

IV Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở

điều kiện vô trùng [5] Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có

tính toàn thể, nghĩa là từ một mô, một cơ quan hoặc một tế bào của bất kỳ bộ phận

nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong

môi trường thích hợp [6]

4.1 Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật

a Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô là phải đảm bảo vô

trùng Khái niệm vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cấy được hoàn toàn vô trùng

b Các yêu cầu cơ bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tục thuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô

- Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng

- Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật và từng giai đoạn nuôi cấy

- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy [7]

Download» http://Agriviet.Com

c Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: nước,

muối khoáng (đa lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, agar (đối với môi trường rắn) [14]

- Nước: nước dùng trong môi trường nuôi cấy là nước cất, hoặc nước khử ion, tốt nhất là nước cất hai lần từ các máy cất nước hoàn toàn bằng thủy tinh

- Đường: tạo nguồn cacbon giúp mô tổng hợp nên cacbohydrat cho cây mà không phải do quanh hợp của mô cây tạo nên;

đường sử dụng phổ biến là saccarose (1-6%w/v), glucose (2%

Co, I, nồng độ sử dụng trong môi trường rất thấp

- Vitamins: chủ yếu myo-inositol, acid nicotinic, puridoxin HCl (B6), thiamin HCl (B1)…Các vitamin dễ bị hỏng do nhiễm tạo nên cần giữ ở t0< 00C [9]

- Chất điều hòa tăng trưởng: tùy theo từng mục đích nuôi cấy có thể chọn các nồng độ và tổ hợp các nồng độ và tổ hợp các chất điêu hòa sinh trưởng phù hợp Các chất điều hòa sinh trưởng thường dùng là IAA, NAA, 2,4D, Kinetin, BAP, IBA…[14]

- Agar(đối với môi trường đặc): là một polisacarit làm từ rong biển Agar tan ở 1000C và khi nguội sẽ đông đặc lại Hàm lượng sử dụng từ 8-10g/l tùy hãng chế tạo[10]

d Nhiệt độ, ánh sáng và pH ảnh hưởng đến quá trình cấy:

- Nhiệt độ: nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định từ 22-250C ở mỗi tế bào thực vật khác nhau thì nhiệt độ nuôi cấy cũng khác nhau [5]

- Aùnh sáng: có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái cây nuôi cấy Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: cường độ, chu kỳ, thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ: 1000-

2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô [5]

- pH: là một yếu tố quan trọng Sự ổn định pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào Để điều chỉnh

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

pH môi trường có thể dùng dung dịch 10% hoặc 1N NaOH hoặc 1N HCl [14]

4.2 Kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm

a Đặc điểm của hạt lan

Không giống những loại hạt khác, hạt lan rất nhỏ, như hạt bụi và không chứa nguồn dự trữ thức ăn Trong tự nhiên, hạt có thể nẩy mầm nhưng sẽ không phát triển nếu không có sự tác động của nấm mycorrhizal [22] Loại nấm này tiêu hóa các vật chất hữu cơ trên cây chủ hoặc trong đất, chuyển hóa thành các đường đơn giản giúp hạt lan nẩy mầm và giúp phôi phát triển [23] Khi hạt lan đã nẩy mầm, nó sẽ tạo ra một lượng lớn các tế bào không phân hóa được gọi là protocorm Nếu tất cả đều tốt, protocorm sẽ tiếp tục trong vài tuần, vài tháng, thậm chí cả năm tùy loài, cho đến khi đủ lớn để tạo thân và rễ Ơû các loài lan đất, duy trì mối quan hệ cộng sinh này rất quan trọng trong suốt giai đoạn đầu tiên của cây, vì protocorm nằm dưới đất nên không thể tự tổng hợp thức ăn Ơû các loài lan phụ sinh, protocorm thường xanh, và vì thế nó có thể tự tổng hợp được một ít thức ăn [22]

b Khử trùng trái lan

Việc khử rùng trái lan có thể thực hiện theo hai phương pháp:

- Quả lan sau khi mổ ra, hạt thu được trước khi đem gieo cần tuyển chọn các hạt chắc, các hạt lép không thụ tinh cần phải loại bỏ đi bằng cách đem ly tâm trong nước cất; các hạt lan tốt sẽ lắng phía dưới ống nghiệm, hạt lép nổi lên trên, được gạn bỏ đi Các hạt tốt được tiếp tục khử trùng bằng Hypochlorite de calcium 10%

Sau đấy, cho hạt lan và nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, đều và để yên trong vòng 10 phút, sau đó đổ nước khử trùng ra bằng ống hút, và tiếp tục rửa hạt lan 3 lần bằng nước cất vô trùng Cuối cùng hạt lan đã khử trùng sẽ được gieo vào các bình chứa môi trường

- Khi quả lan đã được cắt trên cây, mang vào phòng thí nghiệm, cần để nơi sạch sẽ, thoáng mát Nếu chưa gieo hạt ngay thì có thể giữ quả trong tủ lạnh, trong vòng 3-4 ngày

Khi gieo hạt, trước tiên quả lan cần cắt bỏ các cuống dài, đuôi còn sót lại các lá đài, cánh hoa…Dùng bông gòn có tẩm alcol 700 để lau toàn bộ mặt ngoài của quả

Một khi vào tủ cấy vô trùng, quả lan sẽ được:

- Nhúng vào alcol 90-960, trong 1 phút, hơ nhanh qua ngọn lửa

Download» http://Agriviet.Com

Sau đấy quả lan sẽ được cắt gọt hai đầu, và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan (mổ hai đường đối diện nhau), tách làm hai quả lan, kế đến dùng pince và dao mổ để giữ lấy tất cả các hạt có trong hai nửa quả lan, bằng cách gõ nhẹ lên phần ngoài của vỏ quả Nếu sự thụ tinh tốt, tất cả các hạt sẽ có màu vàng và đều rơi xuống một đĩa petri dùng để hứng lấy hạt Sau đó người ta sẽ dùng muỗng hoặc một dụng cụ inox dùng để gieo hạt vào các bình chứa môi trường [8]

c Kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm: hạt sẽ nẩy mầm trong ống

nghiệm bằng thủy tinh hay bằng nhựa trên môi trường rắn có chứa đường và các loại chất khoáng cần thiết để hạt nẩy mầm và phát triển Đối với lan có hai kiểu nẩy mầm cơ bản: nẩy mầm cần nấm cộng sinh và nẩy mầm không cộng sinh

- Trong kiểu nẩy mầm cộng sinh, hạt được gieo với một lượng nhỏ nấm mycorrhizal thích hợp Nấm này sẽ phát triển trên môi trường, bao phủ các hạt nẩy mầm và mối quan hệ cộng sinh xuất hiện sẽ duy trì sức sống của protocorm cho đến khi nó tạo ra lá và có khả năng tự dưỡng Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để nhân giống các loại lan đất ở vùng ôn đới

Kỹ thuật này có lợi thế là môi trường sử dụng rất đơn giản (một trong những dạng phổ biến chỉ bao gồm bột yến mạch và một ít dịch chiết nấm men), và cây sinh ra thường khỏe hơn và có khả năng để kháng với các tác động của nấm tốt hơn cây đối chứng nẩy mầm không cần nấm Kỹ thuật này có một nhược điểm là cần phải có một chủng nấm mycorrhizal thuần khiết, hoặc quan hệ cộng sinh không phát triển, hoặc trở thành ký sinh và hạt gieo sẽ chết Có rất ít nghiên cứu thực hiện về các loài nấm mycorrhizal ở các loài lan nhiệt đới, nên kỹ thuật này ít được áp dụng

- Kiểu nẩy mầm không cộng sinh thường được sử dụng để nhân giống các loài lan nhiệt đới Môi trường sử dụng phức tạp hơn bao gồm các muối khoáng, các chất hữu cơ và đường với một lượng thích hợp để hạt lan nẩy mầm mà không cần nấm [22]

d Ưùng dụng của việc gieo hạt

- Gia tăng lượng hoa lan trên thị trường

- Nhân giống các loài lan hiếm nhằn nhân nhanh số lượng cả trong tự nhiên và trong các chương trình bảo tồn

- Cung cấp cây con để bán, giúp hạn chế sự khai thác cây hoang dại, kích thích sự quan tâm của công chúng và tạo nguồn thu ngân sách

- Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo ra những cây lan khỏe mạnh có màu sắc đặc biệt [22]

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu

V Các công trình ngiên cứu gieo hạt lan trong ống nghiệm

5.1 Trong nước:

Dương Công Kiên và cộng sự nghiên cứu lai tạo và gieo hạt lan

Dendrobium trong ống nghiệm [8]

5.2 Ngoài nước:

Năm 1844, Neumann, một người Pháp làm vườn, đã làm nẩy mầm một số hột

lan bằng cách rải đại các hột lan trên các cục đất ở quanh gốc của các cây lan lớn

Năm 1899, Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp, đã khám phá ra bí mật của

việc nẩy mầm ở hột lan khi ông khảo sát các hột Neottia nidus-avis nẩy mầm tự

nhiên trong rừng Năm 1904, ông cộng tác với Burgeff để đưa ra phương pháp gieo

hột lan có nhiễm nấm trong chai thạch [16]

Năm 1909, Hans Burgeff đã làm nẩy mầm được Laeliocattleya trên môi trường

dinh dưỡng gồm 0,33% saccarose (đường mía)

Năm 1922, Lewis Knudson đã làm nẩy mầm Cattleya mossiae trên môi trường

Pfefferds 1% saccarose (đường mía) [11]

VI Mục đích gieo hạt lan Dendrobium trong ống nghiệm

Hình 2.5: Quả lan Dendrobium

Các nhà trồng lan không ngừng tìm kiếm các giống lan mới để thõa mãn

sự hiếu kì của mình hoặc có thể đem bán Có hai cách để có được giống

lan mới Một là, sưu tập những giống lan hoang dại trong rừng đem về

thuần hóa, tạo các điều kiện nhân tạo giống tự nhiên để cây lan có thể ra

hóa Phương pháp này gặp nhiều rủi ro do điều kiện môi trường không

thuận lợi cho cây lan phát triển Hai là, tạo ra những giống lan lai mới,

cây lan lai sẽ mang những đặc tính tốt vựơt trội của cả bố mẹ, có thể

thỏa mãn được nhu cầu của người thưởng thức lan Tuy nhiên khi hai cây

lan lai với nhau đạt kết quả và tạo trái cần phải kết hợp với phương pháp

gieo hạt trong ống nghiệm để hạt lan có thể nẩy mầm dễ dàng Có như

vậy mới có thể kiểm tra kết quả của việc lai hai cây lan

Đối với một số giống lan quý cần phải bảo vệ thì phương pháp gieo hạt

Download» http://Agriviet.Com

PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

I Vật liệu và điều kiện gieo hạt trong ống nghiệm

1.1 Mẫu quả gieo hạt

Vật liệu là quả lan Dendrobium lai dài từ 4-5 cm lấy từ cây ngoài thiên nhiên,

tại vườn thầy Dương Công Kiên, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh

1.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường Knudson C (1946), bổ sung thêm:

Sử dụng chai thủy tinh 100 ml và 500 ml để nuôi cấy

Tất cả môi trường được hấp khử trùng ở 1atm, 1210C trong thời gian 20 phút

1.3 Điều kiện nuôi cấy

Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 20/01/2005 đến ngày 26/05/2005, tại công

ty Văn Thành Tài, 114 Hồng Hà, Quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh, với các điều kiện nuôi cấy như sau:

- Nhiệt độ phòng nuôi: 24-280C

- Cường độ chiếu sáng: 2000-3000 lux

- Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày

- Ẩm độ trung bình: 60-70%

Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp

II Hướng đi của đề tài

Đối với đề tài, chúng tôi hướng mục đích nhân giống lan Dendrobium lai bằng

phương pháp gieo hạt in-vitro nhằm:

- Cung cấp giống lan mới cho các phòng nuôi cấy mô

- Tạo ra cây con khỏe, sạch bệnh, để trồng ra vườn ươm

- Kiểm tra kết quả lai

Với thời gian quá ngắn, từ nguyên liệu ban đầu là quả lan, chúng tôi chỉ có thể thực hiện được các giai đoạn:

- Khử trùng quả

- Nhân protocorm

- Ra rễ

III Bố trí thí nghiệm:

3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng quả

a Mục đích thí nghiệm:

- Tìm phương pháp khử trùng thích hợp

- Tìm nồng độ Hypochloride calcium Ca(OCl) 2 và thời gian khử trùng thích hợp đối với quả lan

- Theo dõi biểu hiện của hạt

b Phương pháp và hóa chất sử dụng:

- Phương pháp đốt cồn

- Phương pháp hóa chất: dùng Ca(OCl)2

c Bố trí thí nghiệm:

- Mẫu lấy từ thiên nhiên

- Rữa mẫu dưới nước chảy khoảng 10 phút

- Rửa mẫu bằng xà phòng pha loãng

- Rửa lại nhiều lần bằng nước cất

Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng

- Rửa mẫu bằng cồn 700 trong 1-2 phút

- Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng khoảng 2-3 lần

- Ngâm mẫu trong Ca(OCl)2

và thường xuyên lắc mẫu

- Rửa lại mẫu nhiều lần

bằng nước cất vô trùng

khoảng 3-4 lần cho thật

- Nhúng vào cồn 900 và hơ nhanh qua ngọn lửa

- Nhanh chóng đặt quả lan vào đĩa petri vào đậy nắp lại

Download» http://Agriviet.Com

- Sau đấy quả lan sẽ được cắt gọt 2 đầu, và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan, tách làm 2

- Dùng dao giữ phần vỏ quả, dùng kẹp lấy hết hột ra một đĩa petri

- Gieo hạt vào môi trường

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, mỗi lần một quả

d Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ hạt sống sau khi gieo

Tình trạng hạt gieo: Xanh

Trắng

Hóa nâu

Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp

Hình 3.1: Quy trình khử mẫu

Download» http://Agriviet.Com

3.2 Thí nghiệm 2: Tìm môi trường thích hợp để gieo hạt

a Mục đích thí nghiệm

Tìm môi trường khoáng thích hợp để gieo hạt

b Môi trường gieo hạt

- Môi trường MS không bổ sung kích thích tố, ký hiệu Mo

- Môi trường MS bổ sung 1ppm BA, ký hiệu là M1

- Môi trường Knudson’C không bổ sung kích tố ký hiệu Ko

- Môi trường Knudson’C bổ sung 1ppm BA, ký hiệu K1

c Bố trí thí nghiệm

- Các quả lan đã được khử trùng từ thí nghiệm 1, sẽ được gieo vào 4 loại môi trường thử nghiệm

- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 2-4 tuần

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần , mỗi lần 15 chai 100ml

d Chỉ tiêu theo dõi

- Thời gian hạt nẩy mầm

- Môi trường thích hợp gieo hạt Dendrobium