Đang tải... (xem toàn văn)
Ebook Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh, tế bào học: Phần 2 được tiếp nối gồm 33 chương với các nội dung các quy trình kỹ thuật nhuộm phải dùng mảnh cắt lạnh; các quy trình kỹ thuật miễn dịch và sinh học phân tử; các quy trình kỹ thuật tế bào học.
306 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC PHẦN IV CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHUỘM PHẢI DÙNG MẢNH CẮT LẠNH HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 307 308 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 98 NHUỘM SOUDAN III HOẶC IV TRONG DUNG DỊCH ETANOL I NGUYÊN TẮC Nhận dạng lipid kỵ nước trạng thái lỏng theo chế vật lý vật chuyển thể có màu (lysochrom) từ dung mơi hồ tan (cồn, diacetin, propylen, ethylen glycol, v.v…) vào lipid trạng thái lỏng II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hoá chất Máy cắt lạnh trạng thái sẵn sàng hoạt động Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm Phiến kính, kính Bút chì mềm (để ghi tên tuổi Người bệnh, mã số tiêu phiến kính) Giấy thấm, gạc Găng tay, trang, mũ, kính bảo vệ mắt quần áo bảo hộ Chổi lơng mềm Gel cắt lạnh Gắn kính: glycerogel sirô Apathy Phẩm nhuộm Soudan III IV etanol Cồn tuyệt đối III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Chuẩn bị Bệnh phẩm sau lấy từ người bệnh gửi đến khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi thông tin người bệnh vào sổ đăng ký mã số người bệnh HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 309 Ghi mã số người bệnh vào phiến kính dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm Cắt lọc bệnh phẩm Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi tác động học Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô Dùng dao sắc cắt theo hướng, cho đường cắt gọn, khơng bị dập nát Kích thước mảnh mơ cắt tùy theo kích thước vật gá mẫu bệnh phẩm máy cắt lạnh, thông thường kích thước x x 0,2cm Số lượng mảnh cắt tuỳ trường hợp Làm lạnh mẫu bệnh phẩm cắt mảnh mô Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh đưa vào vị trí tương ứng làm lạnh (Cryobar) buồng làm lạnh máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên khuôn đúc chứa bệnh phẩm đóng kín cửa kính phía buồng máy, chờ khối bệnh phẩm đơng cứng (có màu trắng) Mẫu mô sau đông cứng cắt thành lát thật mỏng Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng Sau điều chỉnh độ dày lát cắt từ 2-5 micromet Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính Cố định mảnh mơ: (để cấu trúc mơ tế bào giữ ngun hình dáng bắt màu thuốc nhuộm), sau lát cắt dàn lên phiến kính, phải cố định cồn tuyệt đối 95-960 cồn acetic-formol 20 giây Nhuộm mảnh cắt 4.1 Chuẩn bị phẩm nhuộm Soudan III IV etanol Soudan III IV: 1g Etanol 70%: 50ml Aceton: 50ml Bảo quản lọ nút kín, lọc trước sử dụng 4.2 Các bước nhuộm Mảnh cắt rửa nước cất 310 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC Ngâm mảnh cắt vào etanol 70% vài giây Ngâm vào dung dịch bão hồ Soudan cồn 70% phút (có thể dùng dung dịch Herxheimer) Ngâm nhiều lần ethanol 70% khơng cịn vết phẩm nhuộm Rửa nước cất Nhuộm nhân Hemalun xanh lơ toluidin 0,5% Rửa nước cất Gắn glyxerogel sirô Apathy IV KẾT QUẢ Các lipid kỵ nước trạng thái lỏng (triglycerit không bão hồ, cholesterit khơng bão hồ acid béo tự khơng bão hồ): màu đỏ Các cerebrosit nhuộm nhạt Photpholipid nhuộm yếu (Adams, 1965) HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 311 99 NHUỘM DẦU ĐỎ O I NGUYÊN TẮC Hòa tan có chọn lọc chế mà nhờ phẩm nhuộm phân tán dung môi lại có khả hịa tan mạnh vào thành phần mơ, mức độ hịa tan chúng dung môi lại yếu Cơ chế lần sử dụng để phát lipid mảnh cắt lạnh Độ cồn thích hợp cho phẩm nhuộm lipid 70% Tuy nhiên, độ cồn này, số lipid trung tính bị trình nhuộm mức tối thiểu, nên khơng ảnh hưởng tới vị trí, kích thước tổn thương Kỹ thuật nhuộm dầu đỏ O cho phép nhuộm nhân tế bào tổn thương, nên có lợi cho việc nhận định cấu trúc mô học II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hoá chất Máy cắt lạnh trạng thái sẵn sàng hoạt động Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm Phiến kính, kính Bút chì mềm (để ghi tên tuổi người bệnh, mã số tiêu phiến kính) Giấy thấm, gạc Găng tay, trang, mũ, kính bảo vệ mắt quần áo bảo hộ Chổi lông mềm Gel cắt lạnh Gắn kính: glycerogel sirơ Apathy Cồn tuyệt đối Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn hãng pha hướng dẫn III.4.1 đây): dầu đỏ O, cồn isopropyl tuyệt đối, dextrin, Gill II hematoxylin 312 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Chuẩn bị Bệnh phẩm sau lấy từ người bệnh gửi đến khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi thông tin người bệnh vào sổ đăng ký mã số Người bệnh Ghi mã số người bệnh vào phiến kính dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm Cắt lọc bệnh phẩm Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi tác động học Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô Dùng dao sắc cắt theo hướng, cho đường cắt gọn, không bị dập nát Kích thước mảnh mơ cắt tùy theo kích thước vật gá mẫu bệnh phẩm máy cắt lạnh, thơng thường kích thước x x 0,2cm Số lượng mảnh cắt tuỳ trường hợp Làm lạnh mẫu bệnh phẩm cắt mảnh mô Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh đưa vào vị trí tương ứng làm lạnh (Cryobar) buồng làm lạnh máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên khn đúc chứa bệnh phẩm đóng kín cửa kính phía buồng máy, chờ khối bệnh phẩm đơng cứng (có màu trắng) Mẫu mơ sau đông cứng cắt thành lát thật mỏng Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng Sau điều chỉnh độ dày lát cắt từ 2-5 micromet Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mơ lên phiến kính Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô tế bào giữ nguyên hình dáng bắt màu thuốc nhuộm), sau lát cắt dàn lên phiến kính, phải cố định cồn tuyệt đối 95-960 cồn acetic-formol 20 giây Nhuộm mảnh cắt 4.1 Chuẩn bị phẩm nhuộm 4.1.1 Dung dịch dầu đỏ O Dầu đỏ O: 0,5 g Cồn isopropyl tuyệt đối: 100 ml HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 313 Để dung dịch qua đêm 4.1.2 Dung dịch dextrin Dextrin: 1g Nước cất: 100ml 4.1.3 Dung dịch nhuộm Dầu đỏ O lưu trữ: 60 ml Dextrin: 40 ml Có thể giữ dung dịch tháng lọc trước sử dụng 4.2 Tiến hành kỹ thuật Đặt mảnh cắt lạnh trực tiếp vào dung dịch dầu đỏ O – dextrin 0,5% khoảng 20 giây Rửa nhẹ nhàng, nhanh, nước chảy Nhuộm đối màu Gill II hematoxylin x 20 – 30 giây Rửa nước nhẹ nhàng, làm xanh gắn môi trường nước V KẾT QUẢ Lipid: đỏ rực rỡ Nhân: xanh 314 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 100 NHUỘM ĐEN SOUDAN B TRONG DIACETIN I NGUYÊN TẮC Nhận dạng lipid kỵ nước trạng thái lỏng theo chế vật lý vật chuyển thể có màu (lysochrom) từ dung mơi hồ tan (cồn, diacetin, propylen, etylen glycol, v.v…) vào lipid trạng thái lỏng II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hoá chất Máy cắt lạnh trạng thái sẵn sàng hoạt động Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm Phiến kính, kính Bút chì mềm (để ghi tên tuổi người bệnh, mã số tiêu phiến kính) Giấy thấm, gạc Găng tay, trang, mũ, kính bảo vệ mắt quần áo bảo hộ Chổi lông mềm Gel cắt lạnh Gắn kính: glycerogel sirơ Apathy Cồn tuyệt đối Phẩm nhuộm Đen Soudan B diacetin, Kernechtrol III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Chuẩn bị Bệnh phẩm sau lấy từ người bệnh gửi đến khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi thông tin người bệnh vào sổ đăng ký mã số người bệnh HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 315 III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Lấy bệnh phẩm Việc lấy mẫu thực khoa lâm sàng gửi bệnh phẩm khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Mẫu lấy phết trực tiếp lên phiến kính sạch, ghi sẵn mã số người bệnh, cố định cồn ethanol 95o chuyến xuống khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học, nhuộm phiến đồ theo phương pháp nhuộm tế bào học Hoặc rửa bàn chải dung dịch sinh lý (salin vô trùng) làm phiến đồ tế bào học dịch sau: Dịch lấy chuyển đến làm xét nghiệm cho vào hộp có nắp đậy chứa 50ml dung dịch tiền cố định pha sẵn Dung dịch tiền cố định: 50ml cồn 70% dung dịch 2% carbowax cồn 50% với thể tích tương đương Kỹ thuật làm tan nhày tập trung tế bào Nếu dịch có nhiều nhày 50ml dung dịch chải phế quản lọ pha sẵn dung dịch cố định, dùng bi sắt đánh tan chất nhày dùng máy trộn xốy đặt đứng nhiệt độ phịng 30-60 phút cho vào máy xay tốc độ cao 5-10 giây, chưa tan nhày lại xay tiếp 5-10 giây cho chất làm tan nhày vào mẫu dịch cố định Nếu khơng nhày: quy trình giống làm cặn nước tiểu Cho mẫu tan nhày đặt vào máy ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút x10 phút Gạn bỏ phần bên trên, để lại vài giọt phần lắng cặn tế bào bên (1-2ml) Lấy phần cặn lắc máy trộn điện 4-5 giây lấy làm phiến đồ Làm phiến đồ Dùng ống hút hút dịch cặn trộn nhỏ lên phần trung tâm phiến kính ghi sẵn mã người bệnh (1-2 giọt/phiến kính cặn giàu tế bào; 3-4 giọt cặn lỏng, nhiều nước) Dùng phiến kính khác đặt lên cặn, dàn nhẹ, bệnh phẩm hai phiến kính để bệnh phẩm dàn mỏng, Cố định phiến đồ Các phiến đồ để khô khơng khí 10-30 phút mơi trường sạch, khơng bụi Ngâm phiến đồ 10 phút cồn 95o trước nhuộm 444 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC Nhuộm phiến đồ Theo phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen HE (như nêu mục nhuộm phiến đồ tế bào học) Nhận định kết Trên kính hiển vi quang học bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học IV KẾT QUẢ Các phiến đồ giàu tế bào, dàn mỏng, đều, tế bào không chồng chất lên Hình thái tế bào bảo tồn tốt Các tế bào bắt màu rõ ràng, phân biệt rõ hình thái nhân bào tương V NHỮNG SAI SĨT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ Phiến đồ bị tế bào vào dịch cố định: cần để khô sau dàn 10-30 phút trước cố định cồn Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất dính (albumin) Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn tay Tế bào thối hóa tan rã khơng nhận định hình thái nhân bào tương: dịch lấy khỏi thể phải làm xét nghiệm phải tiền cố định Các tế bào bắt màu kém: cần cố định tốt nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt Nhuộm đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm cồn tuyệt đối Các tế bào bị kéo dài bị dập nát: cần dàn nhẹ tay HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 445 142 KỸ THUẬT TẾ BÀO HỌC DỊCH RỬA Ổ BỤNG I NGUYÊN TẮC Trong dịch rửa ổ bụng chứa tế bào bong màng bụng, tiểu khung, túi tế bào bong từ tổn thương có vùng Vì vậy, cần lấy tế bào nhận định loại tế bào, hình thái, số lượng tế bào dịch, xếp tế bào, phiến đồ kính hiển vi quang học để chẩn đoán bệnh II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hóa chất Găng tay vơ trùng, trang Ống hút tự động Máy ly tâm lọ đựng dịch ly tâm Máy trộn (khuấy) Phiến kính sạch, đầu mài mờ Giá để đựng phiến kính dàn bệnh phẩm Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút Dung dịch cố định bệnh phẩm: + dung dịch carbowax 2% cồn + cồn etanol 95o Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quik/HE/ PAP, Ziehl - Neelsen…) Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút Nước cất, nước để rửa thuốc nhuộm phiến kính Các dung dịch sát khuẩn Kính hiển vi quang học, bàn có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi viết (1) Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực kỹ thuật, số lượng phiến đồ Sổ máy tính ghi lại thông tin Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết chẩn đoán Các sọt rác đựng rác thải y tế, rác thải thường 446 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Lấy bệnh phẩm Việc lấy mẫu thực khoa lâm sàng gửi bệnh phẩm khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Yêu cầu: dịch hút phải cho vào lọ chứa chất chống đơng Chuyển đến phịng xét nghiệm giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học luôn: không cần cố định để tủ lạnh, sau làm phiến đồ Nếu để lâu, phải cho vào hộp chứa chất tiền cố định với thể tích tương đương Dung dịch tiền cố định: cồn etanol 50% dung dịch 2% carbowax cồn 50% với thể tích tương đương Kỹ thuật tập trung tế bào Dịch để tủ lạnh cho lắng cặn, gạn bỏ phần trong, lấy phần cặn cho vào ống nghiệm, đặt vào máy ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút x10 phút Gạn bỏ phần bên trên, lấy phần lắng cặn tế bào bên (1-2ml) Lắc máy trộn điện 4-5 giây lấy làm phiến đồ Làm phiến đồ Dùng ống hút hút dịch cặn trộn nhỏ lên phần trung tâm phiến kính ghi sẵn mã người bệnh (1-2 giọt/phiến kính cặn giàu tế bào; 3-4 giọt cặn lỏng, nhiều nước) Dùng phiến kính khác đặt lên cặn, dàn nhẹ, bệnh phẩm hai phiến kính để bệnh phẩm dàn mỏng, Cố định phiến đồ Các phiến đồ để khơ khơng khí 10-30 phút mơi trường sạch, không bụi Ngâm phiến đồ 10 phút cồn 95o trước nhuộm Nhuộm phiến đồ Theo phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen HE nêu mục nhuộm phiến đồ tế bào học) Nhận định kết Trên kính hiển vi quang học bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học IV KẾT QUẢ Các phiến đồ giàu tế bào, dàn mỏng, đều, tế bào khơng chồng chất lên HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 447 Hình thái tế bào bảo tồn tốt Các tế bào bắt màu rõ ràng, phân biệt rõ hình thái nhân bào tương V NHỮNG SAI SĨT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ Phiến đồ bị tế bào vào dịch cố định: cần để khô sau dàn 10-30 phút trước cố định cồn Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất dính (albumin) Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn tay Tế bào thối hóa, tan rã, khơng nhận định hình thái nhân bào tương: dịch lấy khỏi thể phải làm xét nghiệm phải tiền cố định Các tế bào bắt màu kém: cần cố định tốt nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt Nhuộm đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm cồn tuyệt đối Các tế bào bị kéo dài bị dập nát: cần dàn nhẹ tay 448 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 143 KỸ THUẬT TẾ BÀO HỌC DỊCH KHỚP I NGUYÊN TẮC Khi có tràn dịch, dịch chứa tế bào màng hoạt dịch, ổ khớp tế bào thành phần hữu hình khác từ tổn thương có ổ khớp bong vào dịch Vì vậy, cần lấy tế bào nhận định loại tế bào, hình thái, số lượng tế bào dịch, xếp tế bào, phiến đồ kính hiển vi quang học để chẩn đoán bệnh II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hóa chất Bơm kim tiêm dùng để chọc hút Găng tay vô trùng, trang Máy ly tâm Ống hút (pipet) nhựa ống hút tự động Phiến kính sạch, đầu mài mờ Giá để đựng phiến kính dàn bệnh phẩm Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút Dung dịch cố định bệnh phẩm (cồn etanol 95%) Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff Quik/HE/ PAP…) Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút Nước cất, nước để rửa thuốc nhuộm phiến kính Các dung dịch sát khuẩn Kính hiển vi quang học, bàn có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi viết Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực kỹ thuật, số lượng phiến đồ Sổ máy tính ghi lại thơng tin người bệnh, đặc điểm tổn thương, vị trí chọc lấy dịch kết chẩn đoán Các sọt rác đựng rác thải y tế, rác thải thường HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 449 III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Lấy bệnh phẩm Người bệnh nằm ngồi Bộc lộ vị trí khớp cần chọc hút Sát trùng vùng cần chọc hút cồn iod Chọc hút để lấy bệnh phẩm: tay phải cầm kim có gắn bơm tiêm, đâm qua da vào khe khớp, hút áp lực âm để dịch chọc chui vào lòng kim kéo dịch vào bơm tiêm Nếu dịch nhiều, tay giữ kim, tay tháo bơm tiêm khỏi kim, thay bơm tiêm khác để hút tiếp để kỹ thuật viên bơm dịch lọ chứa có sẵn chất chống đơng lắp lại vào mũi kim, hút tiếp khơng cịn dịch rút nhanh kim qua da (trước rút mũi kim khỏi khớp, không cần giải phóng áp lực âm đẩy dịch bơm tiêm trở lại khớp) Sát trùng lại vị trí chọc hút, băng lại Việc hút dịch lấy dịch bác sĩ lâm sàng thực gửi bệnh phẩm dịch chọc hút khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Yêu cầu: Dịch chọc hút nên gửi để tủ lạnh 4oC (không 48 giờ) Dịch phải đặt ống lọ có sẵn chất chống đơng Số lượng dịch: phải đủ (thường 25-100ml) Phải quan sát ghi rõ màu sắc, tính chất, số lượng dịch vào phiếu xét nghiệm Kỹ thuật tập trung tế bào Dịch để tủ lạnh cho lắng cặn, gạn bỏ phần trong, lấy phần cặn cho vào ống nghiệm, đặt vào máy ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút x10 phút Gạn bỏ phần bên trên, lấy phần lắng cặn tế bào bên làm phiến đồ Làm phiến đồ Lắc nhẹ, dịch cặn ống Dùng ống hút hút dịch cặn ống, nhỏ lên phiến kính (1-2giọt/phiến kính) ghi sẵn mã Người bệnh Dùng phiến kính khác áp giọt bệnh phẩm, dàn bệnh phẩm phiến kính để bệnh phẩm dàn mỏng, Cố định phiến đồ Các phiến đồ để khô 10-30 phút khơng khí mơi trường sạch, cố định cồn etanol 95% 10 phút nhuộm 450 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC Nhuộm phiến đồ Theo phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen HE (như nêu mục nhuộm phiến đồ tế bào học) Nhận định kết Trên kính hiển vi quang học bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học IV KẾT QUẢ Các phiến đồ giàu tế bào, dàn mỏng, đều, tế bào khơng chồng chất lên Hình thái tế bào bảo tồn tốt Các tế bào bắt màu rõ ràng, phân biệt rõ hình thái nhân bào tương V NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ Phiến đồ bị tế bào vào dịch cố định: cần để khô sau dàn 10-30 phút trước cố định cồn Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất dính (albumin) Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn tay Tế bào thối hóa, tan rã, khơng nhận định hình thái nhân bào tương: dịch lấy khỏi thể phải làm xét nghiệm phải tiền cố định Các tế bào bắt màu kém: cần cố định tốt nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt Nhuộm đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm cồn tuyệt đối Các tế bào bị kéo dài bị dập nát: cần dàn nhẹ tay HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 451 144 KỸ THUẬT TẾ BÀO HỌC DỊCH CÁC TỔN THƯƠNG DẠNG U NANG I NGUYÊN TẮC Trong dịch hút chứa tế bào bong từ tổn thương dạng u nang Vì vậy, cần lấy tế bào nhận định loại tế bào, hình thái, số lượng tế bào dịch, xếp tế bào, phiến đồ kính hiển vi quang học để chẩn đốn bệnh II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hóa chất Găng tay vơ trùng, trang Ống hút tự động Máy ly tâm lọ đựng dịch ly tâm Máy trộn (khuấy) Phiến kính sạch, đầu mài mờ Giá để đựng phiến kính dàn bệnh phẩm Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút Dung dịch cố định bệnh phẩm: + dung dịch carbowax 2% cồn + cồn ethanol 95o Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quik/HE/ PAP, …) Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút Nước cất, nước để rửa thuốc nhuộm phiến kính Các dung dịch sát khuẩn Kính hiển vi quang học, bàn có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi viết Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực kỹ thuật, số lượng phiến đồ Sổ máy tính ghi lại thông tin người bệnh, đặc điểm tổn thương kết chẩn đoán Các sọt rác đựng rác thải y tế, rác thải thường 452 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Lấy bệnh phẩm Việc lấy mẫu thực bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học bác sĩ lâm sàng gửi bệnh phẩm khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Yêu cầu: hút hết dịch u nang cho vào lọ chứa chất chống đông Chuyển đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học ngay: không cần cố định để tủ lạnh, sau làm phiến đồ Nếu để lâu, phải cho vào lọ chứa chất tiền cố định với thể tích tương đương Dung dịch tiền cố định: cồn ethanol 50% dung dịch 2% carbowax cồn 50% với thể tích tương đương Kỹ thuật tập trung tế bào Dịch để tủ lạnh cho lắng cặn, gạn bỏ phần trong, lấy phần cặn cho vào ống nghiệm, đặt vào máy ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút x10 phút Gạn bỏ phần bên trên, lấy phần lắng cặn tế bào bên (1-2ml) Lắc máy trộn điện 4-5 giây lấy làm phiến đồ Cố định phiến đồ Các phiến đồ để khơ khơng khí 10-30 phút môi trường không bụi Trước nhuộm, ngâm phiến đồ 10 phút cồn 95o Nhuộm phiến đồ Theo phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen HE (như nêu mục nhuộm phiến đồ tế bào học) Nhận định kết Trên kính hiển vi quang học bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học IV KẾT QUẢ Các phiến đồ giàu tế bào, dàn mỏng, đều, tế bào không chồng chất lên Hình thái tế bào bảo tồn tốt Các tế bào bắt màu rõ ràng, phân biệt rõ hình thái nhân bào tương V NHỮNG SAI SĨT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ Phiến đồ bị tế bào vào dịch cố định: cần để khô sau dàn 10-30 phút trước cố định cồn HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 453 Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất dính (albumin) Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn tay Tế bào thối hóa, tan rã, khơng nhận định hình thái nhân bào tương: dịch lấy khỏi thể phải làm xét nghiệm phải tiền cố định Các tế bào bắt màu kém: cần cố định tốt nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt Nhuộm đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm cồn tuyệt đối Các tế bào bị kéo dài bị dập nát: cần dàn nhẹ tay 454 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 145 KỸ THUẬT KHỐI TẾ BÀO DỊCH CÁC KHOANG CƠ THỂ I NGUYÊN TẮC Nhằm tập trung tế bào đơn lẻ, rải rác dịch thành khối đưa vào chuyển, đúc, cắt nhuộm giống quy trình mơ học thường qui II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 01 Phương tiện, hóa chất Lọ thủy tinh có nắp, thể tích 250 ml Ống nghiệm thủy tinh kích thước 10 x 1,6cm loại ống ly tâm thể tích 50ml Heparin (loại dung dịch tiêm) Cytorich Red, Mucolexx Formol đệm trung tính 10% Máy ly tâm, khn nhựa, phiến kính, giấy gói mơ học (loại khơng dính) Que gỗ nhỏ, bơng gịn (loại khơng thấm nước) Các dụng cụ, hóa chất kỹ thuật quy trình mơ học thường qui (nhuộm HE, PAS) Người bệnh Người bệnh có tràn dịch khoang thể (màng tim, màng phổi, màng bụng, dịch não tủy…), dịch rửa phế quản, nước tiểu, dịch u nang, dịch khớp Phiếu xét nghiệm Được điền đầy đủ thơng tin hành người bệnh (tên, tuổi, số giường, số phòng, khoa phòng), chẩn đốn lâm sàng, tóm tắt thơng tin lâm sàng cận lâm sàng, yêu cầu xét nghiệm khối tế bào dịch, ngày, lấy dịch, nhận xét đại thể (màu sắc, số lượng dịch, máu, nhày…) III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Lấy bệnh phẩm Lọ thủy tinh 250 ml tráng thành đáy lọ 1000 đơn vị heparin trước đổ dịch Heparin làm cho dịch máu không bị đông lại, không bị mắc kẹt tế bào vào cục máu đông Dịch lấy khoa lâm sàng và/hoặc khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Lấy dịch cho vào lọ thủy tinh Số lượng dịch tùy thuộc người bệnh, nên lấy từ 50 đến 250 ml để có nhiều mẫu bệnh phẩm (nếu điều kiện Người bệnh cho phép) HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 455 Đậy nắp, dán nhãn (tên, tuổi, khoa phịng, chẩn đốn lâm sàng) gửi khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Nếu điều kiện gửi ngay, bảo quản bệnh phẩm ngăn tủ lạnh 4oC Bệnh phẩm bảo quản không tuần Tiến hành kỹ thuật Đánh giá đại thể: màu sắc, số lượng dịch, có/khơng có nhiều máu chất nhày Nếu dịch có nhiều máu cho 1ml Cytorich red/50ml dịch, dịch có nhiều chất nhầy cho 1ml Mucolex/50ml dịch, lắc để khoảng phút cho tan bớt nhầy Nếu có máy ly tâm ống lớn 50 ml tiến hành bước ln Nếu khơng có máy ly tâm ống lớn để lọ dịch từ – 10 để tế bào lắng cặn xuống dưới, sau loại bỏ lớp dịch phía bề mặt, lắc cặn tế bào, chia vào ống nghiệm nhỏ (1,6 x 10cm), nút chặt không thấm nước tiến hành từ bước Lưu ý: dịch bảo quản khoa lâm sàng từ - 10 giờ, tế bào lắng xuống tiến hành thực kỹ thuật (như mô tả trên) + Bước 1: cho ống nghiệm chứa dịch vào máy ly tâm 10 phút với tốc độ 2.000 vòng/phút + Bước 2: loại bỏ lớp dịch phía để lấy lắng cặn tế bào cố định cặn tế bào formol đệm trung tính 10% tủ ấm 60oC, khoảng + Bước 3: ly tâm bệnh phẩm lần với tốc độ 2000 vòng/phút 10 phút cần (nếu bệnh phẩm hình thành khối quy trình chuyển trực tiếp từ bước sang bước 4) + Bước 4: loại bỏ formol ống vào lọ đựng nước thải + Bước 5: dùng que gỗ nhỏ để lấy khối tế bào khỏi ống đặt lên tờ giấy (loại giấy khơng dính có phịng xét nghiệm mơ bệnh học) Gói khối tế bào giấy đặt vào khuôn nhựa dán nhãn với tên mã số Người bệnh + Bước 6: cho khuôn nhựa có chứa khối tế bào tiếp tục thực bước vào quy trình mơ học thường qui + Bước 7: mảnh cắt từ khối tế bào có độ dày từ - µm, thường nhuộm Hematoxylin - Eosin nhuộm đặc biệt (PAS, mucicarmin ) nhuộm hóa mơ miễn dịch (nếu cần) IV KẾT QUẢ Khối tế bào lưu giữ loại tế bào gợi lại phần cấu trúc mô tốt so với phiến đồ, cho phép cắt nhiều mảnh cắt giống Nhuộm HE, nhuộm đặc biệt nhuộm hóa mơ miễn dịch cho phép chẩn đoán xác định nhiều loại tổn thương nấm, tổn thương ác tính định hướng nguồn gốc u nguyên phát V NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ Trong q trình làm kỹ thuật bị nhầm lẫn bệnh phẩm quy trình gồm nhiều bước, rơi vỡ ống xét nghiệm làm bệnh phẩm… Cần phải làm việc tập trung, ln ln có kiểm tra, đối chiếu để tránh sai sót khơng đáng có 456 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 146 KỸ THUẬT KHỐI TẾ BÀO BỆNH PHẨM CHỌC HÚT KIM NHỎ I NGUYÊN TẮC Nhằm tập trung tế bào đơn lẻ, rải rác bệnh phẩm chọc hút kim nhỏ thành khối, đưa vào chuyển, đúc, cắt nhuộm giống quy trình mơ học thường qui, tiết kiệm tối đa mẫu bệnh phẩm lấy khỏi thể người bệnh II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Phương tiện, hóa chất Ống nghiệm thủy tinh kích thước 10 x 1,6cm Formol đệm trung tính 10%, thrombin thạch agar 3% Máy ly tâm, khn nhựa, phiến kính, giấy gói mơ học (loại khơng dính) Que gỗ nhỏ, bơng gịn (loại khơng thấm nước), tủ lạnh, lị vi sóng Các dụng cụ, hóa chất kỹ thuật quy trình mô học thường qui (nhuộm HE, PAS…) Người bệnh Người bệnh thực thủ thuật chọc hút kim nhỏ (FNA) để lấy mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm tế bào Phiếu xét nghiệm Điền đầy đủ thơng tin hành người bệnh (tên, tuổi, số giường, số phịng, khoa phịng), chẩn đốn lâm sàng, tóm tắt thông tin lâm sàng cận lâm sàng, yêu cầu xét nghiệm khối tế bào bệnh phẩm chọc hút kim nhỏ (cellblock FNA); ngày, lấy bệnh phẩm III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Lấy bệnh phẩm Bệnh phẩm FNA chọc hút khoa lâm sàng khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Bệnh phẩm sau lấy bơm phần phiến kính để làm phiến đồ phết (1- phiến đồ), phần lại (dịch thừa lòng kim bơm tiêm) rửa 5-10 ml formol đệm trung tính 10% (dùng kim hỗ trợ cần), cho vào ống nghiệm HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 457 gửi hoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Các trường hợp chọc hút nhiều dịch làm kỹ thuật khối tế bào dịch (như phần trên) Lưu ý: khơng có formol đệm trung tính 10% để rửa dùng nước muối sinh lý thay thế, sau rửa xong, phải gửi bệnh phẩm khoa giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học Tiến hành kỹ thuật Bước 1: cho ống nghiệm chứa bệnh phẩm FNA vào máy ly tâm 10 phút với tốc độ 2000 vịng/phút Bước 2: loại bỏ lớp dịch phía để lấy phần lắng cặn tế bào, cố định cặn tế bào formol đệm trung tính 10% tối thiểu Bước 3: ly tâm bệnh phẩm lần với tốc độ 2000 vòng/phút 10 phút cần (nếu bệnh phẩm hình thành khối quy trình chuyển trực tiếp từ bước sang bước 4) Bước 4: loại bỏ formol vào lọ đựng nước thải Thêm vào lượng nhỏ thrombin thạch (agar) 3% (3g bột thạch hòa tan 100ml nước cất) nóng chảy (bằng lị vi sóng 10 giây nhiệt độ trung bình) vào ống nghiệm Chờ thrombin thạch đông lại Cho vào tủ lạnh để thạch (agar) đông nhanh (nếu cần thiết) Thrombin thạch (agar) có tác dụng gia cố độ vững cho khối tế bào Chú ý: phải đảm bảo chắn khơng có bọt khí cho thạch (agar) vào ống Bước 5: dùng que gỗ nhỏ để lấy khối tế bào khỏi ống đặt lên tờ giấy (loại giấy khơng dính có phịng xét nghiệm mơ bệnh học) Gói khối tế bào giấy đặt vào khuôn nhựa dán nhãn với tên mã số Người bệnh Bước 6: cho khn nhựa có chứa khối tế bào tiếp tục thực bước quy trình mơ học thường qui Bước 7: mảnh cắt từ khối tế bào có độ dày từ - µm nhuộm Hematoxylin - Eosin nhuộm đặc biệt (PAS, mucicarmin ) nhuộm hóa mô miễn dịch (nếu cần) IV KẾT QUẢ Khối tế bào lưu giữ loại tế bào gợi lại phần cấu trúc mô tốt so với phiến đồ, cho phép cắt nhiều mảnh cắt giống Nhuộm HE, nhuộm đặc biệt nhuộm hóa mơ miễn dịch cho phép chẩn đoán xác định nhiều loại tổn thương nấm, tổn thương ác tính định hướng nguồn gốc u nguyên phát V NHỮNG SAI SĨT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ Số lượng bệnh phẩm FNA thường ít, nên dùng ln ống nghiệm kích thước 1,6 x 10cm (loại vừa với giá ly tâm phòng xét nghiệm) để đựng dịch rửa lịng kim, tránh tình trạng phải đổi sang nhiều loại ống cho vừa máy ly tâm, gây bệnh phẩm trình làm kỹ thuật Trong trình làm kỹ thuật bị nhầm lẫn bệnh phẩm quy trình gồm nhiều bước, rơi vỡ ống xét nghiệm làm bệnh phẩm… Cần phải làm việc tập trung, ln ln có kiểm tra, đối chiếu để tránh sai sót khơng đáng có 458 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC ... 3 42 HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC PHẦN V CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC... THUẬT CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU - TẾ BÀO HỌC 321 Ghi mã số người bệnh vào phiến kính dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm Cắt lọc bệnh phẩm Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm,... nhuộm nhân tế bào tổn thương, nên có lợi cho việc nhận định cấu trúc mô học II CHUẨN BỊ Người thực Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01 Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01