BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thị Thu Quỳnh TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thị Thu Quỳnh TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Cán hƣớng dẫn Cán hƣớng dẫn TS Hoàng Thị Yến GS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết làm giàu axit béo không no omega-6, 7, từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp” tơi trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn TS Hoàng Thị Yến GS TS Đặng Diễm Hồng Số liệu kết nghiên cứu luận văn hồn tồn xác, trung thực Mọi thông tin nội dung tham khảo báo cáo đƣợc trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Trần Thị Thu Quỳnh LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trƣớc tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Hoàng Thị Yến - cán Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen GS TS Đặng Diễm Hồng - ngun trƣởng Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, lên ý tƣởng, định hƣớng nghiên cứu, tận tình bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths Lê Thị Thơm, Ths Lƣu Thị Tâm - cán Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hƣớng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ em thí nghiệm gặp khó khăn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý giá công tác nghiên cứu Sinh học Luận văn đƣợc thực kinh phí Đề tài “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất omega 6, 7, từ vi khuẩn tía quang hợp ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm dược phẩm” TS Hồng Thị Yến làm chủ nhiệm thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến Bộ Công thƣơng, năm 2017-2020 Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học Hợp tác quốc tế Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, hƣớng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức trình học tập Học viện Xin cảm ơn gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, hậu phƣơng vững giúp em có động lực học tập Em xin chân thành cảm ơn! Học viên Trần Thị Thu Quỳnh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp Axit béo không bão hào MUFA Monounsaturated fatty acid PUFA Polyunsaturated fatty acid SFA Saturated fatty acid Axit béo bão hịa UFA Unsaturated fatty acid Axit béo khơng bão hòa OD Optical density Mật độ quang TFA Total fatty acid Axit béo tổng số SKK nối đôi Axit béo khơng bão hịa đa nối đơi Sinh khối khô ω Omega Omega HUFA Highly unsaturated fatty acid Axit béo khơng bão hịa cao EPA Eicosapentaenoic acid Eicosapentaenoic acid DHA Docosahexaenoic acid Docosahexaenoic acid DPA Docosapetaenoic acid Docosapetaenoic acid ARA Arachidonic acid Arachidonic acid ACP Acyl carrier protein Protein mang acyl DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kim loại nặng mẫu dầu sinh học 36 Bảng 2.2 Phƣơng pháp xác định tiêu vi sinh vật có dầu sinh học 37 Bảng 3.1 Hàm lƣợng sinh khối khô, lipid omega-3, 6, 7, VKTQH nuôi bể quang sinh thể tích 1m3 38 Bảng 3.2 Thành phần axit béo hỗn hợp MUFAs PUFAs với tỷ lệ TFA: urê khác 46 Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs số iot mẫu thu đƣợc sau lần tạo phức với urê 50 Bảng 3.4 Phân tích tiêu cảm quan, hóa lý mẫu dầu sinh học omega-6, 7, 54 Bảng 3.5 Kết phân tích hàm lƣợng omega-6, 7, 55 Bảng 3.6 Kết phân tích dƣ lƣợng urê, kim loại nặng dầu sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 56 Bảng 3.7 Kết phân tích tiêu vi sinh vật 56 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Tổng hợp axit béo 17 Hình 1.2 Phản ứng ester hóa dầu mỡ 21 Hình 3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 40 Hình 3.2 Ảnh hƣởng chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 41 Hình 3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ sinh khối/ dung môi lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 42 Hình 3.4 Ảnh hƣởng thời gian lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 43 Hình 3.5 Ảnh hƣởng điều kiện khuấy trộn lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 43 Hình 3.6 Hiệu suất tách chiết SFAs (A) MUFAs, PUFAs (B) tỷ lệ TFA: urê khác 45 Hình 3.7 Hiệu suất tách chiết SFAs (A) MUFAs, PUFAs (B) tỷ lệ TFA: urê : methanol khác 47 Hình 3.8 Hiệu suất tách SFAs (A) MUFAs, PUFAs (B) nhiệt độ khác 49 Hình 3.9 Sơ đồ quy trình tách chiết làm giàu axit béo không no omega-6, 7, từ sinh khối VKTQH 51 Hình 3.10 Hình ảnh minh họa trình làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, phƣơng pháp tạo phức urê 53 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 1.1.1 Giới thiệu lipid 1.1.2 Giới thiệu MUFAs PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) 1.1.3 Các nguồn cung cấp omega-6, 7, 9 1.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH) 13 1.2.1 Định nghĩa 13 1.2.2 Sinh thái học VKTQH 14 1.2.3 Ứng dụng VKTQH 14 1.2.4 Khả sinh tổng hợp axit béo không no VKTQH 17 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DẦU 19 1.3.1 Các phƣơng pháp tách chiết dầu 19 1.3.2 Các phƣơng pháp làm giàu 23 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU OMEGA-6, 7, TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 25 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt nam 27 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29 2.2 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 29 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1 Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối để tạo hỗn hợp axit béo dạng methyl ester 30 2.3.2 Tối ƣu thông số trình tách chiết TFA 31 2.3.3 Làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, dầu vi khuẩn tía phƣơng pháp tạo phức với ure 32 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích thành phần axit béo dầu 33 2.3.5 Phƣơng pháp xác định trạng thái cảm quan 34 2.3.6 Phƣơng pháp xác định số axit 34 2.3.7 Phƣơng pháp xác định số iot 35 2.3.8 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng urê 35 2.3.9 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kim loại nặng dầu sinh học 36 2.3.10 Phƣơng pháp xác định vi sinh vật dầu sinh học 37 2.3.11 Phƣơng pháp xử lý thống kê 37 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 HÀM LƢỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ TÍCH 1M3 38 3.2 TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ SINH KHỐI KHÔ VKTQH 39 3.2.1 Kết xác định ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng 39 3.2.2 Kết xác định ảnh hƣởng chất xúc tác 40 3.2.3 Kết xác định ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi (khối lƣợng/ thể tích) 41 3.2.4 Kết xác định ảnh hƣởng thời gian phản ứng 42 3.2.5 Kết xác định ảnh hƣởng điều kiện khuấy trộn 43 3.3 TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI URÊ 44 3.3.1 Kết xác định ảnh hƣởng tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trình làm giàu hỗn hợp axit béo 44 3.3.2 Kết xác định ảnh hƣởng tỷ lệ TFA: urê: methanol trình làm giàu hỗn hợp axit béo 47 3.3.3 Kết xác định ảnh hƣởng nhiệt độ kết tinh trình làm giàu hỗn hợp axit béo 48 3.3.4 Kết nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi omega-6, 7, việc tạo phức lần với urê 49 3.4 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, TỪ SINH KHỐI VKTQH 50 3.5 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DẦU SINH HỌC OMEGA-6, 7, TÁCH CHIẾT ĐƢỢC SAU QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU 54 3.5.1 Kết xác định tiêu cảm quan, hóa lý 54 3.5.2 Kết xác định thành phần axit béo 55 3.5.3 Kết xác định dƣ lƣợng urê, kim loại nặng 55 3.5.4 Kết tiêu vi sinh vật có dầu sinh học omega-6, 7, 56 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Clean Technologies and Environmental Policy https://doi.org/10.1007/s10098-020-01966-0 ORIGINAL PAPER Sustainable cultivation via waste soybean extract for higher vaccenic acid production by purple non‑sulfur bacteria Thị Yến Hoàng1 · Kuan Shiong Khoo2 · Hà Lại Thị Ngọc3 · Quỳnh Trần Thị Thu1,4 · Tuyên Đỗ Thị1 · Hang Đinh Thị Thu4 · Ha Chu Hoàng1 · Sasikala Chinthalapati5 · Chyi‑How Lay6 · Pau Loke Show2 Received: 11 July 2020 / Accepted: August 2020 © Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature 2020 Abstract The biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 was optimized via response surface methodology (RSM), and the optimal medium components such as waste soybean extract, yeast extract, and Mg2+ were determined using “one-singlefactor-at-one-time” approach RSM used a three-factor and central composite rotatable design consisting of 21 experimental runs conducted to optimize the final medium components The optimized conditions were as follows: 2.723 g/L waste soybean extract, 3 g/L yeast extract, and 22 mg/L M g2+ Under optimized conditions of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6, the biomass production was 4.665 ± 0.326 g/L, which was 5.7-folds higher than that under non-optimized conditions Besides that, the total lipid production was 5.7 times higher corresponding to the increase in biomass productivity In addition, there was a change in total fatty acid composition with omega and omega which increased from 55.4 to 62.21 and from 3.4 to 9.41, respectively, while omega decreased from 9.79 to 4.54 and omega could not be detected This exploration of waste soybean under optimized conditions would be a significant impact for the higher biomass production from Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 Graphic abstract Extended author information available on the last page of the article 13 Vol.:(0123456789) T. Y. Hoàng et al Keywords Rhodovulum sulfidophilum · Vaccenic acid · Validated model · Biomass production · Waste soybean extract Introduction Purple non-sulfur bacteria (PNSB) are a physiological group of bacteria distributed among either alpha or beta-proteobacteria that can carry out photosynthesis in the absence of oxygen production (Imhoff 1989) PNSB are the most diverse and most useful group of bacteria for various biotechnological applications like single-cell protein (SCP), bioactive compounds, and wastewater treatment and especially for functional food formation compounds (Sasikala and Ramana 1995) Functional food rich with unsaturated fatty acids (e.g., omega 3, 6, 7, 9) is beneficial to human health It is proven to be proficient of antioxidant, anti-inflammatory, and immune system modulator, and strengthens the cardiovascular system and mucous membrane tissue regenerator (Innes and Calder 2020; Koyande et al 2019) Many studies have positively correlated essential fatty acids with reduction of cardiovascular morbidity and mortality, infant development, cancer prevention, optimal brain and vision functioning, arthritis, hypertension, diabetes mellitus, and neurological/neuropsychiatric disorders (Kaur et al 2014; Kim et al 2013) PNSB are particularly rich in omega fatty acids also known as vaccenic acid (65–82% of total fatty acids) which has a crucial role in maintaining the health of skin and mucous membranes (Djoussé et al 2012) PNSB phototropic has been explored mainly for the production of bioenergy such as hydrogen and polyhydroxybutyrate (PHBT), along with wastewater treatment (Khatipov et al 1998; Kim et al 2006; Wu et al 2012) Previous study by Kim et al (2013) has shown the feasibility for microbial fatty acid production of photosynthetic bacteria, Rhodobacter sphaeroides KD131 cultivated in a continuous-flow, membrane-coupled bioreactor with lactate as carbon source with a cell productivity of 1.9 g dcw/L/d and fatty acid productivity of 665 mg FA/L/d, respectively The fatty acid produced was around 35% dcw and mainly consisted of vaccenic acid (Kim et al 2013) However, a previous study utilizes synthetic cultivation media which is not very economically viable The bacteria biomass production study can be performed via one-factor-at-a-time approach (OFAT) and response surface methodology (RSM) (Irfan et al 2014; Kong et al 2004) OFAT, also known as a single factor experiment, is a classical method in which only one factor is variable at one time while all others are kept constant This approach has several drawbacks: (i) it is time-consuming; (ii) there is an inability to evaluate the interaction between the variables; (iii) it is costly; and (iv) it is less effective than other methods (Khoo et al 2020; Torres-Acosta et al 2019) RSM is a statistical method which uses the data from experiments to 13 build and to solve multi-variable equations This approach overcomes the disadvantages of the OFAT method and has been applied in different kinds of research including microbiological biomass production In this study, we report the omega fatty acid production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 in a culture medium with waste soybean extract as substrate Based on our previous study, waste soybean extract medium was selected to replace over synthetic cultivation medium, which resulted in rapid biomass growth and highest lipid accumulation specifically unsaturated fatty acid (i.e., omega 6, 7, 9) production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 (Hoang et al 2019) In order to utilize Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for high biomass production, extraction of unsaturated fatty acid and other biotechnology applications, this study focused on the selection of suitable medium components via OFAT for the biomass production and the selected medium composition was further optimized using RSM to achieve the highest biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for various biotechnology applications Materials and methods Type of microorganism strain Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 used throughout this study was isolated from the coastal area of Haiphong, Vietnam and identified as Rhodovulum sulfìdophilum by using morphological and physiological properties and 16S rRNA gene sequence analysis (Hoang et al 2019) It was maintained in DSMZ-27 medium at 4 °C and lyophilized and kept at the Key Laboratory of Gene Technology, Biotechnology Institute, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Cultivation media composition The DSMZ-27 medium (pH 7.0) was used for the cultivation of the bacterium DSMZ-27 medium composed the following components per liter of distilled water: 0.3 g yeast extract; 0.5 mL ethanol; 1 g succinate; 0.5 g acetate; 5 mL ferric citrate from 0.1% (w/v) stock; 0.5 g K H2PO4; 0.4 g MgSO4·7H2O; 0.05 g C aCl2·2H2O; 0.4 g N H4Cl; 25 g NaCl; trace element solution SL6; and 1 mL vitamin B12 solution (filter sterilized) Trace element solution SL6 contains ( l−1) 1.8 g FeCl2·4H2O; 0.25 g CoCl2·6H2O; 0.01 g NiCl·6H2O; 0.01 g CuCl2·5H2O, 0.07 g MnCl2·4H2O; 0.1 g ZnCl2; 0.5 g H3BO3; 0.01 g N a2SiO3·5H2O; 0.03 g N a2MoO4·2H2O Vitamin B12 solution was added after autoclaving stock solution Sustainable cultivation via waste soybean extract for higher vaccenic acid production by purple… and was used as Basal medium The stock solution was prepared by putting 10 g of waste soybean to cloth and tightly sealed, then the stock solution is put into 100 mL distilled water, sterilized at 121 °C for 30 min Primary experiments: selection of medium components for biomass production The bacterium was cultivated in soybean extract concentration ranging from to 5 g/L and added 25 g/L NaCl to evaluate the effect of stock solution concentration on the growth of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 The optimal concentration stock solution was added with carbon and nitrogen sources separately such as malic acid, acetate, yeast extract, and glutamate (2 g/L) to assess the effect of different carbon and nitrogen sources The yeast extract concentration (range from to 5 g/L) and M g2+ (8–22 mg/L) were examined by using OFAT to obtain the highest biomass production For each experiment, the culture was grown in a 13-mL penicillin tube composed of 10 mL of stock solution medium, along with the indicated sources and inoculated bacteria at an exponential phase with an initial concentration of 160 mg/L (Hoang et al 2019) Bacterium and culture medium were mixed uniformly by a shaker Response surface methodology procedure for biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 Response surface methodology (RSM) was performed using a three-factor and central composite rotatable design (CCRD) consisting of 21 experimental runs with ( 23) factorial points, (2 × 3) axial points (i.e., two axial points on the axis of each design variable at a distance of 1.68 from the design center, (23)1/3), and replicates at the center points, maximal and minimal factorial points The design variables were the waste soybean extract concentration (g/L; X1), the yeast extract concentration (g/L; X2), and the Mg2+ concentration (mg/L; X3) Each variable was coded at five levels − 1.68, − 1, 0, 1, and 1.68 The conversion of real values (Xi) to coded values (xi) was done by using the following equation xi = (Xi – X0)/ΔXi, where X0 is the real value of the independent variable i at the center point and ΔXi is the step change of Xi corresponding to a unit of variation In the present study, X0 and ΔXi were determined in the section of primary experiments The experimental data were fitted to the following second-order polynomial model: Y = 𝛽0 + ∑ i=1 𝛽i Xi + ∑ i=1 𝛽ii Xi2 + ∑ ∑ 𝛽ij Xi Xj i=1 j=2 where Y is the response or dependant variable (∆OD800 of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 culture), β0, βi, βii, and βij are the regression coefficients for the intercept, linear, quadratic, and interactions terms, respectively, and Xi and Xj are the real values of variables For all runs, the biomass production was performed in a 13-mL penicillin tube containing 10 mL of medium and inoculated bacteria at an exponential phase with an initial concentration of 160 mg/L Bacterium and medium were mixed uniformly by a shaker After 4 days of anaerobic incubation at a temperature within 30–32 °C and light intensity of 4 lux (tungsten light bulbs), biomass production was estimated either by cell density at ∆OD800 or dried biomass (dcw) The optimal conditions for biomass production (∆OD800) were determined using the JMP 10 software The software was set to have the maximized desirability which was the highest biomass quantity Four experimental replicates were performed at the optimized conditions The experimental and predicted values were compared in order to validate the model Determination of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 biomass productivity The productivity of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 was determined by measuring the cell density at OD800 using UV–Vis spectrophotometer and by dry biomass quantity (g/L) (Cai et al 2012; Li et al 1995) Dry biomass (g/L) was determined as follows: after 4 days of incubation, Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 cells were harvested by the centrifugation method at 8000 rpm for 15 min at 4 °C The pellet was re-suspended in 10 mL distilled water and centrifuged again for washing The washed cells were then lyophilized until a constant weight is obtained The dry biomass was used to extract lipids and subjected to further analysis of fatty acid composition Determination of total lipid extraction Lipid extraction was performed using the modified methodology of Bligh and Dyer (1959) 100 g of dry biomass was mixed with 300 mL mixture of dichloromethane and methanol (2:1, v/v) was carried out for 2 h integrated with ultrasonication for cell membrane disruption A further dilution was made with 100 mL of dichloromethane and 100 mL of water After the separation of the two layers, the upper aqueous layer containing methanol, water, and non-lipid compounds was discarded and the lower dichloromethane layer was filtered using a filter paper containing anhydrous sodium sulfate and collected in pre-weighed glass vials This procedure was repeated for the extraction of lipids remaining in the sample Both the organic phases containing the lipid extract was vacuum dried to remove the excess solvent until a constant weight was attained 13 Fatty acid analysis Fatty acid analysis of non-optimized biomass was conducted at Royal Research Laboratories, Secunderabad, India Biomass was methylated, separated, and identified according to the instructions for the Microbial Identification System (Sasser 1990) (Microbial ID; MIDI; version 3 V 6.0-2007; RTSBA6 database; 6850 series II gas chromatograph, Olympus) Fatty acid analysis of the optimized biomass was determined by gas chromatography (GC) and a subsequent ISO draft standard method in Laboratory of Biochemistry, Institute of Natural Products Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology [Animal and Vegetable Fats and Oils—Preparation of Methyl Esters of Fatty Acids; Standard No 5509; ISO: Geneva, Switzerland, 1988] Approximately 10 mg of oil was dissolved in 1 mL of petroleum ether, followed by the addition of 25 µL of 2 M sodium methanolate methanol solution and the mixture was agitated vigorously for 1 min About 20 µL of water was added, and after centrifugation the aqueous phase was removed Then, 20 µL of methyl orange in 0.1 N HCl was added as a pH indicator The mixture was agitated carefully, and different derivatives were analyzed by a Hewlett–Packard Gas Chromatography Instrument Model 5890 Series II/5989 A80 equipped with a 0.25mm ZB-1 fused-silica capillary column (30mì0.25àm i.d.; Phenomenex, Torrance, CA) The carrier gas is composed with helium at a flow rate of 1.0 mL/min Statistical analysis The experimental results were analyzed using the SAS 9.1 software (SAS Institute, Cary, NC) In the primary experiments, the selection of suitable medium components was optimized using one-factor-at-a-time (OFAT) and the results Fig. 1 Effect of waste soybean extract concentration on the growth of HPB.6 13 T. Y. Hoàng et al were expressed as mean ± standard deviation One-way analysis of variance (ANOVA) and Duncan’s multiple range test were used to determine the differences among the means P-values (