KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (CND và BC) nghiên cứu một số tính chất của nấm men phân lập từ hạt kefir

LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới cô giáo T – Giảng viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội TS Đàm Thanh Xuân, người ln quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ đường học tập, nghiên cứu khoa học Đồng thời, xin cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh tồn thể thầy, giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho q trình hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tồn thể gia đình, thầy giáo trường tất bạn bè động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Hà Nội, tháng năm Sinh viên ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử dùng sản phẩm sữa lên men 1.2 Hạt kefir 1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir 1.2.2 Đặc điểm hạt kefir 1.2.3 Tác dụng hạt kefir 1.3 Nấm men 10 1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 10 1.3.2 Ứng dụng nấm men 12 1.3.3 Các cơng trình nghiên cứu nấm men hạt kefir 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 15 2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 15 2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 15 2.1.3 Môi trường 15 ụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 16 2.2.2 Khảo sát số đặc tính probiotic 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 .17 p 17 18 18 2.3.5 Phương 18 .18 19 .19 2.3.9 Phư 20 20 2.3.11 20 21 22 2.3.14 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23 23 ấm men từ hạt kefir Hà Lan 23 ều kiện hô hấ 3.1.3 3.1.4 ồn ệt độ 3.2 Khảo sát số đặ 3.2.1 Khả 25 29 30 .32 ẩn có hại .32 3.2.2 Khả chịu pH acid dày .35 3.2.3 Khả cộng sinh với vi khuẩn lactic .36 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lactobacillus L Streptococcus Str Lactococcus Lc Leuconostoc Leuc Kluyveromyces Kl Saccharomyces S Candida C Debaryomyces D Pichia P Issatchenkia I Yarrowia Y Torulaspora T Rhodosporidium R Bacillus B Escherichia E KHV DĐVN MT1 MT2 MT3 Ngân hàng giống tế bào Hoa Kỳ (The American Type Culture Collection) ATCC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các vi sinh vật có hạt kefir Bảng 2.1: Nguyên liệu, hóa chất 15 16 Bảng 2.2: Bảng 3.1: Ảnh hưởng điều kiện hô hấp đến tăng sinh khối 26 Bảng 3.2: Ảnh hưởng hô hấp đến khả tiêu thụ đường 26 Bảng 3.3: So sánh khả sinh ethanol nấm men kefir với S cerevisiae tron 28 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến tăng sinh khố 30 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng nấm men kefir 31 Bảng 3.4: Bảng 3.5: 32 B subtilis kefir kefir Bảng 3.10: 34 36 37 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang 1.1: H - 24 h 3.2: 24 24 27 B subtilis B subtilis 34 34 : 35 : 36 2h 36 ĐẶT VẤN ĐỀ s (FAO/WHO) năm 2002 cho sức khỏe củ chủ” [15] t Baccillus S cerevisiae & S boulardii Nghiên cứu kefir c CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử dùng sản phẩm sữa lên men Sữa chất tiết giàu dinh dưỡng động vật có vú Giá trị dinh dưỡng tự nhiên sữa khuyến khích sử dụng cho người từ buổi đầu xã hội loài người Điều lồi động vật hóa Các sản phẩm sữa lên men đề cập sớm tiếng Phạn cơng trình Kito giáo Ngày nay, vùng Cận Đơng Bắc Phi có nhiều thực phẩm sữa lên men truyền thống, biến thể sữa chua mát [22] Tầm quan trọng sữa chua mát văn hóa ẩm thực Hy Lạp (1.500 năm trước Công Nguyên) Rome (750 năm trước Công Nguyên) nhà nghiên cứu đề cập đến Sự xuất chứng khảo cổ tìm thấy Windmill Hill Dorset, Anh (1.800 năm trước Công Nguyên) cho biết mát làm Anh trước có xuất người La Mã [22] Yogurt sản phẩm sữa chua biết đến nhiều sản phẩm phổ biến khắp giới Yogurt có nguồn gốc từ Bungari [13] Người dân Thracia cổ đại (các cư dân sớm vùng đất Bungari) thêm sữa lên men vào sữa tươi đun sôi để tạo sản phẩm gọi „prokish‟ hay „kvasenomliako‟ Trong kỉ 11, sữa chua Bungari đổi tên thành „yogurt‟ „Yogurt‟ từ có nguồn gốc Thổ Nhĩ Kỳ, đó: „yog‟ nghĩa dày cịn „urt‟ sữa tức sữa dày Ở Tây Âu, yogurt đề cập lần Pháp người bác sĩ Thổ Nhĩ Kỳ chữa khỏi bệnh tiêu chảy cho vua Pháp Francois sữa chua cừu Kể từ đó, yogurt sử dụng rộng rãi Tây Âu Nhà sinh vật học tiếng người Nga Ilya Metchnikoff người cơng bố tính chất khoa học yogurt [17] Ông cho vi khuẩn yogurt ức chế vi khuẩn gây bệnh không mong muốn ruột người, tiêu thụ sữa lên men với Lactobacilli giúp kéo dài tuổi thọ [29] Sữa lên men thường phân thành bốn loại: (1) Loại tính acid kiêm rượu kefir, koumiss (rượu sữa ngựa); (2) Loại tính acid cao sữa chua Bungari; (3) Loại tính acid trung bình sữa acidophilus ; (4) Loại tính acid thấp cultured buttermilk (sữa tươi có chất béo nhỏ 5% lên men) [22] sản phẩm sữa lên men yogurt, lassi, sh ) [29] Các sản phẩm sữa lên men ngày ưa chuộng giới ngồi việc cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu, chúng cịn có tác dụng chữa bệnh Một sản phẩm quan tâm sữa chua kefir ích lợi mà mang lại Kefir sản phẩm làm từ hạt kefir; vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ nấm men Kefir khác với sản phẩm sữa lên men khác có xuất nhóm vi sinh vật hạt kefir, thu hồi để lên men tiếp Các vi sinh vật hạt kefir thường tạo acid lactic, chất ức chế phát triển vi sinh vật gây hỏng vi sinh vật gây bệnh [2] Mặc dù, giới hạt kefir phổ biến Việt Nam cịn biết đến 1.2 Hạt kefir 1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir Cách hàng nghìn năm, hạt kefir biết đến thứ nấm dùng chữa bệnh, xuất xứ từ cách nuôi riêng tu sĩ Ấn Tạng Hạt kefir làm biến đổi sữa nhờ hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn nấm men chứng minh có lợi cho sức khoẻ Dân miền núi Caucasus thuộc nước Xô Viết cũ - nguyên quán Kefir - bào chế từ sữa sinh vật khác Kefir lên men tự nhiên túi da thú bồn gỗ sồi Việc tiêu thụ thường xuyên Kefir giúp họ tránh bệnh ung thư, lao, dày… họ thọ đến trung bình 110 tuổi Núi Caucasus vùng trái đất mà người giữ sức khỏe lứa tuổi Đến cuối kỉ 19, Kefir trở thành sản phẩm quen thuộc người dân nước Đông Âu (Nga, Ucraina, Balan, Czech, Hungari ) nước vùng Scandinavia Đầu kỉ 20, Kefir sản xuất với quy mô công nghiệp [14], [8] Hiện nay, kefir sản xuất với nhiều tên gọi: Kephir, Kiaphur, Kefer, Kepi hay Kippi… [21] 1.2.2 Đặc điểm hạt kefir Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng khơng ổn định thường kết thành chùm với với đường kính trung bình 0,3÷3,5 cm Hạt kefir không tan nước hầu hết dung môi Khi thả vào sữa, hạt kefir thấm nước (sữa) trở nên màu trắng đục [22], [13] Quan sát hình dạng hạt kefir mắt thường cho thấy hình dạng khác hạt từ dạng mỏng phẳng đến dạng cuốn, cuộn lại hay dạng giống hoa súp lơ [27] 1.1: H [27] Cịn kính hiển vi điện tử quét cho phép thấy kết hợp vi sinh vật hạt kefir Hệ vi sinh vật phần bên hạt chi phối trực khuẩn (ngắn dài cong) kết hợp với tế bào nấm men (dạng chanh) Các tế bào vi sinh vật bên so với phần bên ngồi hạt (hình 2) Các sợi ngun liệu nhỏ (có thể kefiran polysaccharide) quan sát thấy phần bên phần bên hạt [24] : (-): khơng xuất vịng ức chế B subtilis E coli B subtilis E coli Tuy nhiên, ho izobutyric, axit lactic, malic, citric… B subtilis B subtilis [2 Shigella, Salmonella… B subtilis b) Mục đích: Tiến hành: 90 B subtilis – ATCC6633 - Kết quả: trên B subtilis B subtilis B subtilis D (mm) TB 15,7 15,8 14,9 15,5 9,7 9,5 9,4 9,53 B subtilis C t : 3.2.2 Khả chịu pH acid dày Mụ Tiến hành: - Nhân n kefir MT1, - 50 v/p X nh Kết quả: : sau 2h TB 76,9 2,9 79,7 3,2 91,3 4,0 82,6 3,4 y: pH 1,2 -2 L acidophilus [15] n 3.2.3 Khả cộng sinh với vi khuẩn lactic a) K kefir T1 C/20p) C/24h Lượng sinh khối (g) % tăng sinh khối Sau 24h 10g Môi Lần Lần Lần TB 10,83 10,71 10,70 10,75 7,5% 9,21 9,00 8,90 9,04 -9,6% n -7% [28 ] - -9,6% T g kefir b) Mụ c Tiến hành: Trong ống nghiệm, ống 5ml sữ - Hạt kefir - Nấm men kefir & L acidophilus ( - S cerevisiae & L acidophilus - L acidophilus ( - NMk+L.a.) S+L.a.) Nấm men kefir ( k) 0 Tất ống ni điều kiện kị khí (tủ ấm) 37 C trừ 30 C Sau 24h, quan sát khả đông tụ sữa, đo pH thị vạn quan sát khả hạt Kết quả: Bả Ống nghiệm NMk+L.a NMS+L.a L.a NMk Khả đông tụ sữa +++ ++ ++ + - pH 4-5 5-6 5-6 5-6 6-7 - - Khả hạt (+) xảy tượng (-) không xảy tượ Nhận xét: , nhiều dấu (+) tượng xảy mạnh ữa có pH= 6,5-6,8 Sữa đơng tụ (sự đơng tụ casein) tác nhân acid làm giảm pH điểm đẳng điện casein pI 5,1- 5,3 enzym renin Tác nhân acid acid lactic sinh vi khuẩn bổ sung vào sữ đông tụ làm giảm pH xuố - đơng tụ ngồi acid lactic sinh hệ vi sinh vật hạt kefir gồm nhiều vi khuẩn lactic làm giảm pH xuống 4-5 cịn có enzym renin sinh Kl lactis [33], thành phần hệ vi sinh vậ đông tụ sữa ần không thay đổi 6-7 điều chứng tỏ nấm men lactis giống Kl ơng tụ dự đốn diện nấm men tạo vitamin kích thích tăng trưởng vi khuẩn lactic [18] Tuy nhiên, điều kiện quan sát mắt thường đo pH thị vạn nên có hạn chế khơng đánh giá tác động khác nấm men kefir S cerevisiae lên vi khuẩn lactic L acidophilus khơng có hạt điều khơng có diện L kefiranofaciens xác định sản xuất polysaccharide chính, nằm sâu bên hạt, định đến hình thành hạt kefir  : probiotic B subtilis nên L acidophilus, Tuy nhiên, L acidophilus CO2 S cerevisiae Nghiên cứu subtilis B ên E coli L acidophilus, Định tên chủng nấm men kefir phân lập - m, tr 74-82 138 Lê Thu Hương (1997), Phân lập tuyển chọn nấm men Việt Nam có tác dụng kháng khuẩn Trần Việt Hưng & Diệu Phương (2010), “Dược chất từ nấm men”, 24-39 men, - Trần Thị Ánh Nguyệt (2006), Bước đầu nghiên cứu khả nhân sinh khối hạt kefir ứng dụng hạt kefir chế biến kefir sữa dừa, Luận văn kỹ sư nghành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Lương Đức Phẩm (2009), Nấm men công nghiệp, 5, 32-40, 69, 50,103, 300 10 Lê Xuân Phương (2006), 57-61 11 tr 37-40, 50-51, 42-47, 12 Nguyễn Kim Minh Tâm (2003), Xây dựng qui trình nuôi cấy thử tác dụng trị loạn khuẩn nấm men Saccharomyces boulardii, Trường ĐH Y dược TPHCM 13 Lâm Xn Thanh (2008), Giáo trình cơng nghệ sản phẩm sữa, r 132 14 Đặng Thị Cẩm Tú (2005), Nghiên cứu chế biến sữa Kefir, Luận văn kỹ sư ngành Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học An Giang 15 Thanh Xuân (2011), , 16 Anine Schoevers and Trevor J Britz (2003), “Influence of different culturing conditions on kefir grain increase”, International Journal of Dairy Technology, 56(3), pp 183-187 17 Ch.Tchomakov (2010),“Bulgarian sour milk – a unique probiotic”, Chemical Engineering Institute in Sofia 18 Edward Franworth (2006), “Kefir- a complex probiotic”, Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods, 2(1), pp 1-17 19 F P Rattra, M J O‟Connell (2011), “Kefir”, Encyclopedia of Dairy Science, pp 518-524 20 Gorsek A., Zajsek K (2010), “Influence of temperature variations on ethanol production by kefir grains – mathematical model development”, Chemical engineering transactions, 20, pp 181-186 21 His-Chia Chen, Sheng-Yao Wang, Ming-Ju Chen (2008), “Microbiologica study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and cultureindependent methods”, Food Microbiology, 25( 3), pp 492-501 22 Jillian Elizabeth Powell (2006), Bacteriocins and bacteriocin producer prensent in kefir and kefir grains, Master of science in food science, University of Stellenbosch, South Africa 23 Jyoti Prakash Tamang & Kasipathy Kailasapathy (2010), Fermented Foods and Beverages of the World, Taylor & Francis Group, USA, pp 16,18,53 24 Karina Teixeira Magalhães, Gilberto Vinícius de Melo Pereira, Cássia Roberta Campos, Giuliano Dragone, Rosane Freitas Schwan (2011), “Brazilian kefir: structure, microbial communities and chemical composition”, Braz J Microbiol, 42(2) 25 Liu Hui, Li Ping-Lan, Gong Pin, Wang Lei (2005), “Study on the Isolation Method and Yeast Fermentation Capability of Kefir Grains”, Food Science, 26(5), pp 97-100 26 M.G.C.P Miguel, P.G Cardoso, K.T Magalhães-Guedes, R.F Schwan (2013), “Identification and assessment of kefir yeast potential for sugar/ethanol-resistance”, Braz J Microbiol, ISSN 1678-4405 27 Marshall V.M, Cole W.M, Brooker B.E (1984), “Observations on the structure of kefir grains and the distribution of the microflora”, Applied Bacteriology, 57(3), pp 491- 497 28 Neda Habibi, Sabihe Soleimanian-Zad, Mahmoud Sheikh Zeinoddin (2011), “Optimization of Kefir Grains Production by Using Taguchi Technique and Mini-Fermentation”, World Applied Sciences, 12(5), pp 613-618 29 Parmjit S.Panesar (2011), ”Fermented Dairy Products: Starter Cultures and Potential Nutritional Benefits”, Food and Nutrition Sciences, 2(1), pp 47-51 30 Plessas S, Pherson L, Bekatorou A, Singh-Nee Nigam, Poonam & Koutinas, AA (2005), “Bread making using kefir grains as baker's yeast”, Food Chemistry, 93(4), pp 585-589 31 Semih Otles, Ozlem Cagindi (2003), “Kefir: A Probiotic Dairy-Composition, Nutritional and Therapeutic Aspects”, Pakistan Journal of Nutrition, (2), pp 54-59 32 Vardjan T, Rogelj I, Canžek Majhenič A (2013), “Characterization and stability of lactobacilli and yeast microbiota in kefir grains”, Dairy Science, 96(5), pp 2729 – 2736 Website 33 http://en.wikipedia.org/wiki/Rennin [29] STT Tên sản phẩm Nguồn sữa Thành phần vi sinh vật Lb lactis ssp lactis Lb delbrueckii ssp bulgaricus Lb plantarum, Str lactis S thermophilus, S cremoris Lb acidophilus S thermophilus Lb bulgaricus S lactis ssp diacetylactis S cremoris Curd Sữa trâu/ bò Yogurt Sữa bò Cultured butter milk Sữa trâu/ bò Lassi Sữa trâu/ bò Lb bulgaricus Sữa bò Lb acidophilus Acidophilus milk Bulgarian butter milk Sữa bò Lb delbrueckii ssp bulgaricus Shrikhand Sữa trâu/ bò S thermophilus, Lb bulgaricus Kumiss Sữa ngựa/ lạc đà / lừa Kefir Sữa cừu/ bò/ dê/ hỗn hợp Lb acidophilus, Lb bulgaricus Saccharomyces, Micrococci S lactis, Leuconostoc sp S kefir, Torula kefir, Micrococci 10 Leben Sữa dê/ cừu 11 Pho mát Sữa bò/ trâu/ dê/ cừu S lactis, S thermophilus, Lb bulgaricus Nấm men lên men đường lactose Lb lactis ssp lactis, Lb lactis ssp cremoris, Lb lactis ssp diacetylactis, Lb delbueckii ssp bulgaricus, S thermophilus, Priopionibacterium shermanii, Penicillium roqueforti … Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng kefir [31] Thành phần Năng lượng Chất béo (%) Protein (%) Lactose (%) Nước (%) Acid sữa (g) Ethanol (g) Acid lactic (g) Cholesterol (mg ) Phosphat (mg) Amino acid thiết yếu (g) Tryptophan Phenylalanin+tyrosine Leucine Isoleucine Threonine Methionine+cystine Lysine Valine Vitamin (mg) A Carotene B1 B2 B6 100g 65kcal 3,5 3,3 4,0 87,5 0,8 0,9 13 40 0,05 0,35 0,34 0,21 0,17 0,12 0,27 0,22 0,06 0,02 0,04 0,17 0,05 Thành phần 100g Hàm lượng khoáng (g) Calci Phospho Magie Kali Natri Chlorid 0,12 0,10 12 0,15 0,05 0,10 Nguyên tố Sắt (mg) Đồng (µg) Molypden (µg) Mangan (µg) Kẽm (mg) 0,05 12 5,5 0,36 Hợp chất thơm Acetaldehyd Diacetyl Aceton B12 Niacin C D E 0,5 0,09 0,08 0,11 ] Fehling A: cân 34,66g CuSO4.5H2 - 2SO4 Fehling B: 2Cr2O7 Du 0,5N: cân 16g K2Cr2O7 2S2O3 0,1N: cân 25,0g Na2S2O3 2CO3 ... pháp sinh học phân tử Dưới số nghiên cứu giới thực nấm men hạt kefir: Liu Hui, Li Ping-Lan, Gong Pin, Wang Lei khả nấm men Kết cho thấy nấm men phân lập từ dịch lọc kefir lotiones lên men lactose... Theo nghiên cứu cơng bố, hạt kefir có nhiều lo [19], [32] riêng nấm men từ hạt kefir khảo sát số thông số đặc điểm sinh lý nấm men nhằm tạo điều kiện cho trình nuôi cấy nấm men từ hạt kefir. .. cấp tính - Không gây ứ thừa vi khuẩn - Điều kiện ni cấy đơn giản, chi phí thấp, sinh sản nhanh [12] 1.3.3 Các cơng trình nghiên cứu nấm men hạt kefir Phần lớn cơng trình nghiên cứu nấm men hạt kefir