KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (CND và BC) góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 156 11

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘ GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢPKHÁNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Trường Đại học Dư HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu– môn Vi sinh - Sinh học, người đa tận tình hướng dẫn tư những bước đầu tiên tơi hồn thành khóa ḷn Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đa giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thê các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đa dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập tại trường Và cuối cùng lời cảm ơn gửi tới gia đình bạn bè đa động viên , giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Do hạn chế vê thời gian, điều kiện trang thiết bi phương tiện nghiên cứu, khóa luận cịn có nhiều thiếu sót Tơi rất mong nhận góp ý của các thầy cô, bạn bè đê khóa ḷn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5năm Sinh viên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Đại cương vê kháng sinh .2 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh .2 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh .4 1.1.6 Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 1.1.7 Kháng sinh chống ung thư 1.1.8 Khái niệm vê tính kháng kháng sinh .5 1.2.Đại cương vê xa khuẩn 1.2.1 Xa khuẩnvà hình thành chất kháng sinh tư xa khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xa khuẩn chi Streptomyces 1.2.3 Phươn g pháp phân loại xa khuẩn thuộc chi Streptomyces .7 1.3.Tuyển chọn, cải tao bảo quản giống xa khuẩn 1.3.1 Chọn chủng có HTKS cao phép chọn lọc ngẫu nhiên 1.3.2 Đột biến cải tạo giống 1.3.3 Bảo quản giống xa khuẩn .8 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1.Các phương pháp lên men 10 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10 1.5.Chiết tách tinh chế kháng sinh tư dịch lên men 10 1.5.1.Vai trò của chiết tách tinh chế kháng sinh 11 1.5.2 Các phương pháp chiết tách 11 1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 11 1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến 11 1.6.2.Phổ hồng ngoai 11 1.6.3 Phân tích khối phổ 12 1.6.4 Phổ cộng hưởng tư hạt nhân 12 1.7 Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomycesnâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh 12 1.8 Quá trình tiến hoá của Dps cảm ứng có tính thấm chi Streptomyces 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bi 14 2.1.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.2 Máy móc thiết bi 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1.Chọn lọc, cải tạo giống .17 2.2.2.Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 17 2.2.3.Sơ xác định sớ tính chất của kháng sinh thu 17 2.3 Phương pháp thực nghiệm 17 2.3.1.Nuôi cấy giữ giống xa khuẩn 17 2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 18 2.3.3.Chọn lọc ngẫu nhiên 18 2.3.4 Đột biến UV .19 2.3.5.Phương pháp đột biến hóa học 20 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21 2.3.7 Chiết kháng sinh tư dịch lên men dung môi hữu 22 2.3.8 Tách các thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng 22 2.3.9.Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay .23 2.3.10.Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột 23 2.3.11 Sơ xác định kháng sinh tinh khiết thu .24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT .25 3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 25 3.2 Kết đột biến cải tạo giống lần .25 3.3 Kết đột biến cải tạo giống lần .26 3.4 Kết đột biến cải tạo giống lần .27 3.5 Kết chọn môi trường lên men chìm 28 3.6 Kết chọn chủng lên men 29 3.7 Kết chọn pH chiết 30 3.8 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 3.9 Kết tách tinh chế kháng sinh .32 3.9.1 Kết sắc ký cột lần 32 3.9.2 Kết sắc ký cột lần .35 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) B subtilis Bacillus subtilis P mirabilis Proteus mirabilis KS HTKS Kháng sinh Hoạt tính kháng sinh MT Môi trường MT2dt Môi trường dich thê ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vật MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên ĐB1 Đột biến lần ĐB2 Đột biến lần ĐBHH Đột biến hóa học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm DMHC Dung môi hữu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên ứng dụng của chúng Bảng 2: Các vi khuẩn kiểm định Bảng 3: Các môi trường nuôi cấy xa khuẩn Bảng 4: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm đinh Bảng 5: Các dung môi đa sử dụng Bảng 6: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 7: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 8: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 9: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 10: Kết chọn môi trường lên men chìm Bảng 11: Kết chọn chủng lên men Bảng 12: Kết chọn pH chiết Bảng 13: Kết chọn hệ dung môi chạy sắc ký(VSV kiểm định P mirabilis) Bảng 14: Kết chạy sắc ký cột lần Bảng 15: Kết sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1, 2, (VSV kiểm đinh P mirabilis) Bảng 16: Kết chạy sắc ký cột lần – nhóm Bảng 17: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm (VSV kiểm đinh P mirabilis) Bảng 18: Kết chạy sắc ký cột lần – nhóm Bảng 19: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm Bảng 20: Kết IR DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Kháng sinh phát qua các năm Hình 1.2: Sơ đồ chế tác dụng của các họ kháng sinh Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 1.4: Hình ảnh vê VSV kháng kháng sinh Hình 1.5: Phân loại Actinomycetales Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty xa khuẩn Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triên của xa khuẩn Hình 1.8: Bản đồ vi trí DPS số 17 nhiễm sắc thê Streptomycetales Hình 3.9: Kết chọn chủng lên men chìm tốt nhất Hình 3.10: Biểu đồ kết chọn pH chiết với dung môi n - butanol Hình 3.11: Sắc ký cột lần Hình 3.12: Sắc ký cột lần - nhóm Hình 3.13: Sắc ký cột lần - nhóm Hình P.14: Khuẩn lạc xa khuẩn sau - ngày Hình P.15: Đĩa cấy zigzag sau – ngày Hình P.16: Kết thử HTKS đột biến lần phương pháp khối thach (VSV kiểm đinh P mirabilis) Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces156.11 Hình P.18: Kết thử hoạt tính kháng sinh dich lên men sau lên men chìm phương pháp giếng thach (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.19: Kết hình vi sinh vật (VSV kiểm đinh P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV của kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Hình P.21: Phổ IR của kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Hình P.22: Phổ MS của kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp 41 - Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 156.11(bằng UV, hóa chất, …) đê tạo chủng có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao - Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu - Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách đê tạo kháng sinh với độ tinh khiết hiệu suất cao Chiết tách đê thu lấy các kháng sinh phụ nghiên cứu sâu - Tiến hành phổ khối, cộng hưởng tư hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa, … đê xác định xác cấu trúc hóa học tên khoa học của kháng sinh Streptomyces 156.11sinh tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y Tế (2008),Dược lý học tập 2, NXBY học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II,, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2009),Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Vi sinh vật họcNXB Giáo dục, Hà Nội, trang 26 – 36, 80 – 95 Trần Thị Hồng Anh (1993),Quang phổ hấp thụ tử ngoại– khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Văn Cách (2008),Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng (2001),Vi sinh vật học,NXB Giáo dục, tr 39– 67 Phạm Thị Lam Giang (2011),Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 156.11, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2006 – 2011, Trường Đại học Dược Hà Nội Hy Thanh Hà (2001), Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh 10 phản ứng có hại kháng sinh số khoa bệnh viện Bạch Mai từ 1998 – 2000, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1996 – 2001, Trường Đại học Dược Hà Nội 11.Đoàn Thị Nguyện (2009),Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 7–37 12 nghiệp Lương Đức Phẩm (1999),Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông 13.Nguyễn Văn Thạch (2009),Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục, tr 35–57 14.Khuất Hữu Thanh (2005),Cơ sở di truyền phân tử vàkỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 185-191 15 Trần Thị Thanh (2001),Công nghệ vi sinh, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 9-49 16 Cao Văn Thu (1998),Bài giảng kháng sinh vitamin, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh: 17.Mohammad T Alam (2010), “Metabolic modeling and analysis of the metabolic switch in Streptomyces coelicolor”, BMC Genomics 11 18.Nina M Haste, Varahenage R Perera, Katherine N Maloney, Dan N Tran, Paul Jensen, William Fencial, Victor Nizet and Mary E Hensler (2010), “Activity of the streptogramin antibiotic etamycin against methicillin – resistant Staphylococcus aureus”, The Journal of Antibiotics 22 19.Charusanti P, Fong NL, Nagarajan H, Pereira AR, Li HJ, Abate EA, Su Y, Gerwich WH, Palsson BO (2012), “Exploiting Adaptive Laboratory Evolution of Streptomyces clavuligerus for Antibiotic Discovery and Overproduction”, PLoS One, 2012, vol.7 (3) 20.Wulf crueger anneliese crueger (1987), Biotechnology, agricultural publishing house, Budapest Hungary 21.Saga T, Yamaguchi K (2008), “History of antimicrobial agents and resistant bacteria”, J Japan Med Assoc, 137, pp 513 – 517 22.Westley J.W., Evans R.H., Sello L.H., Troupe N., Liu C.M., Blount J.F (1979), “Isolation and characterization of antibiotic X-14547A, a novel monocarboxylic acid inophore produced by Streptomyces antibiotics NRRL 8167”, J Antibiot, 32, pp 100 – 107 23.United State Pharmacopoeia USP 30 – NF 25.(2007), vol 1, pp 1041 – 1047 Tài liệu online: 24 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3370547/ 25 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355697 PHỤ LỤC Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên ứng dụng chúng Hình 1.1: Kháng sinh phát qua năm 1940 – 2000 Hình 1.2: Sơ đồ chế tác dụng họ kháng sinh Giớng trùn ủ phịng thí nghiệm Bình nhân giớng phịng thí nghiệm Bình nhân giớng thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đâm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm đóng gói Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát quy trình sản xuất kháng sinh Actinomycetes Actinomycetales VSV giống xạ khuẩn Actinoplanaceae Streptomycetaceae Streptoverticulum Streptomyces Actinomycetaceae … Themostreptomyces … Hình 1.5: Phân loại Actinomycetales Hình 1.8: Bản đồ vị trí DPS số 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau thời gian – ngày Hình P.15: Đĩa cấy zigzag xạ khuẩn sau – ngày Hình P.16: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần phương pháp khối thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 156.11 Hình P.18: Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau lên men chìm phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.19: Kết hình VSV (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Nguoi do: Nguyen Thi Son Resolution: 4cm- Mail: sonhuco@yahoo.com Date: DT: 0912140352 Mau Q 3/13/2013 100.0 95 90 85 609 80 75 70 1407 1362 65 1195 55 %T 1097 1296 60 1484 50 1743 2964 2929 45 1585 40 35 30 3432 25 1630 20 15 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 Hình P.21: Phổ IR kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp 800 600.0 Hình P.22: Phổ MS kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp ... tài: ? ?Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nh? ?Streptomyces1 56 .11? ?? làm luận văn tốt nghiệp với các mục tiêu sau: Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao suất sinh tổng hợp kháng sinh. .. Kết hình vi sinh vật (VSV kiểm đinh P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV của kháng sinh Streptomyces 156. 11 sinh tổng hợp Hình P.21: Phổ IR của kháng sinh Streptomyces 156. 11 sinh tổng hợp Hình... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘ GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢPKHÁNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Trường Đại học Dư HÀ