XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Lã Thị Lan Anh XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LA

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC

CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU

HÓA CỦA NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC

CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU

HÓA CỦA NGƯỜI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài:“ Xác định khả năng phân giải muối mật

của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người” là

do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Tuyết Nhung Số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận hoàn toàn chính xác, trung thực Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích

dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu em đã được sự hướng dẫn

và giúp đỡ rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thị Tuyết Nhung - người đã trực tiếp hướng dẫn nhiệt tình, giải đáp kịp thời các thắc mắc và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Đồng Văn Quyền, trường phòng Vi sinh phân tử, các anh chị Vũ Thị Hiền,Trần Xuân Thạch, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Bùi Thị Dương, Nguyễn Đình Duy trong phòng Vi sinh phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán

bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp em có lượng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng như đề tài luận văn này

Xin cảm ơn gia đình đã động viên, là hậu phương vững chắc giúp em

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải thích chữ viết tắt

WHO World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới

LAB Vi khuẩn sinh axit lactic

BSH Bile salts hydrolase- Enzym thủy phân muối mật

RT-PCR Realtime Polymerase Chain Reaction – phản ứng

chuỗi polymerase thời gian thực

Pox Pyruvate oxidase

Lox Lactate oxidase

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác nhau 29

Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh 31

Bảng 3.1 Giá trị đo OD620nm và hàm lượng H2O2 có trong dịch nuôi 42

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót sau khi ủ trong môi trường pH thấp của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng 44

Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ trong môi trường

có bổ sung muối mật 45Bảng 3.4 Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu 54Bảng 3.5 Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã được công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lactobacillus sp 7

Hình 1.2 Đồng phân quang học của axit lactic 9

Hình 1.3 Cấu trúc của axit mật 14

Hình 1.4 Sự tổng hợp axit mật 15

Hình 1.5 Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đường tiêu hóa 19

Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập được từ mẫu phân người 38

Hình 3.2 Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy 38

Hình 3.3 Lactobacillus quan sát dưới kính hiển vi điện tử A ảnh soi tươi B ảnh nhuộm Gram 39

Hình 3.4 Kết quả thử hoạt tính Catalase 40

Hình 3.5 Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng 41

Hình 3.6 Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB 41

Hình 3.7 Khả năng phân giải muối mật của 5 chủng Lactobacillus 48

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 (lần lượt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 50

Hình 3.9 Khả năng ức chế sự sinh trưởng trên S aureus của các chủng Lactobacillus 52

Hình 3.10 Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 54

Hình 3.11 Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08

và Lac.VFE-14 55Hình 3.12 Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac VFE-04, Lac VFE-08, Lac VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree 57

1

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS 7

1.1.1 Vị trí, đặc điểm chung 7

1.1.2 Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus 8

1.1.3 Ứng dụng của Lactobacillus 12

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT HYDROLASE (BSH) 13

1.2.1 Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đường tiêu hóa 13

1.2.2 Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase 18

1.3 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY 19

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 20

1.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 21 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2

2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23

2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2.2 Mẫu vật nghiên cứu 23

2.2.3 Máy móc thiết bị 23

2.2.4 Hóa chất và môi trường 23

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus 25

2.3.2 Phương pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus 25

2.3.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus 26

2.3.4 Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus 30

2.3.5 Xác định khả năng ức chế sinh trưởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus 31

2.3.6 Định danh vi khuẩn 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS 37

3.2 KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS 38

3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS 39

3.3.1 Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn 39

3.3.2 Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus 40

3 3.3.3 Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các

chủng được chọn lọc 43

3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS 47

3.4.1 Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trường nuôi cấy 47

3.4.2 Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh 49

3.5 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƯỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH S AUREUS 51

3.6 ĐỊNH DANH VI KHUẨN 53

3.6.1 Kết quả tách DNA tổng số 53

3.6.2 Kết quả PCR 55

3.6.3 Kết quả giải trình tự 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 KẾT LUẬN 59

4.2 KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 71

4

MỞ ĐẦU

Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến hết năm 2015 trên thế giới có khoảng 2,1 tỉ người thừa cân và béo phì Đây là một con số báo động đối với xã hội Béo phì được đặc trưng bởi một nhóm các rối loạn chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đường type 2, gan nhiễm mỡ, tăng huyết áp, ung thư và đặc biệt là bệnh tim mạch Trong số các bệnh về tim thì bệnh về mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao nhất Tình trạng cao cholesterol trong máu làm tích tụ cholesterol trong động mạch vành, dẫn đến

sự hình thành các mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy sự phát triển của bệnh mạch vành Số liệu cho thấy, nếu nồng độ cholesterol trong máu giảm 1% thì nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3%

Những nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi sinh vật là một yếu tố môi trường liên quan đến việc kiểm soát trọng lượng cơ thể Ở người, hệ vi sinh đường ruột chứa khoảng 1014

tế bào vi khuẩn với bảy nhóm chính đó là

Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria và Actinobacteria [1] Các mô hình thực nghiệm cho thấy ở

các đối tượng động vật và người béo phì có sự thay đổi trong thành phần của

hệ vi sinh vật đường ruột so với đối tượng khỏe mạnh; hệ vi sinh của những

đối tượng béo phì có số lượng Firmicutes lớn hơn và ít Bacteroidetes hơn,

cũng như tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2] Sự thay đổi các gen của

vi khuẩn tiêu biểu được coi là nguyên nhân ảnh hưởng đến các con đường chuyển hóa trong cơ thể [3]

Trong số các vi khuẩn lactic có ảnh hưởng lớn đến trao đổi chất ở

người béo phì, thì chi Lactobacillus giữ một vai trò quan trọng Lactobacillus

là vi khuẩn lactic do sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate

là axit lactic Vi khuẩn Lactobacillus được cho là sở hữu những lợi ích về sức

khỏe khi được sử dụng dưới các điều kiện khác nhau Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đường ruột và

5

các hội chứng sau khi dùng kháng sinh Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium

difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thư đại

trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5] Chi Lactobacillus đã được

tìm thấy đa dạng về loài và số lượng trong đường tiêu hóa của người, nơi có

pH axit và số lượng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH có thể

là một cơ chế đề kháng mật thông thường của chi vi khuẩn này [6] Nghiên

cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập được L johnsonii số 1088 đã được

tìm thấy có khả năng kháng axit mạnh > 10% tế bào sống sót ở pH 1.0 sau 2 giờ [7].Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho thấy sự sống sót

của các chủng Lactobacilli ở pH 2.5 và 2% muối mật sau 3 giờ [6]

Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công

dụng của hoạt tính thủy phân muối mật thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6]

Enzyme thủy phân muối mât (Cholylglycine hydrolase, E.C.3.5.1.24) xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết peptide của axit mật tự

do với gốc Glycine hoặc Taurin Các axit mật tự do (dạng giải liên hợp) sau

đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể được tái hấp thu qua ruột và sẽ được thải ra ngoài cơ thể Cholesterol là cơ chất để tổng hợp nên axit mật, vì thế việc thủy phân muối mật sẽ làm lượng cholesterol trong máu giảm đi, giúp cơ thể khỏe mạnh hơn, tránh nguy cơ béo phì và các bệnh tim mạch [8]

Các chủng Lactobacillus phân lập và có những đặc điểm probiotics

đặc trưng trong nghiên cứu này có một tiềm năng rất lớn để trở thành sản phẩm probiotics, là liệu pháp khả thi cho việc giảm mức cholesterol thông qua khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật BSH Chính vì lí do nêu

trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề: " Xác định khả năng phân

giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người."

6

 Với mục tiêu:

Nhằm xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus và các đặc điểm probiotics của các chủng vi khuẩn này

 Nhiệm vụ của đề tài:

- Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả

năng phân giải muối mật

- Xác định các đặc điểm sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi

khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS

1.1.1 Vị trí, đặc điểm chung

Lactobacillus - một thành viên chính trong nhóm vi khuẩn lactic, là

một chi vi khuẩn Gram dương, hình que, sống kỵ khí tùy tiện hoặc yếm khí, không sinh bào tử (Hình 1.1) [9] Chúng đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng

để sinh trưởng như carbohydrates, amino axit, peptide, các ester của axit béo, muối, dẫn xuất axit nucleic và vitamin [10]

Hình 1.1 Lactobacillus sp

Nguồn: https://www.microbiologyinpictures.com/

Vi khuẩn Lactobacillus được phân bố từ dạ dày đến ruột già ở người và

động vật với số lượng thay đổi phụ thuộc vào loài, tuổi của vật chủ, hoặc vị trí

trong ruột Trong phân người trưởng thành, vi khuẩn Lactobacillus chiếm một

tỷ lệ nhỏ, khoảng 0,01% đến 0,6% tổng số lượng vi khuẩn với các loài chiếm

ưu thế như L gasseri, L reuteri, L crispatus, L salivarius, và L.ruminis [11] Ngoài ra các loài L axitophilus, L fermentum, L casei, L.rhamnosus, L

johnsonii, L plantarum, L brevis, L.s delbrueckii, L curvatus, và L sakei

cũng có thể được tìm thấy trong đường tiêu hóa của người với mức độ thay đổi thất thường [12] Vi khuẩn này đóng vai trò chính trong lên men thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và thực vật từ thời xa xưa

8

Vi khuẩn Lactobacillus được cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe

khi được sử dụng dưới các điều kiện khác nhau Chúng có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đường ruột và các hội

chứng sau khi dùng kháng sinh Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium

difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thư đại

trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5] Đường tiêu hóa là nơi

chính mà vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hầu hết các hoạt tính để kiểm soát sức khỏe Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu được điều kiện khắt khe

của môi trường sống Các vi khuẩn lactic có tác dụng chống lại các tác nhân gây đột biến, phá hủy các tác nhân gây ung thư, chống lại các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch [5]

1.1.2 Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn

Lactobacillus

Quá trình trao đổi chất để sinh trưởng và phát triển của các chủng

Lactobacillus sống trong đường tiêu hóa cũng đồng thời mang lại nhiều lợi

ích cho vật chủ, vì thế vi khuẩn Lactobacillus đóng góp rất nhiều vai trò trong đời sống của con người Một số khả năng chuyển hóa của Lactobacillus

đã được phát hiện bao gồm:

1.1.2.1 Phân giải protein

Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các

peptide mạch ngắn [13] Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein được cơ thể vật chủ tiêu hoá dễ dàng Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của

Lactobacillus được đánh giá là nguồn dinh dưỡng có giá trị cao cho các đối

tượng như trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh, người già hay gia súc non

[14] Ngoài ra, trong công nghệ thực phẩm, Lactobacillus còn dùng để làm

tăng hương vị và tham gia kết cấu sản phẩm

9

1.1.2.2 Phân giải đường lactose

Lactose được enzyme β-galactosidases của vi khuẩn Lactobacillus

chuyển hóa thành glucose và galactose Glucose và galactose lại tiếp tục được chuyển hóa thành sản phẩm chính là axit lactic cùng với các sản phẩm phụ như axit béo chuỗi ngắn acetate, propionate, butyrate,… [15]

Về mặt sinh l ý học, axit lactic có những ưu điểm như: tăng cường khả năng tiêu hoá protein sữa thông qua sự đông vón; tăng cường hoạt tính Ca, P, Fe; kích thích sự tiết dịch vị; tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dưới dạ dày và là nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp

Chính những ưu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc

ứng dụng Lactobacillus làm probiotic Tuỳ thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) axit

lactic (Hình 1.2) Ở người, cả hai loại đồng phân này đều được hấp thu trong đường ruột [16]

Hình 1.2 Đồng phân quang học của axit lactic [16]

L (+) axit lactic: được chuyển hoá hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen

D (-) axit lactic: được chuyển hoá ít hơn và phần không chuyển hoá sẽ được bài tiết dưới dạng urine Sự hiện diện của axit không được chuyển hoá trong ống tiêu hoá sẽ gây tình trạng nhiễm axit trong trao đổi chất ở trẻ sơ sinh

10

1.1.2.3 Vi khuẩn Lactobacillus và cholesterol

Tác dụng của vi khuẩn lactic lên tình trạng cao cholesterol trong máu

đã phát hiện trong nhiều nghiên cứu trên động vật cũng như con người Sử dụng vi khuẩn lactic theo đường uống có tác dụng làm giảm đáng kể cholesterol từ 22 đến 33% hoặc làm giảm cholesterol ở chuột béo phì [6,17-19] Những tác dụng làm giảm cholesterol trong máu của vi khuẩn này có thể

được thông qua: hoạt tính enzyme thủy phân muối mật [19], khả năng đồng

hóa cholesterol [18]; hoạt tính gắn kết vào màng tế bào, và khả năng sản xuất các hợp chất như FA có tác dụng ức chế hoạt tính của các enzyme như HMG-CoA reductase

Các sản phẩm từ đậu nành được lên men bởi L jugurti có thể làm giảm

cholesterol trong máu, giảm lipid, triglyceride tổng số trong huyết thanh và gan ở chuột bị cao cholesterol trong máu [20]

L plantarum KCTC 3928 cũng có tác dụng giảm cholesterol trong máu

đạt được bằng cách tăng tổng hợp axit mật và bài tiết axit mật qua phân [21]

L plantarum BBE7 với hoạt tính BSH cao đã được chọn lọc và hoạt tính giải

liên hợp muối mật cũng như tác dụng loại bỏ cholesterol của nó ở quy mô

phòng thí nghiệm đã được nghiên cứu L plantarum BBE có tác dụng làm

giảm cholesterol lên đến 58% ở chuột [22]

Tác dụng làm giảm béo của vi khuẩn L plantarum 14 thông qua hoạt động làm giảm nồng độ leptin và cholesterol tổng số Thêm vào đó L

plantarum 14 làm giảm kích thước của các tế bào mô mỡ, làm giảm trọng

11

này cho thấy L plantarum CGMCC 8198 có lợi thế tiềm năng trong việc

ngăn ngừa bệnh tim mạch

ức chế sự sinh trưởng của một số loài vi khuẩn như Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus… [26]

Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sản

xuất H2O2 như: L johnsonii, L axitophilus, L fermentum, L gasseri, [24]

Tùy thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất H2O2 của chúng là khác nhau với nồng độ dao động trong khoảng 0,8 – 6,4 mM [27] Khả năng tạo H2O2

của chủng L fermentum CS 12-1 là 3.5 mM [28], chủng L johnsonii NCC533 là 1mM [24] hay các chủng Lactobacillus trong nghiên cứu của Zalán và cộng sự, (2005) là từ 0,059 – 0,176 mM [29]

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế sinh trưởng và bài tiết độc

tố ở vi khuẩn S aureus [30] Trong nghiên cứu của Misaghi và cộng sự,(2017) cho thấy cả ba loài L acidophilus, L paracasei và L fermentum đều có khả năng ức chế sinh trưởng của S aureus Ngoài ra, các chủng

Lactobacillus này cũng ức chế biểu hiện gen SE là yếu tố gây độc chính của

S aureus [31] Thử nghiệm lâm sàng của Eggers và cộng sự, (2018) cho thấy

những người sử dụng bổ sung đường uống vi khuẩn probiotic L

12

rhamnosus HN001 có khả năng làm giảm từ 73- 83% số lượng vi khuẩn S aureus đường ruột người so với những người chỉ dùng giả dược [30] Hơn

nữa, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế sinh trưởng của S

aureus nhờ chủng vi khuẩn này có khả năng tiết ra môi trường những phân tử

kháng khuẩn như ethanol, H2O2 và các bacteriocin [32]

1.1.2.5 Khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp và chịu muối mật

Để có thể tồn tại trong môi trường đường tiêu hóa của vật chủ, các vi khuẩn cần phải có khả năng chịu được nồng độ muối mật cao, pH thấp [6] và

có khả năng bám dính vào chất nhầy và các tế bào niêm mạc ruột [22]

Lactobacillus đã được tìm thấy đa dạng về loài và số lượng trong

đường tiêu hóa của người, nơi có pH axit và số lượng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp Sản xuất enzyme thủy phân muối mật có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thường của chi vi khuẩn này [6] Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập

được L johnsonii 1088 có khả năng kháng axit mạnh, hơn 10% tế bào sống

sót ở pH 1 sau 2 giờ [7] Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho

thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2,5 và 2% muối mật sau 3

giờ [6]

Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công

dụng của hoạt tính enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình

chuyển đổi muối mật của vật chủ [6]

1.1.3 Ứng dụng của Lactobacillus

Lactobacillus cũng như nhiều loại vi khuẩn lactic khác đã và đang được

ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ y tế, môi trường, nông nghiệp, và trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm

13

- Trong nông nghiệp:

Một số chủng lactobacillus như L acidophilus, L casei, L

sporogenes được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi nhờ khả năng tạo

môi trường giàu axit lactic, H2O2, giảm độ pH trong đường tiêu hóa làm ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh, đồng thời kích thích khả năng miễn dịch cho vật nuôi, cải thiện khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng [33, 34]

Lactobacillus còn được sử dụng kết hợp với các vi khuẩn lactic khác

trong chế phẩm để xử lý ô nhiễm môi trường, cải tạo đất, ức chế sự phát triển của mầm bệnh làm tăng khả năng sống và năng suất cho cây trồng, vật nuôi [35]

- Trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm:

Nhờ khả năng lên men sinh axit lactic cùng một số sản phẩm có giá trị

như vitamin, chất thơm Lactobacillus được sử dụng để bổ sung vào sữa tạo

nên các sản phẩm sữa chua thơm ngon dinh dưỡng và có lợi cho sức khỏe người sử dụng [36- 38]

Trong lên men dưa chua, hoa quả muối chua, các vi khuẩn lactic bổ sung vào giúp cho thực phẩm không bị biến đổi về màu sắc tự nhiên mà vẫn giữ nguyên giá trị dinh dưỡng, giúp thực phẩm được bảo quản trong thời gian lâu hơn [39]

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT HYDROLASE (BSH)

1.2.1 Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đường tiêu hóa

1.2.1.1 Đặc điểm của mật

Mật là một dịch lỏng màu vàng xanh, chứa các thành phần nước, axit mật, cholesterol, phospholipids và sắc tố màu biliverdin [40] Ở nhiều loài,

14 mật được lưu giữ trong túi mật giữa các bữa ăn và được đổ vào tá tràng khi

ăn, ở đó mật hỗ trợ quá trình tiêu hoá thức ăn Axit mật chiếm khoảng 50% thành phần hữu cơ của mật và chúng được tổng hợp mới từ cholesterol trong gan Sau khi được liên kết với glycine hoặc taurine để tạo thành axit mật liên hợp, chúng thường kết hợp với ion Na+ hay K+ để tạo thành muối mật Tính chất lưỡng cực cho phép các muối mật đóng một vai trò quan trọng trong việc nhũ tương hóa các chất béo làm tăng sự tiếp xúc giữa lipase và cơ chất lipid,

do đó muối mật đóng một vai trò thiết yếu trong việc tiêu hóa chất béo Trong quá trình di chuyển ở ống tiêu hóa, các muối mật tiếp xúc với các vi khuẩn đường ruột, là những đối tượng có khả năng loại bỏ gốc glycine hoặc taurine

bằng cách sử dụng enzyme BSH Với lượng lớn axit mật lưu thông trong ống tiêu hóa, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa tham gia tích cực vào việc chuyển hóa muối mật với mức độ lớn

Hình 1.3 Cấu trúc của axit mật [40]

1.2.1.2 Tổng hợp axit mật từ Cholesterol

Các axit mật sơ cấp gồm cholic và axit chenodeoxycholic được tổng hợp mới ở gan từ cholesterol (Hình 1.4) Axit mật được duy trì sự cân bằng một cách hiệu quả trong điều kiện bình thường bằng một quá trình gọi là chu trình gan - ruột Axit mật liên hợp (với glycine hoặc taurine) và không liên hợp được hấp thu bằng cách khuếch tán thụ động dọc theo toàn bộ ruột và vận

15 chuyển tích cực ở đoạn cuối hồi tràng Axit mật có thể được tái hấp thu vào máu và được giữ bởi các tế bào gan, tái liên kết, và tái tiết vào trong mật Ở người bình thường, mỗi ngày có khoảng 0,3 đến 0,6 g (5% tổng số axit mật) vượt quá khả năng hấp thụ của tế bào biểu mô nên chúng được xử lý bởi các

vi khuẩn đường ruột [41]

Hình 1.4 Sự tổng hợp axit mật

1.2.1.3 Chuyển hóa axit mật của hệ vi sinh vật đường ruột

Với lượng lớn axit mật lưu thông trong ống tiêu hóa, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa phức tạp có liên quan đến khả năng chuyển hóa muối mật với mức độ lớn Hệ vi sinh đường ruột có thể tạo ra khoảng 20 chất chuyển hóa axit mật khác nhau từ axit cholic và chenodeoxycholic axit [42] Biến đổi sinh

16 học được biết đến bởi vi khuẩn đường ruột bao gồm: (1) thủy phân muối mật liên hợp để giải phóng axit mật tự do và các gốc axit amin, (2) loại bỏ các nhóm hydroxyl chủ yếu là nhóm hydroxyl 7 cacbon của gốc axit cholic, (3) phản ứng oxi hóa khử của các nhóm hydroxyl, và (4) sự epime hóa axit mật [43] Trong số những phản ứng trên, thủy phân muối mật liên hợp là phản ứng quan trọng nhất về mặt sinh học Đây là một điều kiện tiên quyết cho bất kỳ chuyển đổi nào của sterol trong cơ thể [40]

1.2.1.4 Thủy phân muối mật

Quá trình tổng hợp axit mật và sự liên hợp với axit amin được thực hiện trong gan Ngược lại, các hoạt động của vi sinh vật đường ruột có thể tách các hợp chất này thành các axit mật tự do và các gốc axit amin [40] Các

lớp enzyme của vi khuẩn xúc tác thủy phân muối mật liên hợp được gọi chung là enzyme thủy phân muối mật liên hợp - BSH, còn được gọi là hydrolases cholylglycine [40]

BSH được sản xuất bởi vi sinh vật trong ruột, chúng tham gia vào những bước đầu tiên của sự biến đổi axit mật Những vi khuẩn giải liên hợp của muối mật được cho là tăng một cách khiêm tốn ở ngoại vi hồi tràng và tăng đáng kể ở đại tràng, bằng chứng là axit mật không liên hợp không thấy xuất hiện trong hỗng tràng, nhưng tăng chậm trong hồi tràng Trong phân hầu hết axit mật ở dạng không liên hợp Thí nghiệm với động vật sạch (không có

vi sinh vật trong đường ruột), thấy xuất hiện các muối mật liên hợp nguyên vẹn trong phân, do vậy có thể nói rằng các vi khuẩn đường ruột chịu trách nhiệm cho sự giải liên hợp [42] Từ việc so sánh các đặc điểm giữa không có

vi khuẩn Lactobacillus và có vi khuẩn Lactobacillus cư trú ở ruột chuột, cho thấy rằng Lactobacillus chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động thủy phân

muối mật trong đường ruột của chuột [40]

17 Những muối mật giải liên hợp được tái hấp thụ lại ít hơn so với các

muối mật liên hợp của chúng, kết quả là một lượng lớn axit mật tự do được bài tiết trong phân Ngoài ra, muối mật tự do có hiệu quả thấp trong việc hòa tan và giúp chất béo hấp thu trong ruột Vì thế, sự giải liên hợp của muối mật

có thể dẫn đến làm giảm cholesterol huyết thanh bằng cách: 1- làm tăng nhu cầu đối với cholesterol để tổng hợp mới các axit mật, bù lại phần bị mất đi trong phân hay 2- nhờ làm giảm độ hòa tan cholesterol, qua đó làm giảm độ hấp thu cholesterol qua lumen ruột [44]

1.2.1.5 Thủy phân axit mật làm giảm cholesterol

Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus được xem như các các liệu pháp

sinh học có tác dụng làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ hoạt tính của enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển hóa muối mật của vật chủ [45] Quá trình tổng hợp axit mật và sự liên hợp với axit

amin được thực hiện trong gan Ngược lại, các hoạt động của Lactobacillus có

thể tách các hợp chất này thành các axit mật tự do và các gốc axit amin Các

lớp enzyme của vi khuẩn xúc tác thủy phân muối mật liên hợp được gọi chung là enzyme thủy phân muối mật liên hợp, còn được gọi là hydrolases cholylglycine [42]

Các axit mật tự do là sản phẩm của phản ứng thủy phân muối mật bởi

các enzyme BSH của một số Lactobacillus ít tan trong nước, dễ bị kết tủa và

kết quả là dễ dàng bị đào thải qua phân Việc tăng cường sự đào thải muối mật qua phân sẽ làm tăng nhu cầu sử dụng cholesterol như một tiền chất để tổng hợp muối mật mới để duy trì sự cân bằng muối mật trong cơ thể Vì vậy,

sự tiêu hao muối mật có thể được coi như là một liệu pháp sinh học để can thiệp vào việc điều trị chứng tăng cholesterol trong máu [43]

Các thành phần chính của mật là các axit mật sơ cấp, cholesterol và các phospholipid Trong cơ thể, axit mật sơ cấp được tổng hợp mới từ cholesterol

18 trong gan [40] Sau khi liên kết với glycine hoặc taurine, axit mật được tiết vào ống tiêu hóa, và chúng hoạt động như một chất tẩy rửa Chúng có tác dụng làm nhũ tương hóa, giúp các enzyme lipase phát huy được tác dụng của mình Các vi khuẩn đường ruột trong ruột non có khả năng thủy phân glycine hoặc taurine từ các axit mật bằng cách sử dụng enzyme xúc tác thủy phân muối mật Sau khi loại bỏ glycine hoặc taurine, muối mật giải liên kết có độ tan trong nước thấp hơn, dễ bị kết tủa và do đó được thải theo phân ra ngoài

Để điều hòa sự cân bằng của muối mật trong cơ thể, gan sẽ chuyển hóa cholesterol biến thành muối mật do đó mức độ cholesterol huyết thanh có thể được giảm xuống [44]

1.2.2 Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase

Hệ vi sinh đường ruột của động vật có vú nói chung và ở người nói riêng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh lý của vật chủ và liên quan đến nhiều khía cạnh của sức khỏe và bệnh tật như: trầm cảm [46], ung thư [47], sức khỏe tim mạch [48] Thông qua thành phần và sự hoạt động của các vi sinh vật trong cơ thể, có thể dự đoán được tình trạng sức khỏe và bệnh tật của vật chủ, đồng thời có thể sử dụng các liệu pháp vi sinh vật để hỗ trợ sức khỏe và điều trị những loại bệnh này [49]

Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đã tiến hóa khả năng biến đổi giải liên

hợp muối mật làm tăng khả năng sống sót trong ruột, trong đó, các enzyme BSH đóng vai trò thiết yếu trong xúc tác các phản ứng của quá trình này [21]

Enzyme BSH xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết

peptide giữa axit mật tự do với gốc Glycine hoặc Taurine của muối mật liên hợp, tạo ra axit amin tự do và axit mật giải liên hợp [40] Các axit mật giải liên hợp sau đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể được tái hấp thu qua ruột [6] Việc thủy phân muối mật tạo axit mật giải

19 liên hợp khó hấp thụ nên cơ thể sẽ cần huy động nhiều cholesterol để tổng

hợp axit mật mới, quá trình này góp phần làm giảm lượng cholesterol trong máu Ngoài ra, axit mật tự do tạo thành sau quá trình giải liên hợp muối mật sẽ kết tủa ở điều kiện pH thấp (< 5,5) kéo theo các hạt cholesterol ổn định bị phá vỡ, tạo thành các chuỗi axit béo ngắn và được loại ra khỏi cơ thể qua phân [50]

Hình 1.5 Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đường tiêu hóa

Nguồn: Brandvold và cộng sự, 2019 [50]

1.3 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN

LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY

Hoạt tính thủy phân muối mật của vi khuẩn sinh axit lactic có tiềm năng rất lớn để ứng dụng vào các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho con người, đặc biệt là những người có hàm lượng cholesterol trong máu cao, thừa cân, béo phì Các nghiên cứu về hoạt tính phân giải muối mật của vi khuẩn

sinh axit lactic nói chung và Lactobacillus và bước đầu ứng dụng trên động

vật đã được triển khai rộng rãi trên thế giới, một số công trình có đạt được

những thành công nhất định Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng công trình

nghiên cứu về vi khuẩn Lactobacillus còn khiêm tốn Phần lớn các nghiên cứu

đang dừng lại ở mức phân lập, định danh hay tuyển chọn các chủng làm

20 probiotic mà chưa nghiên cứu sâu hơn về khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật của vi khuẩn này

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

S O’Flaherty và cộng sự (2018) tiến hành nghiên cứu sự hiện diện của

BSH trong bộ gen Lactobacillus của 170 loài khác nhau Dữ liệu điều tra cho thấy 28% loài Lactobacillus mã hóa protein BSH, những loài này chủ yếu

được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của động vật có xương sống Điều này chứng

tỏ các chủng Lactobacillus đã sản sinh enzyme BSH phân giải muối mật để

thích nghi được với điều kiện sống khắc nghiệt [51] Cũng trong năm 2018, Thibault Allain và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng sinh enzyme BSH từ vi

khuẩn L johnsonii La1 để ức chế ký sinh trùng đường ruột Giadia

duodenalis Nghiên cứu đã biểu hiện ba gen mã hóa cho enzyme BSH có

trong bộ gen của L johnsonii La1 bao gồm bsh47, bsh56, bsh12, phân tích

mô hình cấu trúc các gen và thử nghiệm trên chuột nhiễm Giadia Kết quả

cho thấy BSH đã phát huy tác dụng đáng kể trong việc chống lại ký sinh trùng

Giadia [52]

Trong một nghiên cứu của S Jayashree và cộng sự (2014) trên chủng

L fermentum MTCC 8711, nhóm tác giả đã đã xác định được hai gen bsh1 và bsh2 của chủng này mã hóa cho các protein tương ứng là BSH1 và BSH2 với

26% trình tự axit amin giống nhau Khi biến nạp các gen này vào chủng L

fermentum bản địa cho kết quả hoạt động của BSH được cải thiện rõ Chủng

tái tổ hợp này có thể đồng hóa hoàn toàn 100 μg/mL cholesterol trong vòng

24 giờ, trong khi chủng tự nhiên phải mất đến 72 giờ để đồng hóa hoàn toàn cholesterol [53] Nghiên cứu đánh giá hoạt tính phân giải muối mật trong điều kiện in vitro của các probiotic khác nhau phân lập từ nguồn thực vật và động vật đã được Tsai và cộng sự thực hiện Nhóm tác giả đã tiến hành nuôi cấy các tế bào HepG2 với các chủng probiotic có hoạt tính BSH cao Kết quả cho

21

thấy các chủng L rhamnosus NBHK007 và L aciophilus NBHK008 thể hiện

khả năng giải liên hợp axit mật cao hơn các chủng probiotic khác, trong đó

chủng L rhamnosus NBHK007 làm giảm tiết 100% triglyceride trong vòng

48 giờ ủ Nồng độ cholesterol trong các mixen cholesterol đã giảm trong 24 giờ ủ Sử dụng probiotic chứa các chủng này trong chế độ ăn của chuột hamster có lượng cholesterol máu cao giúp làm giảm tổng nồng độ

cholesterol, lipoprotein mật độ thấp, triglyceride và thiobarbituric axit trong máu và gan so với những con chuột có chế độ ăn kiêng không bổ sung probiotic [54]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, chỉ mới có một số công trình nghiên cứu về khả năng

phân giải muối mật của vi khuẩn Lactobacillus Năm 2014, Dương Nhật Linh

và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc vi khuẩn lactic phân lập từ sữa

mẹ, phân su em bé, rau quả muối chua và sữa chua lên men tự nhiên có hoạt tính giảm cholesterol thông qua khả năng sinh enzyme BSH, khử muối mật liên hợp và khả năng hấp thụ cholesterol thông qua liên kết với màng tế bào Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 32 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme BSH, trong đó hoạt tính enzyme cao nhất là 5,061 U/mg thu được từ chủng VN2.2 và khả năng hấp thu cholesterol cao nhất đạt 79,921% từ chủng

YK1.1 [55] Nguyễn Thị Diễm Hương và Đỗ Thị Bích Thủy đã thực hiện

nghiên cứu khảo sát đặc tính của L fementum DC1 phân lập từ sản phẩm dưa

cải Huế Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ sống sót của chủng DC1 tại

pH 2 qua 1, 2 và 3 giờ ủ lần lượt là 75,21%, 68,35% và 66,25% Sau 4 giờ ủ trong môi trường MRS có mặt muối mật với nồng độ 0,3%, mật độ OD ở bước sóng 600nm đạt được là 0,516 [56]

Nhìn chung tại Việt Nam có khá ít công trình nghiên cứu sâu về khả

năng phân giải muối mật liên hợp của vi khuẩn Lactobacillus trong khi tác

22 dụng của hoạt động này là rất lớn Sự phân giải muối mật nhờ các vi khuẩn

thuộc chi Lactobacillus đã đƣợc chứng minh là có thể làm giảm mức độ

cholesterol trong huyết thanh thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6] Chính vì vậy việc tiến hành đề tài nghiên cứu là

rất cần thiết, giúp bổ sung nguồn dữ liệu về vi khuẩn Lactobacillus sp có khả

năng thủy phân muối mật ở Việt Nam, và là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp

theo nhằm tìm ra các chủng Lactobacillus có tiềm năng sử dụng làm probiotic

23

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại Phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Lactobacillus sp được phân lập từ từ hệ vi khuẩn đường

ruột của người khỏe mạnh tại Hà Nội

2.2.2 Mẫu vật nghiên cứu

Các mẫu phân do người tham gia tại khu vực Hà Nội tự thu thập phân của mình sau đó để trong hộp vô trùng Mẫu sau đó sẽ giữ lạnh ở 40

C và chuyển ngay lập tức đến phòng thí nghiệm để phân tích

2.2.3 Máy móc thiết bị

Box cấy vô trùng; pipetman (1000, 200, 100, 20, 10 µL); tủ nuôi cấy, đĩa cấy, kính hiển vi phân cực (Nikon Eclipse 50i), lam kính, lamen, máy đo quang phổ

2.2.4 Hóa chất và môi trường

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

Nước muối sinh lý NaCl 0,9%, bộ hóa chất nhuộm Gram: Gentians, Lugol, Fucshin, Glycerol, hóa chất định tính, định lượng H2O2 gồm: dung dịch gốc H2O2 thương mại 30%, TMB, DMSO, HRP, Muối mật Oxgall (Sigma), glycocholate, taurocholate, glycodeoxycholate, taurodeoxycholate, Môi trường MRS với thành phần: Peptone (10g/L), cao thịt (10g/L), cao nấm men (4g/L), Glucose (20g/L), CH3COONa (5g/L), Tween 80

24 (1mL/L), K2HPO4 (2g/L), Triamonium citrate (2g/L), MgSO4.7H2O (0,2g/L), MnSO4 (0,05g/L) Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH hoặc HCl tùy theo

dung dịch sau khi pha có nồng độ pH tương ứng thấp hay cao hơn hơn 6.2 Với môi trường thạch bổ sung thêm agar nồng độ từ 1-2%, 10-20g trên 1 lít

môi trường

Các hóa chất trong thí nghiệm định danh vi khuẩn bao gồm:

Dung dịch trong tách DNA tổng số

Thành phần đệm tách: NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH=8), EDTA 100 mM (pH=8), SDS 0,5% w/v

Thành phần hỗn hợp PCI bao gồm Phenol: Chloroform: Isopropanol với tỷ lệ 25: 24 :1

Thành phần TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM

Dung dịch cho điện di

Thành phần TAE 50X trong 500ml nước: Tris base: 121g; CH3COOH: 28,6g; EDTA 0,5M pH 8,0: 50 mL; H2O 500 mL

Thành phần Gel agarose 1%: Agarose 1g; Đệm TAE 1X 100 mL

Thành phần PCR

Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µL : H2O 8,5 µL ; Master Mix 12,5 µL ; Mồi xuôi 1 µL (10 pM) ; Mồi ngược 1 µL (10 pM) ; DNA khuôn 2 µL (200 ng)

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này của hãng ThermoFisher Scientific

25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus

Mẫu phân sau khi thu thập được đưa về phòng thí nghiệm Sau đó, mẫu được pha loãng theo dãy thập phân đến nồng độ 10-7

bằng nước muối sinh lý 0,9% Dùng micropipette có đầu côn vô trùng hút 0,1 mL dịch ở các độ pha loãng 10-5

, 10-6, 10-7 cấy trải trên các đĩa petri chứa sẵn môi trường thạch MRS và được nuôi cấy trong điều kiện kị khí ở 37C trong vòng 48 đến 72 giờ Điều kiện kỵ khí được tạo ra bằng cách dùng một túi khí kỵ khí Anaerocult®A (Merek) trong một bình ủ kị khí chứa các đĩa môi trường

2.3.2 Phương pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus

Vi khuẩn sẽ được làm sạch bằng cách ria cấy pha loãng trên đĩa thạch

Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MRS: Với các chủng

vi khuẩn đã ria cấy tinh sạch, tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trường MRS trong các bình tam giác để nhân nhanh số lượng tế bào vi khuẩn, các thao tác thực hiện trong box cấy

Các bước thực hiện: Sử dụng các bình tam giác rỗng vô trùng Dùng pipet hút vào mỗi lọ 5 mL môi trường MRS lỏng Khử trùng đầu que cấy dưới

ngọn lửa đèn cồn, để nguội Chọn một khuẩn lạc đơn có kích thước lớn nhất, dùng đầu que cấy chạm vào khuẩn lạc vừa chọn Nhúng đầu que cấy chứa vi khuẩn vào dung dịch MRS trong bình tam giác, khuấy đều Bọc miệng bình bằng giấy bạc, ghi tên mẫu và ngày vào mẫu Nuôi lắc các chủng trong tủ ở

26 nuôi cấy trong bình tam giác, thu lấy 700 µL dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống eppendorf Hút 300 µL Glycerol 100% cho vào ống eppendorf đó Ghi tên mẫu lên nắp ống eppendorf Bọc xung quanh miếng ống eppendorf bằng

parafilm và giữ ở tủ -80C Tất cả các thao tác thực hiện trong box cấy vô trùng

 Giữ chủng trong ống thạch: Chuẩn bị các ống nghiệm khử trùng, đổ

5 ml môi trường MRS agar cho vào các ống nghiệm đó Đợi cho thạch khô hoàn toàn Khử trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn Để cho nguội Dùng đầu que cấy chạm vào phần dịch nuôi vi khuẩn trong bình tam giác Ria phần

vi khuẩn vừa thu lên phần thạch MRS trong ống nghiệm Đậy nắp ống

nghiệm bằng nút bông đã khử trùng Ghi tên mẫu: Đem nuôi các chủng giữ trên ống thạch ở 370C trong vòng 24-48 giờ Quan sát thấy phần thạch trong ống lên khuẩn lạc thì giữ các ống thạch trong tủ lạnh 40

C

2.3.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm

probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus

2.3.3.1 Phương pháp xác định hình thái tế bào vi khuẩn

Phương pháp soi kính hiển vi

Chọn khuẩn lạc đồng nhất, kiểm tra hình thái bằng kính hiển vi

Lấy mẫu: Chuẩn bị vật dụng cần thiết: lam kính, lamen Xác định các chủng

vi khuẩn đã phân lập đem đi quan sát Hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn để

khử trùng Dùng pipet nhỏ vài giọt NaCl 0,9% lên bề mặt lam kính Dùng đầu que tăm đã khử trùng (hoặc các vật có đầu nhọn vô trùng) chạm vào phần khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy Hòa tan vi khuẩn ở đầu que tăm vào dung dịch NaCl 0,9% trên lam kính Phủ lamen lên phần dung dịch

trên lam kính và quan sát trên kính hiển vi

Soi trên kính hiển vi : Đặt lam kính lên trên giá đặt mẫu Quay vật kính về độ

phóng đại x40 Xoay ốc điều chỉnh sơ cấp cho lam kính chạm vào vật kính

27 Quan sát trên thị kính và xoay các ốc điều chỉnh sao cho quan sát rõ vi khuẩn

Xác định Gram bằng phương pháp nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm do Gram sáng chế năm

1884, là một phương pháp đơn giản và hiệu quả dùng để nhận diện nhanh các

vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Quy trình thực hiện: Đầu tiên dùng que cấy lấy mẫu vi khuẩn từ đĩa cấy

(hoặc các vật dụng khác chứa chủng vi khuẩn đã phân lập), hòa tan vi khuẩn vào một vài giọt NaCl 0,9% trên lam kính và dàn đều Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, để nguội Nhuộm dung dịch tím gentians trong khoảng 1 phút Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ Nhuộm dung dịch lugol để bắt màu màu trong khoảng 1 phút Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ Tẩy màu bằng cồn 90 để khoảng 30 giây Rửa nước Nhuộm dung dịch đỏ Fucshin trong 1 phút Rửa dưới vòi nước Để khô tự nhiên Soi mẫu dưới vật kính và quan sát

Phương pháp thử Catalase

Mục đích: Kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalase

Phương pháp thực hiện như sau: Dùng que cấy vô trùng lấy sinh khối

từ khuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch Nhỏ H2O2 3-10% lên sinh khối của vi khuẩn trên phiến kính Phản ứng catalase là dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí sau khi nhỏ dung dịch H2O2 ngược lại không xuất hiện bọt khí là phản ứng catalase âm tính

2.3.3.2 Phương pháp định tính và định lượng H 2 O 2

Phương pháp của Martín & Suárez (2009) được sử dụng để xác định sự

có mặt của H2O2 trong dịch nuôi các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân

lập [57] Vi khuẩn được cấy chuyển sang 5 mL môi trường MRS nuôi lắc 200

28 vòng/ phút ở 37°C trong 24 giờ Tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng ly tâm,

dịch nổi thu được bổ sung vào hỗn hợp có chứa enzyme HRP (horseradish peroxidase, Sigma, USA) và TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine, Sigma) trong đệm Phosphate (pH 6) với tổng thể tích 1,5 mL Ban đầu TMB ở dạng khử, không màu, khi có mặt của HRP và H2O2, TMB bị oxy hóa và chuyển thành màu xanh

Phương pháp trên cũng được sử dụng để định lượng nồng độ H2O2 do các chủng vi khuẩn sản xuất được Tiến hành dựng đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang ở bước sóng 620 nm của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn H2O2

100 mM Nồng độ H2O2 các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân lập sản

xuất được được tính toán dựa vào đường chuẩn khi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 620 nm Các thí nghiệm trên từng chủng được tiến hành lặp lại 3 lần để thu được kết quả cuối cùng

Quy trình thực hiện thí nghiệm như sau:

 Dựng đường chuẩn cho phép phân tích:

Lấy 6 ống cuvet, ghi tên các ống ĐC, 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với nồng

độ H2O2 là 0, 1, 2, 3, 4, 5 mM

Tiến hành pha loãng H2O2 như bảng 3.1 để được nồng độ tiêu chuẩn Chú ý: nồng độ H2O2 ở trên được tính sao cho: tổng thể tích cuối cùng của ống là 1.5 mL, đã thêm 13 µL TMB và 2 µL HRP

Mỗi ống sau khi pha loãng bổ sung 2 µL HRP trộn đều, tiếp đó bổ sung

13 µL TMB, dung dịch chuyển thành màu xanh Đo màu ở bước sóng 620

nm bằng máy đo quang phổ

 Phân tích trên mẫu thực

Mẫu được chuẩn bị như sau: Nuôi các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng trong 24h, ở nhiệt độ 37C, nuôi lắc 150 vòng/phút Hút 1,5

mL dịch nuôi vào ống Eppendorf 1,5 mL, ly tâm 10000 vòng/5 phút Loại bỏ cặn, thu dịch

Tiến hành thí nghiệm lần lượt từng ống: Chuẩn bị các ống cuvet tương ứng với mẫu cần xác định, ghi tên mẫu Hút 1000 µL dịch thu được của mỗi mẫu vào ống tương ứng Sau đó lần lượt bổ sung 485 µL MRS, thêm 2 µL HRP, đảo nhẹ, và 13 µL TMB (10 mM) Ngay lập tức đo màu ở bước sóng 620 nm bằng máy đo quang phổ

Thí nghiệm được thực hiện 3 lần, kết quả tính được là giá trị trung bình sau 3 lần thực hiện thí nghiệm

2.3.3.3 phương pháp xác định khả năng chịu axit

Sau 24 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trường

MRS, tiến hành thử nghiệm khả năng chịu axit bằng cách ủ ở pH 2 và pH 3 trong 3 giờ Pha loãng và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch để xác định khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn [58]

2.3.3.4 Phương pháp xác định khả năng chịu muối mật

Các chủng vi khuẩn đã sàng lọc có khả năng sinh H2O2 được nuôi cấy trong bình chứa môi trường MRS có bổ sung muối mật Oxgall (Sigma) với

30 nồng độ 0,3% và ống đối chứng không bổ sung muối mật Ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 24 giờ, sau đó kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng và cấy trên đĩa thạch, đếm số lượng khuẩn lạc

2.3.4 Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi

Sử dụng đĩa petri chứa môi trường MRS agar (pH 6.2) có bổ sung 10

mM muối mật và CaCl2 (0,375 g/L) Đặt khoanh giấy thấm lên các vị trí đánh

số tương ứng với các chủng được kiểm tra Nhỏ 15 µL dịch nuôi cấy mỗi

chủng Lactobacillus lên vị trí khoanh giấy thấm tương ứng Đĩa thạch được ủ

ở ở 37o

C trong 48 giờ Vòng sáng nhìn thấy xung quanh khoanh giấy thấm

cho thấy hoạt động thuỷ phân BSH của các chủng Lactobacillus Kết quả

được đánh giá bằng cách đo đường kính của vòng sáng Các chủng

Lactobacillus cấy trên môi trường thạch MRS không có muối mật được sử

dụng làm đối chứng âm Thí nghiệm được lặp lại ba lần

2.3.4.2 Xác định sự có mặt của các gen bsh

Các gen tương đồng với gen mã hóa cho enzyme xúc tác thủy phân

muối mật (bsh) đã được phát hiện trong Lactobacillus Nghiên cứu cho thấy

có sự tồn tại các homologs (gen tương đồng) bao gồm bsh1, bsh2, bsh3 và

bsh4 ở vi khuẩn Lactobacillus [40]

Để xác định sự có mặt của các gen này, chủng vi khuẩn có hoạt tính đã chọn lọc được nuôi cấy qua đêm trong môi trường MRS, sau đó thu sinh khối

31

và tách DNA tổng số sử dụng DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen theo

hướng dẫn của nhà sản xuất Các trình tự mã hóa của các gen bsh1, bsh2,

bsh3, và bsh4 sẽ được khuếch đại bằng PCR với mồi bsh1-F/R, bsh2 -F/R, bsh3 -F/R, và bsh4 -F/R như trong bảng 2.2 [60]

Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh

1 mL dịch tế bảo vi khuẩn S aureus ATCC-23235 được trải đều trên bề

mặt đĩa petri chứa 15 mL môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau

đó hút bỏ dịch thừa Để đĩa thạch vào tủ ấm 37°C trong 15 phút Dịch nuôi vi

khuẩn Lactobacillus 24 giờ được ly tâm loại bỏ tế bào Nhỏ 20 µL dịch ly tâm các chủng vi khuẩn Lactobacillus gồm Lac.VFE-04 , Lac.VFE-08, Lac.VFE-

14 hoặc dung dịch muối sinh lý (làm đối chứng) thành từng điểm riêng trên

đĩa petri đã trải vi khuẩn S aureus Ủ các đĩa petri đã được cấy vi khuẩn trong

điều kiện hiếu khí với nhiệt độ 37C Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hiện tượng và đo kích thước vòng kháng khuẩn quanh điểm nhỏ dịch ly tâm các

Để giải trình tự của các chủng Lactobacillus quan tâm cần môt lượng

lớn DNA của gen để đem giải trình tự, do đó công đoạn đầu tiên là tiến hành khuếch đại đoạn gen cần thiết bằng kỹ thuật PCR

Phương pháp:

 Tách DNA tổng số vi khuẩn

Bước 1: Thu tế bào: Cho 1,5 mL dung dịch MRS nuôi vi khuẩn cần tách vào ống eppendorf Sau đó ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút

Loại bỏ hoàn toàn phần dịch trong, thu cặn chứa tế bào vi khuẩn

Bước 2: Phá màng tế bào: Sử dụng dung dịch lysozyme để phá lớp màng

tế bào vi khuẩn Gram dương Hòa đều phần sinh khối tế bào đã thu trong

50 µL lysozyme Ủ ở 37C trong 30 phút Sử dụng đệm tách 400 µL/ 1 ống eppendorf Bổ sung 20 µL Proteinase K, dùng pipet hút lên-xuống

để trộn đều dịch Ủ ở 55C trong 1 giờ Khoảng 15-30 phút, đảo đều ống

eppendorf trong khoảng 10 giây

Bước 3: Phân tách thành phần DNA và Protein: Bổ sung 400 µL hỗn

hợp PCI vào ống eppendorf, Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 20 phút Sau khi ly tâm, dung dịch trong ống eppendorf phân tách làm 3 lớp: lớp dung dịch Phenol ở dưới, lớp protein kết tủa ở giữa, phần dung dịch nổi chứa DNA ở trên Hút 300 µL phần dịch nổi, đưa sang ống eppendorf

mới

Bước 4: Sử dụng Isopropanol: Tỉ lệ 1:1 so với lượng dung dịch chứa DNA Sử dụng khoảng 300 µL để trong nhiệt độ phòng khoảng 1 tiếng