NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LÁ KIM Ở TÂY NGUYÊN, TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ LIỄU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LÁ KIM Ở TÂY NGUYÊN, VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà nội-2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TSKH Trần Văn Sung Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đinh Thị Phòng Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Khí hậu Việt Nam phân hóa đa dạng theo địa hình, với đặc điểm đa dạng khí hậu tạo thảm thực vật vơ phong phú Lồi kim loài quan trọng sinh thái, kinh tế văn hóa nhiều địa phương Lâm Đồng, KomTum, Gia Lai… Theo số liệu thống kê Nguyễn Tiến Hiệp cộng (2005), số 34 lồi kim Việt Nam có tới 15 lồi Tây Nguyên (chiếm 44,11%) Vì mà Tây Nguyên coi “cái nơi” lồi kim có tính đa dạng vào hàng thứ hai Việt Nam, đặc biệt Đắk Lắk, Kon Tum Lâm Đồng Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) loài kim có giá trị kinh tế khu vực Tây Nguyên, Việt Nam Tuy nhiên, loài Kim giao núi đất chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học nước, Đỉnh tùng nghiên cứu hạn chế số nước Trung Quốc, Nhật Bản chưa nghiên cứu Việt Nam, Hồng đàn giả có nghiên cứu thành phần hóa học qua tinh dầu lá.Vì việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học ba lồi kim có nhiều triển vọng tìm chất có cấu trúc có hoạt tính sinh học lý thú làm tiền đề cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc chữa bệnh góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên sẵn có vùng Tây Nguyên Kết hợp với kết nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền tạo sở khoa học vững cho việc bảo tồn phát triển bền vững loài kim khu vực Tây Nguyên, Việt Nam Xuất phát từ sở khoa học nêu lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học đa dạng nguồn gen di truyền số loài kim Tây nguyên, Việt Nam” Mục tiêu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi kim nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học cao có cấu trúc hóa học lí thú Kết hợp với kết nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền giúp cho cơng tác bảo tồn lồi kim – loài quan trọng vùng Tây Nguyên, Việt Nam Những nghiên cứu luận án - Phân lập hợp chất từ phận loài kim nghiên cứu phương pháp sắc ký cột - Xác định cấu trúc hoá học hợp chất phân lập phương pháp phổ IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR kết hợp với phương pháp vật lí khác - Thử hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết chất phân lập - Đánh giá tính đa dạng nguồn gen di truyền lồi kim nghiên cứu loại thị ISSR SSR CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loài kim nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm thực vật tình trạng bảo tồn 1.1.1.1 Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii) 1.1.1.2 Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) 1.1.1.3 Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) 1.1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài chi Cephalotaxus, Dacrydium Nageia 1.1.2.1 Thành phần hóa học 1.1.2.2 Hoạt tính sinh học 1.2 Ứng dụng kĩ thuật phân tích ISSR SSR nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 1.2.1 Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) 1.2.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) 1.2.3 Một số thành tựu nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền số loài thuộc chi Cephalotaxus, Dacrydium Nageia CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu thực vật 2.1.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 2.1.1.1 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Mẫu lá, vỏ thân loài Đỉnh tùng tiêu số CPC 4718; Mẫu lá, cành vỏ thân loài Kim giao núi đất mẫu tiêu Nr CPC 4715; Mẫu gỗ thân, cành loài Hoàng đàn giả tiêu số CPC 4708 thu hái tỉnh Lâm Đồng vào tháng / 2012 Tiến sĩ Nguyễn Tiến Hiệp,Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật (Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học giữ Bảo tàng thiên nhiên, VAST, Hà Nội, Việt Nam 2.1.1.2 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền Những mảnh lá/vỏ gỗ/rễ loài Mỗi loài nghiên cứu lựa chọn 70 cá thể (riêng loài Đỉnh tùng có 34 cá thể) 2.2 Hóa chất, thiết bị 2.2.1 Nghiên cứu hóa học 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 2.3 Chiết tách chất từ loài kim 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật Mẫu thực vật loài nghiên cứu chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần 2.3.1.2 Phương pháp xác định cấu trúc Việc xác định cấu trúc hóa học chất thực việc kết hợp phương pháp phổ (FT–IR), phổ khối (MS), (1D 2D NMR) 2.3.2 Chiết tách chất từ loài kim 2.3.2.1 Đỉnh tùng (C mannii) Chiết alkaloid phận Đỉnh tùng (1 kg) thu gam alkaloid tổng Từ vỏ Đỉnh tùng (0,5 kg) thu 7,9 gam alkaloid tổng 30 g dịch chiết EtOAc không chứa alkaloid Từ gam alkaloid tổng cành Đỉnh tùng (ĐTL), chạy sắc ký cột silica gel hệ dung mơi CH2Cl2 / MeOH (98 : 2), sau tăng dần đến tỉ lệ (1:1) Tiếp tục sắc ký cột silica gel nhiều lần phân đoạn phân lập hợp chất kí hiệu DT1 (30mg) DT7 (11 mg) Từ 7,9 gam cặn vỏ alkaloid tổng (ĐTV) phân tách sắc ký cột silica gel, rửa giải hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (1:0) tăng dần tỉ lệ phân cực kết thúc cột (0:1) thu phân đoạn (ĐTV.1ĐTV.9) Tiếp tục sắc ký cột silica gel nhiều lần phân đoạn phân lập hợp chất kí hiệu DT2 (21 mg), DT3 (18 mg), DT4 (15 mg), hỗn hợp DT5 (120 mg) (DT5.1 DT5.2), DT6 (30 mg), DT8 (50 mg) Từ dịch chiết EtOAc (30 gam) phần không chứa alkaloid, chạy sắc ký cột silica gel hệ dụng môi (CH2Cl2 / MeOH; 95:5) phân lập hợp chất flavonoid là: Epicatechin DT9 (20 mg) Epigallocatechin DT10 (25 mg)  Phân lập, tinh chế chất từ dịch chiết alkaloid tổng Hình 2.3 Sơ đồ phân lập chất từ vỏ Đỉnh tùng 2.3.2.2 Hoàng đàn giả (D elatum) 13 gam cao chiết EtOAc (HĐE) phân tách phương pháp sắc kí cột silica gel nhiều lần với hệ dung mơi thích hợp thu chất kí hiệu HĐ1 (15 mg), HĐ2 (10 mg), HĐ3(15 mg), HĐ4 (11 mg), HĐ5 (16 mg), HĐ6 (14 mg) Hình 2.5 Sơ đồ phân lập chất từ dịch chiết EtOAc mẫu thân cành Hoàng đàn giả 2.3.2.3 Kim giao núi đất (N wallichiana) Từ cao chiết n-hexane (8,0 g) sắc ký cột silica gel (n-hexane : CH2Cl2) nhiều lần phân đoạn phân lập hợp chất kí hiệu KG6 (15 mg) KG7 (11mg) Từ cao chiết methanol (20 g) sắc ký cột silica gel sephadex nhiều lần thu chất kí hiệu KG10 (12 mg) Tiến hành sắc ký cột silica gel cao chiết dịch ethyl acetate (43 g) hệ dung môi (n-hexane : EtOAc ; 95 : 50:100) thu 33 phân đoạn kí hiệu từ KGE.1 đến KGE.33 Chọn chạy sắc ký cột silica gel phân đoạn KGE.11 (570 mg); KGE.22 (653 mg); KGE.29 (353 mg); KGE.31 (3,4 g) KGE.32 (1g) với hệ dung mơi rửa giải có độ phân cực khác thu chất KG1, KG2, KG3, KG4, KG5, KG8, KG9 Hình 2.9 Sơ đồ phân lập chất từ dịch chiết EtOAc cành Kim giao núi đất  Số liệu phổ hợp chất phân lập từ loài kim nghiên cứu  Hợp chất DT1: Cephalotaxine (+) ESI-MS: m / z 316 [M + H]+, CTPT C18H21NO4 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 4,92 (s H-1), 4,75 (d, J = 9,0, H-3), 3,67 ( d, J = 9,0, H-4), 2,00 (m, H-6a), 1,86 (m, H-6b), 1,75 (m, H-7), 3,06 (m, H-8), 2,92 ( td, J =11,0; 7,0, H-10), 2,35 (dd, J =14,5; 6,5, H-11a), 3,35m (H-11b), 6,64 (s, H-14), 6,67 (s, H-17), 5,90 (s, H-18), 3,72 (s, H-19) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 97,6 (C-1), 160,5 (C-2), 73,3 (C-3), 57,2 (C-4), 70,6 (C-5), 43,5 (C-6), 20,3 (C-7), 53,8 (C-8), 48,5 (C-10), 31,6 (C-11), 134,2 (C-12), 128,0 (C-13), 112,6 (C-14), 146,9 (C-15), 146,1 (C-16), 110,3 (C-17), 110,9 (C-18), 57,2 (C-10)  Hợp chất DT2: Cephalotaxine–β–N-oxide (+) HR-ESI-MS: m / z 354,1303 [M + Na]+ [M + H]+ CTPT C18H21NO5 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 4,79 (s, H-1), 4,15 (d, J = 4,3, H-3), 3,40 (d, J = 4,3, H-4), 2,01 (m, H-6a), 2,01 (m, H-6b), 2,18 (m, H-7a), 2,30 (m, H-7b), 3,35 (m, H-8a), 3,40 (m, H-8b), 3,42 (m, H-10a), 3,51 (m, H10b), 2,26 (m, H-11a), 3,84 (m, H-11b), 6,58 (s, H-14), 6,58 (s, H-17), 5,90 (s, H-18a), 5,94 (s, H-18b), 3,76 (s, H-19) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 97,94 (C-1), 169,83 (C-2), 77,63 (C-3), 58,30 (C-4), 89,39 (C-5), 30,05 (C-6), 17,52 (C-7), 69,05 (C-8), 63,20 (C-10), 29,85 (C-11), 134,07 (C-12), 126,99 (C-13), 112,88 (C-14), 146,43 (C-15), 146,99 (C-16), 110,18 (C-17), 101,16 (C-18), 57,14 (C-19)  Hợp chất DT3: Deoxyharringtonine (+) ESI-MS: m / z 516 [M + H]+ 298 [100, M – C10H17O5]+, CTPT C28H37NO8.1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5,04 (d, J = 0,5, H-1), 6,00 ( dd, J = 0,5, 10, H-2), 3,77 ( d, J = 10, H-4), 6,53 (s, H-14), 6,62 (s, H-17), 5,85 (d, J = 1,5 Hz, H-18a), 5,87 (d, J = 1,5 Hz, H-18b), 3,68 (s, H-19), 3,57 (s, H5’), 0,97 (m, H-2”α), 1,28 (m, H-2”β), 1,41 (m, H-3”), 0,83 (3H, d, J = 6,7; H4”a), 0,84 (3H, d, J = 6,7, H-5”a) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 100,08 (C-1), 157,83 (C-2), 74,61 (C-3), 55,91 (C-4), 70,63 (C-5), 43,40 (C-6), 20,32 (C-7), 53,94 (C-8), 48,63 (C-10), 31,37 (C-11), 133,33 (C-12), 128,48 (C-13), 112,67 (C-14), 146,67 (C-15), 145,83 (C-16), 109,71 (C-17), 100,80 (C-18), 57,12 (C-19), 174,07 (C-1’), 74,74 (C-2’), 42,77 (C-3’), 170,47 (C-4’), 51,49 (C-5’), 36,74 (C-1”), 31,60 (C-2”), 28,01 (C-3”), 22,26 (C-4”), 22,68 (C5”)  Hợp chất DT4: Nordeoxyharringtonine (+) HR-ESI-MS: m / z 502,24405 [M + H]+, CTPT C27H35NO8 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5,03 (s, H-1), 5,95 (d, J = 10, H-3), 3,76 (d, J = 10, H-4), 6,52 (s, H-14), 6,61 (s, H-17), 5,86 (d, J =1,5, H-18a), 5,83 (d, J =1,5, H18b), 3,65 (s, H-19), 3,55 (s, H-5’), 0,83 ( d, J = 6,5, H-3”a), 0,89 ( d, J = 6,5, H4”a) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 100,0 (C-1), 157,7 (C-2), 75,1 (C3), 55,8 (C-4), 70,5 (C-5), 43,3 (C-6), 20,2 (C-7), 53,8 (C-8), 48,5 (C-10), 31,2 (C-11), 133,2 (C-12), 128,3 (C-13), 112,6 (C-14), 146,6 (C-15), 145,7 (C-16), 109,6 (C-17), 100,7 (C-18), 57,0 (C-19), 174,3 (C-1’), 74,7 (C-2’), 43,3 (C-3’), 170,4 (C-4’), 51,3 (C-5’), 46,6 (C-1”), 24,0 (C-2”), 23,8 (C-3”), 23,9 (C-4”)  Hợp chất DT5.1: Isoharringtonine (+) HR-ESI-MS: m / z 532,25485 [M + H]+, CTPT C28H37NO9 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5,08 (s, H-1), 6,03 (d, J = 9,8, H-3), 3.79 (d, J = 9,8, H-4), 6,54 (s, H-14), 6,65 (s, H-17), 5,80 s; 5,86 brs (H-18), 3,69 (s, H-19), 3,35 (s, H-3’), 3,61 (s, H-5’), 0,85 (d, J = 6,7, H-4”), 0,87 (d, J = 6,7, H-5”) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 100,44 (C-1), 157,52 (C-2), 74,67 (C-3), 55,81 (C-4), 70,66 (C-5), 43,34 (C-6), 20,25 (C-7), 53,84 (C-8), 48,44 (C-10), 31,37 (C-11), 128,28 (C-12), 133,35 (C-13), 112,61 (C-14), 146,69 (C-15), 145,65 (C-16), 109,88 (C-17), 100,81 (C-18), 57,10 (C-19), 173,00 (C-1’), 79,13 (C-2’), 75,43 (C-3’), 171,65 (C-4’), 52,28 (C-5’), 32,99 (C-1”), 31,72 (C2”), 28,06 (C-3”), 22,71 (C-4”), 22,22 (C-5”)  Hợp chất DT5.2: Norisoharringtonine (+) HR-ESI-MS: 518,23903 [M + H]+, CTPT C27H35NO9 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5,08 (s, H-1), 6,00 (d, J = 9,8, H-3), 3,79 (d, J = 9,8, H-4), 6,54 (s, H-14), 6,65 (s, H-17), 5,80 s; 5,86 br s (H-18), 3,68 (s, H19), 3,28 (s, H-3’), 3,63 (s, H-5’), 0,96 (d, J = 6,7, H-3”), 0,97 (d, J = 6,7, H4”), 5,08 (s, H-5”) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 100,44 (C-1), 157,52 (C-2), 75,03 (C-3), 55,81 (C-4), 70,66 (C-5), 43,34 (C-6), 20,25 (C-7), 53,84 (C-8), 48,44 (C-10), 31,37 (C-11), 128,28 (C-12), 133,35 (C-13), 112,65 (C14), 146,65 (C-15), 145,65 (C-16), 109,88 (C-17), 100,81 (C-18), 57,10 (C-19), 173,20 (C-1’), 79,79 (C-2’), 75,34 (C-3’), 171,55 (C-4’), 52,33 (C-5’), 32,14 (C-1”), 24,27 (C-2”), 24,29 (C-3”), 23,71 (C-4”)  Hợp chất DT6: 3-epischellhammericine (+) ESI-MS: 314 [M+H]+ 282 [M+H–CH3OH]+, CTPT C19H23NO3 1HNMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5,54 (br s, H-1), 3,23 (m), 1,56 (t, J = 11,0; H-4ax), 6,72 (s, H-15), 6,60 (s, H-18), 5,90 (d, J = 1,0, H-19a), 5,88 (d, J = 1,0, H-19b), 3,29 (s, H-20) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 127,92 (C-1), 46,34 (C-2), 76,00 (C-3), 36,03 (C-4), 68,84 (C-5), 131,61 (C-6), 28,79 (C-7), 51,14 (C-8), 54,60 (C-10), 28,65 (C-11), 37,36 ( C-12), 134,59 ( C-13), 136,40 (C-14), 108,79 (C-15), 145,65 (C-16), 145,37( C-17), 111,34 (C-18), 100,83 (C19), 55,83 (C-20)  Hợp chất DT7: Manniicine (+) ESI-MS: m / z 314,1745 [M + H]+, CTPT C19H23NO3 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δH (ppm): 6,02 (ddd, J = 1,9; 4,5; 10,2 Hz, H-1), 5,08 (br d, J = 10,2 Hz, H-2); 1,85 (1H, t, J = 13,0 Hz, H-4ax); 3,24 (3H, s, H-20); 5,92 (d, J = 1,5 Hz, H19a), 5,91 (d, J = 1,5 Hz, H-19b) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δC (ppm): 116,18 (C-1), 130,87 (C-2), 74,29 (C-3), 32,07 (C-4), 68,18 (C-5), 38,56 (C-6), 27,56 77,98 (C-22), 37,66 (C-23), 30,48 (C-24), 29,22 (C-25), 22,75 (C-26), 23,41 (C27)  Hợp chất HĐ5: 20-hydroxyecdysone (+)-ESI-MS: m / z = 463 [M+H-H2O]+, 445 [M+H-2H2O]+, 427 [M+H3H2O]+, 409[M+H-4H2O]+ (-) ESI-MS: m / z = 515 [M + Cl] -, 479 [M-1]-, 461 [M-1-H2O]-, CTPT C27H44O7 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 1,82 (m, 1-Hα); 1,45 (m, H-1β), 3,86 (dt, J = 11,5; 2,1, H-2), 3,97 (d, J = 2,1, H-3), 2,392,43 (m, H-5), 5,83 (d, J = 2,2, H-7), 3,18 (t, J = 8,2, H-9), 2,39-2,43 (m, H-17), (0,91 s, H-18), 0,99 (s, H-19), 1,20 (s, H-21), 3,36 (m, H-22), 1,22 (s, H-26), 1,21 (s, H-27) 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 37,78 (C-1), 68,69 (C-2), 68,52 (C-3), 32,51 (C-4), 51,78 (C-5), 206,44 (C-6), 122,13 (C-7), 167,97 (C-8), 35,10 (C-9), 39,28 (C-10), 21,50 (C-11), 31,78 (C-12), 49,00 (C-13), 85,23 (C14), 32,83 (C-15), 21,50 (C-16), 50,53 (C-17), 18,04 (C-18), 24,40 (C-19), 78,41 (C-20), 21,26 (C-21), 77,91 (C-22), 27,35 (C-23), 42,38 (C-24), 71,29 (C-25)  Hợp chất HĐ6: Ajugasterone C (-) ESI-MS: m / z = 515 [M + Cl] -, (+) ESI-MS: m / z = 538,8 [M+ Na+2H2O]+ CTPT C27H44O7 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 4,03 (dt, J = 3,6; 11,6, H-2), 3,97 (d, J = 2,6, H-3 ), 1,69-1,83 (m, H-4), 2,35 (dd, J = 13,0; 4,0, H-5), 5,82 (d, J =2,2 , H-7), 3,17 (dd, J = 8,9; 2,6, H-9), 4,12 (m, H11), 2,16 (m, H-12a), 2,15 (m, H-12b), 2,43 (t, J = 9,0, H-17), 0,89 (s, H-18a), 1,08 (s, H-18b), 1,22 (s, H-21), 3,35 (m, H-22), 1,23-1,27 (m, H-23), 1,61 (m, H-25), 0,94 (d, J = 6,5 , H-26), 0,93 (d, J = 6,5, H-27) 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 39,07 (C-1), 68,92 (C-2), 68,55 (C-3), 33,27 (C-4), 52,76 (C-5), 206,64 (C-6), 122,72 (C-7), 165,70 (C-8), 42,92 (C-9), 39,90 (C-10), 69,49 (C11), 43,77 C-12), 49,00 (C-13), 84,86 (C-14), 31,83 (C-15), 21,51 (C-16), 50,27 (C-17), 18,87 (C-18), 24,61 (C-19), 77,75 (C-20), 20,97 (C-21), 77,94 (C-22), 30,47 (C-23), 37,64 (C-24), 29,21 (C-25), 23,41 (C-26), 22, 75 (C-27)  Hợp chất KG1: Amentoflavone (+)-ESI-MS: m / z = 539 [M+H]+; (-) ESI-MS m / z = 537 [M-H]- ; CTPT: C30H18O10 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ (ppm): 6,77 (s, H-3), 6,15 (br s, H-6), 6,30 (br s, H-8), 8,26 (d, J = 2,0, H-2’), 6,89 (d, J = 8,5, H-5’), 7,89 (dd, J = 2,0; 8,5, H-6’), 6,68 (s, H-3”), 6,03 (s, H-6” ), 7,67 (d, J = 9,0, H-2”’), 6,55 11 (d, J = 9,0, H-3”’), 6,55 (d, J = 9,0, H-5”’), 7,67 (d, J = 9,0, H-6’’’) 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ (ppm): 164,56 (C-2), 101,90 (C-3), 181,59 (C-4 ), 161,39 (C-5), 161,39 (C-6), 163,90 ( C-7), 93,93 (C-8), 93,93 (C-9), 103,51 (C10), 117,95 (C-1’), 126,46 (C-2’), 123,50 (C-3’), 160,46 (C-4’), 119,19 (C-5’), 131,33 (C-6’), 162,77 (C-2”), 102,38 (C-3”), 181,51 (C-4”), 160.54 (C-5”), 101,57 (C-6’’), 160,54 (C-7’’), 106,87 ( C-8”), 106,87 ( C-9”), 101,73 (C-10”), 121,76 (C-1”’), 128,08 (C-2”’), 115,45(C-3’’’), 160,46 (C-4’’’), 115,45 (C5’’’), 128,08 (C-6’’’)  Hợp chất KG2: 4”’-O-methylamentoflavone (podocarpus flavone A) (+) ESI-MS: m / z = 575 [M+Na]+, 553 [M+H]+; (-) ESI-MS: m / z = 551 [M-H]- ;CTPT: C31H20O10 1H-NMR [(CD3)2CO, 500 MHz] δ (ppm): 6,73 (s, H3), 6,24 (d, J = 2,0, H-6), 6,51 (d, J = 2,0, H-8), 8,11 (d, J = 2,5, H-2’), 7,2 (d,J = 8,5, H-5’), 8,04 (dd, J = 2,5; 8,5, H- 6’), 6,71 (s ,H-3’’), 6,46 (br s, H6’’), 7,73 (d, J = 9,0 ,H-1’’’), 6,94 (d, J = 9,0 ,H-3’’’), 6,94 ( d, J = 9,0 , H5’’’), 7,73 (d, J = 9,0 ,H-6’’’), 13,01 (s, OH-5”), 13,15 (s, OH-5), 3, 81 (s ,OCH3- 4’’’) 13C-NMR [(CD3)2CO, 125 MHz] δ (ppm): 164,76 (C-2), 104,19 (C-3), 183,45 (C-4), 162,77 (C-5), 99,78 (C-6), 165,05 (C-7), 94,77 (C-8), 160,24 (C-9), 104,33 (C-10), 120,82 (C-1’), 132,58 (C2’), 124,28 (C-3’) , 162,77 (C-4’), 117,48 (C-5’), 12 8,84 (C-6’), 165,05 (C-2’’), 104,33 (C-3’’), 183,06 (C-4’’), 162,34 (C-5’’), 104,19 (C-6’’), 162,77 (C-7’’), 105,34 (C-8’’), 158,80 (C-9’’), 104,19 (C-10’’), 123,40 (C-1’’’), 128,91 (C-2’’’), 115,27 (C3’’’), 163,60 (C-4’’’), 115,27 (C-5’’’), 128,91 (C-6’’’), 55,89 ( OCH3-4’’’)  Hợp chất KG3: 4’,4’’’,7’’-trimetoxyamentoflavone (+) HR-ESI-MS: m / z = 581,1415 CTPT: C33H24O10 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, 500 MHz) δ (ppm): 6,61 (s, H-3 ), 6,28 ( br s,H-6), 6,41 (br s,H-8), 7,86 (d, J = 2,5, H-2’), 7,18 (d, J = 9,0, H-5’), 8,00 (dd, J = 2,5; 9,0, H-6’), 6,61 (s ,H-3’’), 6,55 (s,H-6’’), 7,48 (d, J = 9,0, H-2’’’), 6,84 (d, J = 9,0,H3”’), 6,84 (d, J = 9,0,H-5’’’), 7,48 (d, J = 9,0, H-6’’’), 3,89 (s OCH3 ), 3,81 (s OCH3), 3,80 (s OCH3) 13C-NMR(CDCl3+CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 163,98 (C-2), 10379 (C-3), 182,84 (C-4), 161,64 (C-5), 99,10 (C- 6), 164,02 ( C- 7), 94,18 (C- 8), 157,82 (C- 9), 104,35 (C-10), 121,64 (C-1’), 130,78( C-2’), 123,12 (C- 3’), 160,51 (C-4’), 111,04 (C-5’), 127,92 (C-6’), 164,02 (C- 2”), 12 102,97 (C-3”), 182,28 (C-4”), 161,40 (C-5”), 104,66 (C-6”), 162,69 (C-7’’), 95,20 (C-8’’), 153,97 (C-9’’), 104,75 (C-10’’), 122,94 (C-1’’’) , 127,61 (C2’’’), 114,27 (C-3’’’), 162,50 (C-4’’’), 114,27 (C-5’’’), 127,61 (C-6’’’), 56,02 (OCH3), 55,15 (OCH3), 55,65 (OCH3)  Hợp chất KG4: 3β-hydroxytotarol Phổ (+) ESI-MS có pic m / z = 285,2 (100, [M + H-H2O]+); CTPT: C20H30O2 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 1,49 (td, J = 13,1; 4,3, H-1α), 2,25 (dt, J = 13,1; 3,3, H-1β), 1,7-1,8 (m, H-2), 3,29 (dd, J = 11,3; 6,5, H-3), 1,25 (dd, J = 12,4; 2,0, H-5), 1,71 (m, H-6), 2,97 (dd, J = 17,1; 6,4, H-7α), 2,75 (m, H-7β), 6,96 (d, J = 8,5, H-11), 6,51 (d, J = 8,5, H-12), 3,26 (m, H-15), 1,33 (d, J = 7,0, H-16), 1,34 (d, J = 7,0, H-17), 1,07 (s, H-18 ), 0,89 (s, H-19), 1,18 ( s, H20) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 37,74 (C-1), 28,15 (C-2), 78,85 (C3), 38,79 (C-4), 49,05 (C-5), 19,13 (C-6), 29,05 (C-7), 133,8 (C-8), 142,26 (C-9), 37,51 (C-10), 123,0 (C-11), 114,42 (C-12), 152,23 (C-13), 131,07 (C-14), 27,26 (C-15), 20,29 (C-16), 20,29 (C-17), 15,32 (C-18), 28,12 (C-19), 25,16 (C-20)  Hợp chất KG5: Totarol-19-cacboxylic acid Phổ (-) ESI-MS cho thấy pic ion giả phân tử m / z 315,12 ([M-H]-) CTPT: C20H28O3 1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 1,05 (dd, J = 13,5; 4,2, H-1α), 1,93-2,04 (m, H-1β), 1,42 (br d, J = 11,9, H-2α), 1,57-1,61 (m, H-2β), 0,98 (m, H-3α), 1,93-2,04 (m, H-3β), 1,35 (m, H-5), 1,29 (m, H-6α), 2,18 – 2,25 (m, 6β), 2,62-2,69 (m, H-7α), 2,95 ( dd, J = 4,8; 16,7, H-7β), 6,98 (d, J = 8,5, H-11), 6,51 (d, J = 8,5, H-12), 3,25-3,31 (m, H-15), 1,33 ( d, J = 7,1, H-16), 1,34 ( d, J = 7,1, H-17), 1,12 (s, H-18), 1,33 (s, H-20) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 40,12 (C-1), 20,05 (C-2), 37,22 (C-3), 43,76 (C-4), 52,08 (C-5), 21,10 (C-6), 30,00 (C-7), 134,28 (C-8), 140,99 (C-9), 38,52 (C-10), 124,14 (C11), 114,58 (C-12), 152,05 (C-13), 130,88 (C-14), 27,26 (C-15), 20,30 (C-16), 20,40 (C-17), 28,61 (C-18), 183,92 (C-19), 23,20 (C-20)  Hợp chất KG6: Ferruginol (+) ESI-MS: m / z 287 [M+H]+ cho CTPT: C20H30O 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 6,63 (s, H-11), 6,83 (s, H-14), 3,1 (sept, J = 6,9, H-15), 1,22 (d, J = 7,0, H-16), 1,23 (d, J = 7,0 , H-17), 0,91 (s, H-18), 0,94 (s, H-19), 1,17 (s, H-20) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 38,87 (C-1), 19,23 (C-2), 41,69 13 (C-3), 33,44 (C-4), 50,35 (C-5), 19,32 (C-6), 29,76 (C-7), 127,30 (C-8), 148,67 (C-9), 37,51 (C-10), 110,97 (C-11), 150,67 (C-12), 131,37 (C-13), 126,62 (C14), 26,81 (C-15), 22,75 (C-16), 22,56 (C-17), 33,32 (C-18), 21,62 (C-19), 24,80 (C-20)  Hợp chất KG7: Sugiol (+) ESI-MS: m / z = 301 [M+H]+ CTPT: C20H28O2 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 1,74 (dd, J = 4,0 , H-6), 6,78 ( s , H-11), 7,65 (s , H-14), 3,14 (m , H-15), 1,13 (d, J =7,0 , H-16), 1,15 (d, J =7,0 H-17), 0,88 (s, H-18 ), 0,94 (s , H-19), 1,15 (s, H-20) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 37,41 (C-1), 18,48 (C-2), 40,80 (C-3), 32,24 (C-4), 49,05 (C-5), 35,46 (C-6), 196,44 (C-7), 122,52 (C-8), 155,77 (C-9), 37,41 (C-10), 109,28 (C-11), 160,05 (C-12), 132,46 (C-13), 124,95 (C-14), 26,01 (C-15), 22,15 (C-16), 22,81 (C-17), 32,24 (C-18), 21,08 (C-19), 22,97 (C-20)  Hợp chất KG8: Nagilactone B (+) HR-ESI-MS: m / z 387,1409 (100%, C19H24O7Na, 365,1587 (90%, [M + H]+ Phổ MS / MS2 đỉnh m/z 365.1587 chứa đỉnh m / z 347,1483 (100, C19H23O6 [M+H-H2O]+ CTPT C19H24O7 1H-NMR (CD3ODd6, 500 MHz) δ (ppm): 4,04 (d, J = 7,3, H-1), 3,88 (m, H-2), 2,24 ( t, J = 13,3, H-3α), 1,76 ( dd, J = 4,6; 5,0, H-3β), 1,88 ( d, J = 6,6, H-5), 4,99 (dd, J = 6,8; 8,4, H-6), 5,29 (d, J = 8,4, H-7), 6,46 (s, H-11), 3,28 (1H, hept., J = 6,8, H-15), 1,25 (d, J = 6,8, H-16), 1,33 ( d, J = 6,8, H-17), 1,42 (s, H-18), 1,45 (s, H-20) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ (ppm): 69,98 (C-1), 64,50 (C-2), 33,19 (C-3), 42,26 (C-4), 46,39 (C-5), 74,31 (C-6), 59,32 (C-7), 110,18 (C-8), 170,42 (C-9), 41,55 (C-10), 106,81 (C-11), 163,6 (C-12), 165,69 (C-14), 29,05 (C-15), 19,99 (C-16), 20,01 (C-17), 23,30 (C-18), 181,48 (C-19), 17,55 (C-20)  Hợp chất KG9: 5-hydroxystigmastane-6-one-3β-hexadecanoate ESI-MS (ion dương) m / z 707 [M+Na]+, 427 [M-C16H31O-H2O]+; ESI-MS (ion âm) m / z 719 [M+Cl]-, CTPT C45H80O4 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5,04 (1H, m, H-3), 2,25 (2H, t, J = 7,5, H-4), 0,64 (3H, s, H-18), 0,82 (3H, s, H-19), 0,88 (t, J = 7,0, H-21), 0,82 (3H, d, J = 6,0, H-26), 0,81 (3H, d, J = 6,0, H-27), 0,84 (t, J = 7,0) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 34,69 (C1), 32, (C-2), 80,39 (C-3), 37,34 (C-4), 70,29 (C-5 ), 212,21 (C-6 ), 41,77 (C-7), , 14 44,33 (C-9), 42,54 (C-10), 21,46 (C-11), 39,58 (C-12), 43,14 (C-13), 56,33 (C14), 22,79 (C-15), 27,55 (C-16), 56,07 (C-17), 11,58 (C-18), 14,23 (C-19), 36,13 (C-20), 18,16 (C-21), 33,89 (C-22), 23,76 (C-23), 45,84 (C-24), 28,10 (C-25), 19,04 (C-26), 19,82 (C-27), 22,70 (C-28), 11,98 (C-29)  Hợp chất KG10: 2-(4-hydroxyphenyl)-propan-1,3-điol (+) ESI-MS: m / z 169 [M+H]+, 151 [ M+H-H2O]+, 133 [M+H-2H2O]+ CTPT C9H12O3 1H-NMR (δ ppm, CD3OD): 2,88 (1H, quin, J = 7,0 Hz, H-2 ); 3,74 (2H, dd, J = 6,5; 11,0 Hz, 2H-1); 3,83 (2H, dd, J = 7.0, 11.0 Hz, 2H-3); 6.75 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, H-5’) ; 7,09 ( 2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, H-6’) 13CNMR (CD3OD, δ ppm): 51, 19 (C-2); 65, 20 (C-1, C-3); 130,18 (C-2’, C-6’); 116,21 ( C-3’, C-5’); 132,84 (C-1’); 157,15 (C-4’)  Hợp chất KG11: -Sitosterol H-NMR (CDCl3, 500 MHz),  (ppm): 5,38-5,36 (1H, m), 3,56-3,52 (1H, m), 2,33-2,25 (2H, m), 2,05-1,97 (2H, m), 1,89-1,82 (3H, m), 1,70-1,65 (2H, m), 1,54-1,11 (24H, m), 1,07 (3H, s), 1,00 (3H, d, J = 6,7 Hz), 0,87 (3H, t, J = 7,1 Hz), 0,86 (6H, br s), 0,70 (3H, s) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz),  (ppm): 140,79; 121,72; 71,82; 56,80; 56,10; 50,17; 45,88; 42,35; 42,33; 39,81; 37,28; 36,53; 36,16; 33,98; 31,93; 31,69; 29,20; 28,26; 26,14; 24,32; 23,10; 21,11; 19,82; 19,41; 19,06; 18,80; 12,00; 11,87 2.4 Thăm dò hoạt tính sinh học 2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH Sử dụng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) tạo gốc oxy hóa tự dùng để sàng lọc chất chống oxy hóa 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm màu Sulforhodamine B (SRB) 2.5 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 2.5.1 Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số tách chiết từ vỏ loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả, Kim giao núi đất phương pháp Porebski cộng (1997) 2.5.2 Phương pháp nhân sản phẩm PCR_ISSR PCR_SSR 15 Phản ứng nhân gen thực máy PCR system 9700 (Hoa Kỳ) với tổng thể tích 25 µl gồm thành phần: dung dịch đệm PCR 1X; MgCl2 2,5 mM; dNTPs mM; mồi 100 nM; 50ng DNA khuôn 0,5 đơn vị Taq polymerase 2.5.3 Phân tích số liệu phân tử Các thơng số đa dạng di truyền mức độ quần thể loài như: số alen trung bình locus (Na), số alen hiệu locus (Ne), phần trăm lô cút đa hình (PPB), số đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He), xác định cho thị ISSR SSR phần mềm GenAlex 6.3 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Về hóa học hoạt tính sinh học 3.1.1 Hoạt tính sinh học dịch chiết 3.1.1.1 Hoạt tính chống oxi hóa Cả dịch chiết từ loài Kim giao núi đất n-hexane, ethyl acetate methanol thử hoạt tính chống oxi hóa việc đo khả triệt tiêu gốc tự 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Kết cho thấy dịch chiết khơng thể hoạt tính chống oxi hóa 3.1.1.2 Hoạt tính gây độc tế bào Tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết dịch chiết Hoàng đàn giả tổng (HĐT) dịch chiết EtOAc (HĐE) dòng tế bào ung thư MCF7, LU-1, Hep-G2, KB Kết cho thấy dịch chiết HĐE thể hoạt tính với giá trị IC50 = 25,21 – 41,21µg/ml Dịch chiết HĐT chưa thể hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư nồng độ thử nghiệm 3.1.2 Xác định cấu trúc hóa học chất tách từ loài kim DT2 Cephalotaxine 16 DT3 DT1 Cephalotaxine β-N-oxide Desoxyharringtonine DT4.Nordesoxyharringtonine DT5.1: Isoharringtonine DT5.2 Norisoharringtonine DT6 3epischellhammericine DT7 Manniicine DT8 harringtonolide DT9 Epicatechin DT10 Epigallocatechin Các chất phân lập từ loài Đỉnh tùng (C mannii) 17 HĐ1 Acid Lambertic HĐ4 Ponasterone A HĐ2 Dacrydianon HĐ5 20-hydroxyecdysone HĐ3 Daucosterol HĐ6 Ajugasterone C Các chất phân phân lập từ loài Hoàng Đàn giả (D elatum) KG1: Amentoflavone KG3: 4’,4’’’,7’’trimethoxyamentoflavone KG6: Ferruginol KG2 : 4”’-O-metylamentoflavone KG4: 3βhydroxytotarol KG5: Acid totarol19-cacboxylic KG7: Sugiol KG8: Nagilacton B 18 KG9: 5-hydroxy stigmastane-6-one-3βhexadecanoat KG11: β-Sitosterol KG10: 2-(4hydroxyphenyl)propan-1,3-điol Cấu trúc chất phân lập từ loài Kim giao núi đất (N wallichiana) 3.1.2 Hoạt tính sinh học chất phân lập từ lồi kim 3.1.2.1 Hoạt tính chống oxi hóa Hợp chất DT4 (Nordesoxyharringtonine) đánh giá khả quét gốc tự 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Kết cho thấy hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa khơng mạnh với giá trị IC50 = 98,1g / ml Bốn hợp chất KG1, KG4, KG7 KG9 đại diện cho ba lớp chất biflavone, diterpenoid, steroid phân lập từ loài Kim giao núi đất tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH Kết thử hoạt tính cho thấy chất từ lồi Kim giao núi đất khơng thể khả triệt tiêu gốc tự 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 3.1.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào Hợp chất Nordeoxyharringtonine (DT4) chưa nghiên cứu nhiều hoạt tính gây độc tế bào có báo cáo hoạt tính ức chế tế bào bạch cầu chuột [24] Vì phân lập hợp chất từ loài Đỉnh tùng (C mannii) ý tới việc tiếp tục nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào chất dòng tế bào ung thư khác tế bào ung thư phổi (Lu), ung thư biểu mô miệng (KB), ung thư vú (MCF7) ung thư gan (Hep-G2) Kết cho thấy hợp chất DT4 thể hoạt tính mạnh dòng tế bào thử nghiệm Cụ thể dòng tế bào ung thư KB chất DT4 thể hoạt tính chống tế bào ung thư mạnh gấp 21 lần chất đối chứng, với dòng tế bào ung thư phổi Lu-1 mạnh gấp 91,5 lần, với tế bào ung thư gan HepG2 mạnh gấp 8,9 lần đặc biệt hoạt tính chống tế bào ung thư vú MCF7 mạnh gấp 107,5 lần ellipticine Các hợp chất phân lập từ dịch EtOAc loài Hoàng đàn giả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào bốn dòng tế bào ung thư Bảng 3.25 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập từ loài Hoàng đàn giả 19 ST T Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (M) Kí hiệu KB Lu-1 HepG2 MCF7 mẫu 162,53 ± 9,75 167,03 ± 19,75 224,24 ± 22,03 184,97 ± 17,28 HĐ1 185,63 ± 11,47 209,40 ± 15,65 135,50 ± 11,70 147,28 ± 17,56 HĐ4 194,02 ± 13 196,60 ± 8,33 199,85 ± 6,70 206,52 ± 16,56 HĐ5 > 100* > 100* > 100* > 100* HĐ6 Ellipticine 1,79 ± 0,12 1,50 ± 0,16 1,26 ± 0,16 1,30 ± 0,24 * Các chất khơng có hoạt tính khơng qui đổi (M) Đây kết nghiên cứu lần hoạt tính sinh học dịch chiết chất phân lập từ Hoàng đàn giả Năm hợp chất phân lập từ Kim giao núi đất KG5, KG8, KG9, KG10 KG11 thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào tám dịng tế bào ung thư người với ellipticine đối chứng dương Các kết thể bảng 3.26 Bảng 3.26 Hoạt tính gây độc tế bào chất KG1, KG4, KG5, KG8 KG9 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (M) Chất Hep G2 KB MCF7 SKMel2 14,51 16,40 15,36 HL60 SW626 SW480 KG8 13,71 KG4 289,34 305,79 264,27 262,35 302,55 276,19 314,47 288,47 KG9 >100* KG5 130,82 149,34 114,59 107,37 148,04 107,88 126,2 107,85 KG1 >100* Ellipticine 1,67 8,30 LU-1 >100* >100* >100* >100* 7,42 >100* 16,84 >100* 13,85 >100* >100* >100* >100* >100* >100* >100* >100* 1,87 1,38 1,54 1,79 1,75 1,59 1,67 * Các chất có giá trị IC50 > 100 μg/mL xem khơng có hoạt tính khơng qui đổi (M) Đây công bố hoạt tính chống ung thư hợp chất phân lập từ loài Kim giao núi đất 3.2.3 Mức độ thay đổi phân tử quần thể loài kim Tổng số 79 thị (44 thị ISSR 35 thị SSR) sử dụng để đánh giá tính đa dạng di truyền cho loài kim Tây Nguyên Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả Kim giao núi đất Trong đó, số lượng thị dùng để phân tích cho 20 lồi Kim giao núi đất cao (48 thị), thứ hai loài Hoàng đàn giả (47 thị) thấp loài Đỉnh tùng (37 thị) Bảng 3.28 Một số thông số di truyền lồi kim phân tích tổ hợp với hai thị ISSR SSR Loài Đỉnh tùng (C mannii) Hoàng đàn giả (D elatum) Kim giao núi đất (N.wallichiana) Ne I He h PPB (%) N Na *Fis 34 1,656 1,470 0,382 0,262 0,218 65,65 - 0,148 70 1,685 1,351 0,318 0,209 0,192 68,54 -0,002 70 1,748 1,570 0,445 0,309 0,262 74,79 0,333 Ghi chú: Na: số alen quan sát trung bình locus; Ne: số alen hiệu locus; I: số đa dạng di truyền theo Shannon; He: hệ số gen di hợp tử mong đợi; h: số đa dạng di truyền theo Nei; PPB: phần trăm phân đoạn đa hình; *Fis: hệ số giao phấn cận nỗn với p < 0,05 (số liệu xác định cho thị SSR) Kết phân tích thơng số di truyền loài kim loài Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 PPB = 74,79%); thứ hai loài Đỉnh tùng (Na = 1,656; Ne = 1,470; I = 0,382; He = 0,262; h = 0,218 PPB = 65,65%) thấp Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 PPB = 68,54%) (Bảng 3.28) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Thành phần hóa học lồi kim  Từ loài Đỉnh tùng (C mannii) Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học 11 hợp chất từ phận lá, cành vỏ loài Đỉnh tùng (C mannii), bao gồm hợp chất alkaloid có khung cephalotaxine (6/8) khung homoerythrina (2/8) đặc trưng cho chi Cephalotaxus, hợp chất flavonoid hợp chất norditerpenlactone Trong có alkaloid norisoharringtonine (DTV5.2) Đây lần hợp chất phân lập từ loài Đỉnh tùng (C mannii) Đã bổ sung số liệu phổ 13C NMR chưa có tài liệu hai alkaloid 3-Epischellhammericine (DT6) isomer đặt tên Manniicine (DT7)  Từ loài Hoàng đàn giả (D elatum) 21 Lần hợp chất phân lập xác định cấu trúc từ vỏ thân cành loài Hoàng đàn giả (D elatum) gồm hợp chất diterpenoid, hợp chất thuộc nhóm ecdysteroid phytosteroid glucosid (daucosterol) Trong có diterpene đặt tên dacrydianon (HĐ2)  Từ loài Kim giao núi đất (N wallichinana) Lần từ loài Kim giao núi đất (N wallichiana) chi Nageia phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất bao gồm hợp chất biflavonoid, hợp chất diterpenoid, hợp chất thuộc nhóm phytosterol, hợp chất phenolic Đã bổ sung số liệu phổ 13C NMR chưa có tài liệu chất 3β-hydroxytotarol (KG4), Totarol-19-carboxylic acid (KG5), Ferruginol (KG6) Hoạt tính sinh học lồi kim Năm dịch chiết thơ 11 chất chọn lọc thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính gây độc tế bào Kết cho thấy + Hoạt tính kháng oxy hóa: Các dịch chiết chất hoạt tính kháng oxy hóa + Hoạt tính gây độc tế bào: Alkaloid nor-deoxyharringtonine (DT4) thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh dòng tế bào thử nghiệm KB, HepG2, MCF7 Lu-1 với giá trị IC50 từ 0,02-0,16 μM Hợp chất Nagilacton B (KG8) thể hoạt tính ức chế mạnh với dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 từ 7,42-16,84 μM Điều thú vị hoạt tính chất KG8 dịng tế bào HL60 (IC50 7,42 M); KB (IC50 8,3μM) HepG2 (IC50 13,71M) cao nên cần tiếp tục nghiên cứu Các hợp chất khác thể hoạt tính yếu Tổng số 28 hợp chất lần phân lập từ loài nghiên cứu gồm Đỉnh tùng (C mannii), Hoàng đàn giả (D elatum) Kim giao núi đất (N wallichiana) thu hái Tây Nguyên, Việt Nam Trong có chất có cấu trúc Năm dịch chiết 10 chất nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào Trong có hợp chất thể hoạt tính kháng tế bào ung thư dòng tế bào ung thư thử nghiệm Đáng ý hợp chất Nagilacton B (KG8) cho thấy khả ức chế mạnh phát triển dòng tế bào ung thư (KB, HepG2, MCF7, Lu-1, HL60, SK-Mel2, SW626, SW480) đặc biệt dòng tế bào ung thư cổ tử cung HL60 (IC50 7,42 μM), ung thư gan KB (IC50 8,30 M) hợp chất Nordeoxyharringtonine (DT4) thể hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh chất đối chứng dòng tế bào thử nghiệm đặc biệt tế bào ung thư vú MCF7 cao gấp 107,5 lần chất đối chứng Tính đa dạng nguồn gen di truyền loài kim Kết phân tích thơng số di truyền lồi Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 PPB = 74,79%); thứ hai loài Đỉnh tùng (Na = 1,656; Ne = 1,470; I = 0,382; He = 0,262; h = 0,218 PPB = 65,65%) thấp Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 PPB = 68,54%) Hai loài Đỉnh tùng Hoàng đàn giả có tượng trao 22 đổi chéo cao (giá trị Fis< 0) Quần thể loài tái sinh từ hạt, sống môi trường địa lý, địa chất nhau, nên cho phép khẳng định bảo tồn lớp chất hóa học lồi Đây sở khoa học cho việc bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen loài kim Tây Nguyên KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học từ phận khác loài nghiên cứu rễ, gỗ thân…để có đánh giá tồn diện loài Tiếp tục nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học số hợp chất có hoạt tính từ lồi nghiên cứu, tìm mối tương quan cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học Trên sở kết nghiên cứu thành phần hóa học tính đa dạng di truyền nguồn gen chúng tơi có đề xuất với nhà nghiên cứu quan chức cần có chiến lược bảo tồn, phát triển khai thác nguồn nguyên liệu từ ba loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả Kim giao núi đất Lâm Đồng để ngày khơng xa Việt Nam phát triển số lồi thuốc có giá trị y học 23 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Lần thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Kim giao núi đất (N wallichiana) nghiên cứu Việt Nam giới  Mười hợp chất phân lập từ loài này, 5/11 hợp chất thử hoạt tính gây độc tế bào  Đã tìm hợp chất Nagilacton B (KG8) có hoạt tính mạnh dòng tế bào ung thư thử nghiệm, giá trị IC50 dao động từ 7,42- 16,84 μM  Đây kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học báo cáo từ chi Nageia Lần thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đỉnh tùng (C mannii) nghiên cứu Việt Nam  Mười hợp chất phân lập xác định cấu trúc từ loài có chất có cấu trúc norisoharringtonine (DT.5.2)  Hợp chất nordeoxyharringtonine (DT4) thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh gấp nhiều lần chất đối chứng dòng tế bào ung thư thử nghiệm (KB, HepG2, MCF7, Lu-1) Sáu hợp chất lần phân lập xác định cấu trúc từ loài Hoàng đàn giả (D elatum) 4/6 hợp chất nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào Lần Việt Nam loài kim Đỉnh tùng (C mannii), Hoàng đàn giải (D elatum) Kim giao núi đất (N wallichiana) nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen di truyền thị ISSR SSR nhằm phục vụ cơng tác bảo tồn lồi kim- lồi có giá trị Tây ngun , Việt Nam 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Van Loc, Nguyen Thi Lieu, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le Thi Thu Ha, Tran Van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phòng, Tran Van Sung, The Alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii collected in LAM DONG province, Viet Nam, Chemistry of nature compound, 2017, 53 (6), 1122-1126 Nguyen Thi Lieu, Tran Van Loc, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le Thi Thu Ha, Tran Van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phòng, Tran Van Sung, The non-Alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii, collected in LAM DONG province, Vietnam, Journal of Chemistry, 2016, 54 (2 ), 210-213 Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Sung, Thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào loài Kim giao núi đất ( Nageia wallichiana ) thu hái tỉnh Lâm Đồng, phần Các hợp chất diterpnoid, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (1), 88-92 Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Chiến, Trần Văn Sung, Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Kim giao núi đất thu hái tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, phần Các hợp chất biflavonoid, steroid phenolic, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (3), 391-395 Đinh Thị Phịng, Nguyễn Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Trần Thị Việt Thanh, Nguyễn Quốc Bình, Vũ Đình Duy, Nguyễn Tiến Hiệp, Phạm Hữu Nhân, Đánh giá đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Kim giao núi đất (Nageia wallichiana (C Presl) Kuntze) Tây Nguyên thị ISSR, tạp chí cơng nghệ Sinh học, 2015, 13 (1), 131-141 Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Liễu, Đinh Thị Phòng, So sánh hiệu thị ISSR SSR đánh giá đa dạng di truyền quần thể Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) tự nhiên Tây Nguyên, Việt Nam, tạp chí Công nghệ sinh học, 2017, 15(2), 293-305