Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TẠ THỊ THẢO TS HÀ TRẦN HƢNG HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo TS Hà Trần Hƣng tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức q giá q trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm hố phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015 Học viên Vũ Anh Phƣơng Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Tổ ng quan về paraquat 1.1.1 Công thức paraquat 1.1.2 Tính chất lý, hóa học paraquat .3 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat 1.1.4 Dƣợc động học paraquat 1.1.4.1 Hấp thu 1.1.4.2 Phân bố 1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ .7 1.1.5 Tiên lƣợng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết tƣơng 1.2 Các phƣơng pháp xác định paraquat huyết tƣơng 1.2.1 Phƣơng pháp quang phổ .9 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ 10 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 11 1.2.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 13 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu huyết tƣơng phân tích Paraquat 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .19 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 19 2.2.1 Chất chuẩn 19 2.2.2 Hoá chất .19 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ .20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng paraquat 21 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 21 2.3.1.2 Phƣơng pháp tách PQ từ huyết tƣơng 21 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên 2.3.1.3 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lƣợng PQ huyết tƣơng .21 2.3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích PQ huyết tƣơng 22 2.3.2.1 Tính chọn lọc .22 2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính 23 2.3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 23 2.3.2.4 Đánh giá độ (độ thu hồi) độ chụm (độ lặp lại) .23 2.3.2.5 Độ ổn định 23 2.3.3 Phân tích PQ mẫu huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ .24 2.3.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu cao 26 3.1.1 Xác định bƣớc sóng phát chất phân tích với detector DAD 26 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột 26 3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động 28 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động 29 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 31 3.1.5 Khảo sát ảnh hƣởng pH pha đô ̣ng 31 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 33 3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm 33 3.1.6.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ natriheptanesulfonate 33 3.1.6.2 Ảnh hƣởng nồng độ KCl .35 3.1.6.3 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ PEG .36 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 37 3.1.7 Khảo sát ảnh hƣởng tốc độ dòng .37 3.1.8 Đƣờng chuẩn, giới ̣n phát hiê ̣n và giới ̣n đinh ̣ lƣơ ̣ng 39 3.1.8.1 Xây dựng đƣờng chuẩn 39 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên 3.1.8.2 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 42 3.1.8.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn 43 3.2 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu 46 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch TCA 46 3.2.2 Khảo sát thời gian lắc xoáy 48 3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích 50 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp 51 3.3.1 Đánh giá đô ̣ cho ̣n lo ̣c 51 3.3.2 Đánh giá độ phƣơng pháp 51 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi phƣơng pháp .51 3.3.2.2 Đánh giá độ phƣơng pháp phân tích 52 3.3.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại .53 3.3.2.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị 53 3.3.2.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp) phƣơng pháp phân tích 55 3.3.3 Độ ổn định 57 Độ ổn định thời gian phân tích 58 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 58 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 58 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tƣơng tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 60 KẾT LUẬN .67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thể tić h bơm mẫu 27 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng tỉ lê ̣ pha đô ̣ng t ới độ phân cực, thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic .31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của pH tới thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic 32 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ natriheptanesulfonate đ ến thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic .34 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ KCl đến thời gian lƣu hệ số đối xứng pic .35 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ PEG đến thời gian lƣu hệ số đối xứng pic 37 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng tố c đô ̣ dòng đến thời gian lƣu hệ số đối xứng pic 38 Bảng 3.8: Nồng độ diện tích pic trung bình PQ 40 Bảng 3.9: Giới ̣n phát hiê ̣n và giới ̣n đinh ̣ lƣơng của PQ 43 Bảng 3.10: Kết so sánh giá trị a với giá trị phƣơng trình đƣờng chuẩn PQ .44 Bảng 3.11: Kết so sánh b b′ phƣơng trình đƣờng chuẩn PQ 45 Bảng 3.12: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ TCA đến hiệu chiết PQ khỏi huyết tƣơng 48 Bảng 3.13: Ảnh hƣởng thời gian lắc xoay đến trình chiết 48 Bảng 3.14: Kế t xác định độ ổn định khác ngày 50 Bảng 3.15: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích PQ 52 Bảng 3.16: Kết phân tích lặp lại mẫu huyế t tƣơng thêm chuẩn 52 Bảng 3.17: Các đại lƣợng thống kê 53 Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất .54 Bảng 3.19: Kết hàm lƣợng PQ tìm lại đƣợc phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác 55 Bảng 3.20: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba KTV khác .56 Bảng 3.21: Các kiện đánh giá độ tái lặp phƣơng pháp phân tích 57 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Bảng 3.22: Kế t quả xác đinh ̣ đô ̣ ổ n đinh ̣ ngày 58 Bảng 3.23: Thời gian tƣ̀ lúc uố ng đế n lấy mẫu xét nghiệm 60 Bảng 3.24: Kết định lƣợng PQ 31 bệnh nhân .61 Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tƣơng sau lọc máu hấp phụ 65 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH HÌNH Chƣơng Hình 1.1: Cơng thức hóa học paraquat Hình 1.2 Cơ chế gây độc paraquat [15] .4 Hình 1.3: Biểu đồ liên quan nồng độ Paraquat huyết tƣơng (µg/ml), thời gian sau uống, khả sống .8 Chƣơng Hình 3.1: Phở hấ p thu ̣ UV của PQ 26 Hình 3.2: Sắ c đờ khảo sát thể tích bơm mẫu .27 Hình 3.3: Sắ c đờ phân tích PQ với ̣ dung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M nƣớc dung dịch NaOH 0,0125M methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v) 28 Hình 3.4: Sắ c đờ phân tích PQ với ̣ dung môi B 29 Hình 3.5: Sắ c đờ phân tích PQ với ̣ dung mơi C 29 Hình 3.6: Sắ c ký đồ khảo sát tỉ lê ̣ pha đô ̣ng ACN : Đê ̣m %v/v 30 Hình 3.7: Sắ c đồ khảo sát ảnh hƣởng của pH 32 Hình 3.8: Sắ c đồ khảo sát nồ ng đô ̣ của natriheptanesulfonate đê ̣m pH 2,5 34 Hình 3.9: Sắ c đồ PQ thay đổi nồ ng đô ̣ của KCl pha động 35 Hình 3.10: Sắ c đồ PQ thay đổi nồ ng đô ̣ của PEG pha động .37 Hình 3.11: Sắ c đờ khảo sát tớ c ̣ dòng 38 Hình 3.12: Sắ c ký đờ các nờ ng ̣ PQ khác tƣ̀ 0,02 – 10,00 µg/ml 40 Hình 3.13: Đƣờng chuẩn PQ theo diện tích pic 41 Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ mẫu huyết tƣơng 49 Hình 3.15: Sắ c ký đồ PQ huyế t tƣơng chuẩ n áp du ̣ng quy trin ̀ h xƣ̉ lý mẫu hình 3.14 50 Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ phƣơng pháp 51 Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi 58 Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 59 Hình 3.19: Kết bệnh nhân ngộ độc Paraquat .60 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.20: Kết định lƣợng nồng độ PQ vào viện bệnh nhân sống tử vong 63 Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP bệnh nhân sống tử vong 64 Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lƣợng tử vong .65 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn tƣơng đối % Reproducibility standard % Độ lệch chuẩn tái lặp deviation tƣơng đối Acetonitrile Acetonitril Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic ATP Adenosin Triphophate Adenosin Triphophat BN Patient Bệnh nhân diode-array detector detector mảng diode DQ Diquat Diquat EPQ Ethylparaquat Ethylparaquat % RSD % RSDR ACN AS DAD GC - MS HP HPLC LC - MS Gas chromatography - Mass spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy Sắc ký khí khối phổ Lọc máu hấp phụ Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lƣợng Methanol Methanol ppm Parts per million Phần triệu PQ Paraquat Paraquat Relative coefficient Hệ số tƣơng quan Receiver operating characteristics Đƣờng cong ROC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo MeOH R ROC RP-HPLC Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Độ ổn định thời gian phân tích Chuẩn bị mẫu PQ huyết tƣơng trắng nồng độ µg/ml, xử lý mẫu tiến hành sắc ký tiếp tục lần vịng Nờ ng đô ̣ đo đƣơ ̣c sau mỗi giờ đƣơ ̣c cho bảng sau Bảng 3.22: Kế t quả xác đinh ̣ đô ̣ ổ n đinh ̣ ngày Giờ Mẫu RSD (%) 1(µg/ml) 2,00 1,99 1,99 1,98 1,98 1,98 0,402 (µg/ml) 2,02 2,00 2,00 1,99 1,98 1,97 0,851 (µg/ml) 2,01 2,00 2,03 1,99 1,98 1,98 0,601 Nhận xét thấy, giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ phƣơng pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích thời điểm khác sau xƣ̉ lý mẫu vòng tiế ng 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn đƣợc chọn vào nghiên cứu Trong 16 bệnh nhân (BN) nam (51,6%) 15 BN nữ (48,4%) 70% 60% 50% 40% 65% 30% 20% 10% 19% 16% 0% < 18 tuổi 18-50 tuổi > 50 tuổi Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi Vũ Anh Phương 58 Trường ĐHKH Tự nhiên Trong nhóm BN nghiên c ứu, tuổ i thấ p nhấ t là 14 tuổ i, tuổ i cao nhấ t là 63 tuổ i, trung bình: 32,1  15,2 Ngơ ̣ ̣c PQ hay gă ̣p ở đô ̣ tuổ i lao động 18-50 t̉ i (64,5%) Đặc điểm phân bố nhóm tuổi BN nghiên cứu tƣơng tự nghiên cứu trƣớc tác giả Đặng Thị Xuân, Nguyễn Thị Dụ [4] Vũ Mai Liên [2] Trung tâm chống độc Đáng ý 16,1% BN ngộ độc PQ tuổi thiếu niên Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp đƣợc hình 3.18 40% 35% 30% 25% 20% 36% 15% 26% 26% 10% 5% 07% 07% cơng nhân hành 0% làm ruộng học sinh sinh viên khơng việc làm Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp Trong số bệnh nhân nghiên cứu, nghề làm ruô ̣ng chiế m tỉ lê ̣ cao nhấ t 11 bệnh nhân (35,5%) phù hợp với việc PQ đƣợc dùng nông nghiệp nên sẵn có nơng thơn Học sinh, sinh viên chiế m tỉ lê ̣ cao thƣ́ hai (25,8%) đáng quan tâm Khi xem xét nguyên nhân ngộ độc, hầu hết BN nghiên cứu ngộ độc tự tử (29 bệnh nhân - 93,6%) Chỉ có BN tai nạn (6,4%), BN bấ t cẩ n phun thuố c , BN uố ng nhầ m Vũ Anh Phương 59 Trường ĐHKH Tự nhiên Trong các s ản phẩm thƣơng ma ̣i c PQ BN gia đình mang đến viện, Gfaxone 20SL hay gă ̣p nhấ t , ngồi có số tên sản phẩm khác: Gramoxone, Fansipan, Tungmaxone, Cỏ cháy 26% Sống Tử vong 74% Hình 3.19: Kết bệnh nhân ngộ độc Paraquat 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ Thời gian tƣ̀ lúc BN uố ng PQ cho đế n lấy mẫu xét nghiệm đƣợc trình bày bảng 3.23 Trung biǹ h thời gian tƣ̀ lúc uố ng đế n lúc l mẫu xét nghiệm là 6,6 ± 4,23 Thời gian ngắ n nhấ t là giờ, nhiề u nhấ t là 23 Thời gian lấy mẫu sau uống chủ yếu (74,2%) Bảng 3.23: Thời gian tƣ̀ lúc uố ng đế n lấy mẫu xét nghiệm Thời gian Số bênh ̣ nhân Tỉ lệ % ≤ 3,2 >2 - 22,6 >4 - 12 38,7 Sau 11 35,5 Vũ Anh Phương 60 Trường ĐHKH Tự nhiên Nồng độ Paraquat huyết tƣơng vào viện: Áp dụng quy trình phân tích xây dựng đƣợc, chúng tơi xác định nồng độ PQ huyết tƣơng Mỗi mẫu phân tích lặp lại lần Kết thu đƣợc bảng 3.24 Giá trị nồng độ PQ huyết tƣơng trung bình 8,1 µg/ml (thấp nhất: 0,215 µg/ml; cao 88,66 µg/ml) Bảng 3.24: Kết định lƣợng PQ 31 bệnh nhân Thời Kết định lƣợng PQ (µg/ml) gian STT Bệnh nhân Tuổi Giới uống đến Vào Sau Trƣớc Sau Trƣớc Sau viện HP1 HP2 HP2 HP3 HP3 0,05 0,12