Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học

PGS TS Nguyễn Hồng Lộc Giáo trình Nhập mơn Cơng nghệ sinh học Nhà xuất Đại học Huế Năm 2007 Lời nói đầu Cơng nghệ sinh học ngành khoa học ứng dụng hiểu biết người hệ thống sống để sử dụng hệ thống thành phần chúng cho mục đích cơng nghiệp Đây ngành mũi nhọn, giới quan tâm có tốc độ phát triển nhanh chóng tạo cách mạng sinh học nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y-dược, bảo vệ môi trường, vật liệu… Từ sản phẩm công nghệ lên men truyền thống đến sản phẩm công nghệ sinh học đại như: sinh vật biến đổi gen, động vật nhân bản, nuôi cấy tế bào gốc, công nghệ sinh học nanô cho thấy phạm vi nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học ngày mở rộng đa dạng, hướng đến phát triển công nghiệp công nghệ sinh học Điều cho thấy cơng nghệ sinh học phối hợp khoa học công nghệ để khai thác kiến thức hệ thống sống cho ứng dụng thực hành công ngh nước giới Giáo trình Nhập mơn cơng nghệ sinh học cung cấp kiến thức cho sinh viên công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ lên men vi sinh vật, công nghệ sinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật, công nghệ protein số ứng dụng chúng lĩnh vực nông nghiệp, y học môi trường Giáo trình xuất lần nên khó tránh khỏi thiếu sót chưa đáp ứng u cầu bạn đọc Vì thế, chúng tơi mong nhận nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất sau hồn thiện Chúng tơi chân thành cảm ơn Quỹ Nâng cao chất lượng-Dự án Giáo dục đại học hỗ trợ chúng tơi biên soạn giáo trình này, PGS TS Lê Trần Bình đọc thảo góp nhiều ý kiến quý báu Tác giả MỤC LỤC Trang LỜI NÓI ĐẦU Phần I CÁC KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN LÝ CƠ BẢN Chƣơng MỞ ĐẦU I Định nghĩa công nghệ sinh học Định nghĩa tổng quát 1.1 Công nghệ sinh học truyền thống 1.2 Công nghệ sinh học đại 6 7 Nội dung khoa học công nghệ sinh học Các lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học 3.1 Công nghệ sinh học nông nghiệp 3.2 Công nghệ sinh học y dược 3.3 Công nghệ sinh học công nghiệp chế biến thực phẩm 3.4 Công nghệ sinh học môi trường II Sơ lược lịch sử hình thành cơng nghệ sinh học Giai đoạn thứ 9 10 10 11 12 13 Giai đoạn thứ hai Giai đoạn thứ ba Giai đoạn thứ tư III Một số khía cạnh khoa học kinh tế công nghệ sinh học đại 13 13 14 15 Về khoa học Về kinh tế 2.1 Những công ty đa quốc gia công nghệ sinh học 2.2 Sự lệ thuộc vào công ty đa quốc gia công nghệ sinh học IV Các vấn đề pháp lý công nghệ sinh học đại 15 16 16 16 An toàn sinh học 1.1 Sự chuyển gen hạt phấn 1.2 Sự bền vững DNA đất 17 18 18 19 356 1.3 Chuyển gen ngang từ thực vật vào vi sinh vật đất 1.4 Chuyển gen từ thực vật vào virus 20 21 An toàn thực phẩm 2.1 Các chất gây dị ứng 2.2 Đánh giá độ an toàn thực phẩm Đạo đức sinh học Quyền tác giả sở hữu trí tuệ 4.1 Quyền tác giả 4.2 Sở hữu trí tuệ Tài liệu tham khảo/đọc thêm 22 23 24 25 27 27 28 30 Chƣơng CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP I Mở đầu II Phân lập đoạn DNA/gen Tách đoạn DNA từ genome Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA Phân lập đoạn DNA phương pháp PCR III Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector 31 31 31 32 33 33 36 Enzyme hạn chế Các vector dùng để tạo dòng đoạn DNA 2.1 Plasmid vector 2.2 Bacteriophage vector Gắn đoạn DNA vào vector 3.1 Gắn đoạn cDNA 3.2 Gắn sản phẩm PCR Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ 4.1 Điện biến nạp 4.2 Hóa biến nạp IV Chọn dòng mang DNA tái tái tổ hợp Lai khuẩn lạc vết tan Khử hoạt tính chèn đoạn Tạo dòng định hướng 36 38 39 42 43 43 46 47 47 48 48 49 50 50 357 V Biểu gen tạo dòng Vector biểu 52 53 Xác định mức độ biểu gen tạo dòng Tài liệu tham khảo/đọc thêm 55 58 Chƣơng CÔNG NGHỆ LÊN MEN VI SINH VẬT I Mở đầu II Sinh trưởng vi sinh vật III Sinh khối vi sinh vật công nghệ lên men Sinh khối vi sinh vật 59 59 59 64 64 Quá trình lên men IV Các sản phẩm lên men vi sinh vật Lên men rượu 1.1 Rượu trắng 1.2 Rượu vang Sản xuất enzyme 2.1 Các loại enzyme vi sinh vật 2.2 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 65 68 68 68 70 71 72 75 2.3 Những phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất enzyme 76 2.4 Tách tinh chế phẩm enzyme Sản xuất kháng sinh 3.1 Penicillin 3.2 Streptomycin 3.3 Tetracycline Sản xuất acid hữu 4.1 Acetic acid 82 83 83 85 86 87 87 4.2 Citric acid V Công nghệ tái tổ hợp vi sinh vật Các vi sinh vật tái tổ hợp Các ứng dụng công nghệ vi sinh Tài liệu tham khảo/đọc thêm 89 89 90 90 91 358 Chƣơng CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT I Mở đầu II Nuôi cấy mô nhân giống in vitro Thuật ngữ học 1.1 Nuôi cấy đỉnh phân sinh 1.2 Sinh sản chồi nách 1.3 Tạo chồi bất định 1.4 Phát sinh quan 1.5 Phát sinh phơi vơ tính 93 93 94 94 95 95 95 96 96 Nhân giống in vitro hệ thống nuôi cấy mô 2.1 Tái sinh từ cấu trúc sinh dưỡng 2.2 Nhân giống thông qua giai đoạn callus 2.3 Nhân giống thông qua phát sinh phơi vơ tính-cơng nghệ hạt nhân tạo 96 97 101 102 Các giai đoạn quy trình nhân giống vơ tính in vitro 3.1 Giai đoạn I-cấy gây 3.2 Giai đoạn II-nhân nhanh 3.3 Giai đoạn III-chuẩn bị đưa đất 107 107 108 110 Nhân giống in vitro việc sử dụng giống ưu lai Nhân giống in vitro đặc điểm không di truyền 5.1 Hiện tượng đặc điểm epigenetic lưu lại 5.2 Hiện tượng đặc điểm epigenetic không lưu lại III Các kỹ thuật chuyển gen thực vật Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium 1.1 Vi khuẩn Agrobacterium 1.2 Ti-plasmid 1.3 Vùng T-DNA 1.4 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào mô thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Các gen thị chọn lọc gen thị sàng lọc Chuyển gen vi đạn 110 111 111 112 112 114 114 115 116 117 119 122 359 Các ứng dụng công nghệ chuyển gen 4.1 Một số kết bước đầu 123 123 4.2 Triển vọng hướng phát triển Công nghệ di truyền kháng chất diệt cỏ Công nghệ di truyền kháng sâu-bệnh 6.1 Kháng côn trùng 6.2 Kháng virus thực vật 6.3 Kháng bệnh nấm 6.4 Kháng bệnh vi khuẩn IV Sản xuất dược liệu sinh học 124 125 126 126 127 129 130 130 Các hợp chất tự nhiên 1.1 Các alkaloid 1.2 Các steroid 1.3 Một số chất khác Các protein tái tổ hợp Vaccine thực phẩm Tài liệu tham khảo/đọc thêm 130 132 132 133 134 136 138 Chƣơng CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT I Mở đầu II Nuôi cấy tế bào động vật có vú Các ưu điểm hạn chế nuôi cấy tế bào động vật 1.1 Các ưu điểm nuôi cấy tế bào động vật 1.2 Một số hạn chế nuôi cấy tế bào động vật Các dòng tế bào động vật có vú đặc điểm 2.1 Các tế bào dịch huyền phù 2.2 Các tế bào dính bám 140 140 141 141 141 143 143 143 144 Các sản phẩm thương mại nuôi cấy tế bào động vật có vú 144 Glycosyl hóa protein Môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú Ni cấy tế bào động vật có vú quy mô lớn 145 147 149 360 6.1 Các điều kiện chung 6.2 Nuôi cấy mẻ 6.3 Nuôi cấy mẻ có cung cấp chất dinh dưỡng 6.4 Ni cấy thể ổn định hóa tính 6.5 Ni cấy perfusion 6.6 Số lượng chất lượng sản phẩm III Công nghệ di truyền tế bào động vật có vú Các phương pháp chuyển nạp gen 1.1 Phương pháp chuyển nhiễm 1.2 Phương pháp lipofection 1.3 Phương pháp xung điện 1.4 Phương pháp vi tiêm 1.5 Phương pháp dùng súng bắn gen 1.6 Phương pháp dùng vector virus Các điều kiện cần thiết cho biểu gen ngoại lai Các điều kiện thực nghiệm tối ưu Đồng chuyển nạp gen thị gen thực nghiệm Kỹ thuật tế bào mầm phôi, chuyển gen tái tổ hợp tương đồng 149 150 152 152 154 156 158 159 159 159 160 161 163 163 165 167 167 169 IV Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất quan người Ứng dụng tế bào mầm phôi nghiên cứu Nghiên cứu chức gen Nghiên cứu mô hình bệnh lý Ứng dụng y học tái tạo V Cơng nghệ phơi động vật có vú Cấy truyền hợp tử Bảo quản phôi 171 172 173 173 173 175 175 175 Nuôi cấy tạm thời phôi thể sống Kỹ thuật bọc phôi agar Kỹ thuật nuôi cấy tạm thời phơi ống dẫn trứng VI Nhân vơ tính động vật có vú Khái niệm 176 176 176 177 177 361 Nhân vơ tính động vật Nhân vơ tính cừu Dolly 177 178 Tài liệu tham khảo/đọc thêm 181 Chƣơng CÔNG NGHỆ PROTEIN I Mở đầu II Cấu trúc protein III Các cơng cụ Nhận dạng trình tự Xác định cấu trúc mơ hình hóa 182 182 183 184 184 185 Biến đổi trình tự Phát triển phân tử Thiết kế trình tự de novo Biểu Phân tích IV Một số ứng dụng công nghệ protein Các đột biến điểm 1.1 Betaseron/Betaferon 185 188 190 190 191 192 192 192 1.2 Humalog 1.3 Các tá dược vaccine Sắp xếp lại vùng 2.1 Các vùng liên kết 2.2 Trao đổi vùng protein Sắp xếp lại toàn protein Các tương tác protein-phối tử 4.1 Biến đổi enzyme 4.2 Các chất chủ vận hormone 4.3 Thay liên kết đặc hiệu V Sản xuất protein quy mô lớn Lên men E coli tái tổ hợp Lên men nấm Các enzyme vi sinh vật thay enzyme thực vật 192 193 194 194 195 196 197 197 197 197 198 199 200 200 362 Các nguyên tắc hóa sinh 4.1 Sự cảm ứng 4.2 Ức chế ngược 4.3 Ức chế dinh dưỡng Công nghệ di truyền VI Các trình tách chiết tinh protein Thu hồi protein 1.1 Thu hồi protein ngoại bào 1.2 Thu hồi protein nội bào Tinh sơ 201 201 202 204 205 207 209 209 209 216 2.1 Loại bỏ mảnh vỡ tế bào 2.2 Ly tâm mẻ 2.3 Ly tâm dòng chảy liên tục 2.4 Lọc màng Hệ phân tách hai pha nước Các phương pháp kết tủa 4.1 Kết tủa ammonium 4.2 Kết tủa dung môi hữu 216 216 217 217 218 220 220 220 4.3 Kết tủa polymer khối lượng phân tử cao 4.4 Kết tủa nhiệt Các phương pháp sắc ký 5.1 Sắc ký lọc gel 5.2 Sắc ký trao đổi ion 5.3 Sắc ký lực 5.4 Sắc ký tương tác kỵ nước 5.5 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao Siêu lọc 221 221 221 222 224 227 230 230 231 Thiết kế protein để tinh 7.1 Các thể vùi 7.2 Các đuôi lực Tài liệu tham khảo/đọc thêm 232 232 233 236 363 Môi trường LB (LB medium) Môi trường nuôi cấy E coli, thành phần bao gồm (cho 100 mL): g bacto-trypton; 0,5 g dịch chiết nấm men g NaCl Nếu pha chế môi trường rắn để ni cấy đĩa petri bổ sung thêm 1,5 g bacto-agar Mồi (primer) Một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với mạch DNA khn mẫu có mang đầu 3’-OH tự giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp chuỗi DNA Mucopeptide Dị polymer đại phân tử chứa hai loại đường amine số amino acid Người ta nhận thấy mucopeptide gắn liền với thành tế bào prokaryote Myeloma Nấm men hướng methyl Là nấm men sử dụng chất dẫn xuất methane nguồn carbon lượng chuyển hóa Nấm men Saccharomyces cerevisiae Là vi sinh vật nhân thật sử dụng nhiều công nghệ DNA tái tổ hợp Genome nấm men S cerevisiae khoảng 1,35×107 base-pair nhiều E coli khoảng 3,5 lần Nấm men thường dùng làm tế bào vật chủ để biểu protein có cấu trúc phức tạp cần q trình hậu dịch mã mà vi khuẩn E coli đáp ứng Northern blot Kỹ thuật chuyển cố định RNA từ formaldehyde agarose gel (sau phân đoạn điện di) lên màng lai nylon nitrocellulose để lai với mẫu dị (probe) đánh dấu đồng vị phóng xạ [ -32P]dCTP digoxigenin-dUTP Tín hiệu lai sau phát phim X-quang (trường hợp [ -32P]dCTP) màng lai (trường hợp digoxigenin-dUTP) Nucleic acids Những polynucleotide sinh học thiên nhiên, đơn vị nucleotide kết hợp với liên kết phosphodieste thành trình tự DNA RNA riêng biệt Nucleotide Một nucleoside phosphoryl hóa với hydroxyl pentose Phân tử đóng vai trị cấu trúc sở DNA RNA, gồm ba phần: đường pentose (ribose RNA, deoxyribose DNA), nitrogen base gốc phosphate Nhập môn Công nghệ sinh học 342 Nuôi cấy mô tế bào (tissue and cell culture) Kỹ thuật cấy nuôi vô trùng mô tế bào động vật thực vật môi trường nhân tạo bên ống nghiệm bình thủy tinh Về nguyên lý, giống nuôi cấy tế bào vi sinh vật Kỹ thuật có nhiều ứng dụng thực tiễn, ví dụ thực vật dùng để nhân giống nhanh sinh trưởng chậm bị phân ly sinh sản hữu tính, ngồi sử dụng chọn giống; động vật kỹ thuật dùng để nuôi mô phục vụ cho công tác nghiên cứu sản xuất chất có hoạt tính sinh học Oliofilm Cao su xử lý HCl Oligo Tiếp đầu ngữ có nghĩa “ít”, ví dụ: oligonucleotide (polynucleotide) có nucleotide oligopeptide (polypeptide) có peptide Oligo(dT)-cellulose Một đoạn ngắn gồm gốc deoxy-thymidine liên kết với chất cellulose, sử dụng để tinh mRNA eukaryote phương pháp sắc ký lực Oligomer Thuật ngữ chung để đoạn ngắn monomer Oligonucleotide Một đoạn ngắn monomer nucleotide, thường từ 20-30 nucleotide Operon Nhóm gen vi khuẩn chịu điều khiển chung gen điều hòa Cấu trúc operon bao gồm: 1) Nhóm gen cấu trúc mà hoạt động chúng chịu điều khiển chung, 2) Gen điều hòa sản sinh protein điều hòa, 3) Vùng huy (operator) trình tự khởi động (promoter) chịu tác động protein điều hịa Protein điều hịa có tác dụng bám vào vùng huy làm cho bị ”đóng”, nhóm gen cấu trúc ngừng hoạt động Khi môi trường xuất chất gen cấu trúc chất bất hoạt hóa protein điều hịa khiến khơng bám vào vùng huy nữa, vùng huy ”mở” nhóm gen cấu trúc lại hoạt động Phage Viết tắt bacteriophage (thực khuẩn thể), loại virus xâm nhiễm sinh sản bên vi khuẩn Phage thường có vỏ bọc protein, phức hợp bao gồm phần đầu có hình đa diện chứa nucleic acid (DNA RNA) đuôi mà qua nucleic acid xâm nhập vào vi khuẩn chủ Sau trình nhân lên nucleic acid phage, tế bào vi khuẩn chủ thường bị tan biến Loại phage luôn làm tan tế bào vi khuẩn chúng xâm nhiễm vi Nhập môn Công nghệ sinh học 343 khuẩn gọi phage độc, ví dụ phage T4 Ngược lại, cịn có phage ơn hịa, xâm nhiễm vi khuẩn gây nên phản ứng tiềm tan, nghĩa hệ gen phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn chép với nhiễm sắc thể Hệ gen phage trạng thái gắn với nhiễm sắc thể vi khuẩn gọi prophage Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction, PCR) Phương pháp dùng phịng thí nghiệm để khuếch đại đoạn DNA đặc biệt lên hàng triệu lần vòng vài thông qua 20-30 chu kỳ nhiệt, chu kỳ bao gồm ba mức nhiệt độ: biến tính 90-95oC, bắt cặp với mồi 40-65oC tổng hợp mạch nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) 70-72oC PCR có ứng dụng rộng rãi chẩn đốn y học, phân tích đa dạng sinh học, chọn giống nhiều lĩnh vực khác Nhà khoa học Mỹ (Tiến sĩ Mullis) người phát minh kỹ thuật PCR nhận giải Nobel năm 1993 Cùng chia sẻ Giải Nobel với Mullis Smith (Canada) có đóng góp mang tính tảng cho việc gây đột biến điểm định hướng, dựa oligonucleotide việc phát triển chúng nghiên cứu protein Phân hóa hay biệt hóa (differentiation) Một khía cạnh phát triển bao gồm hình thành loại tế bào, loại mô, loại quan khác từ hợp tử ban đầu điều khiển đặc biệt gen (bioremediation) Phân tích trình tự gen (gene sequencing) Là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc chuỗi nucleotide phân tử nucleic acid Phân tích trình tự DNA có phương pháp hóa học MaxamGilbert phương pháp enzyme Sanger Trong năm gần đây, số phương pháp xác định trình tự nhờ hỗ trợ máy tính xuất Bên cạnh kỹ thuật thông thường sử dụng polyacrylamide gel để phân ly phân tử DNA có độ dài khác nhau, kỹ thuật liên quan đến phát huỳnh quang nucleotide đánh dấu, phân tích Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 344 trình tự DNA khối phổ, điện di mao dẫn lai với đoạn oligonucleotide tổng hợp nhân tạo đời Năm 1980, Sanger (Anh) Gilbert (Mỹ) trao giải Nobel có đóng góp quan trọng phương pháp xác định trình tự nucleotide phân tử DNA Đóng góp mốc lịch sử to lớn sinh học phân tử, nguyên lý tất máy xác định trình tự DNA tự động sử dụng khắp giới Phiên mã ngược (reverse transcription) Q trình tổng hợp DNA từ khn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Phóng xạ tự ghi (autoradiography) Kỹ thuật phát phân tử có đánh dấu phóng xạ thơng qua hiệu ứng tạo ảnh phân tử phim X-quang Phosphoryl hóa (phosphorylation) Phản ứng tạo thành dẫn xuất phosphate phân tử sinh học tác dụng xúc tác enzyme Phosphatase kiềm (alkaline phosphatase) Enzyme loại bỏ nhóm 5’-PO4 từ đầu phân tử DNA để lại nhóm 5’-OH Phối tử (ligand) Một phân tử ion kết hợp với protein, ví dụ hormone kết hợp với thụ thể (receptor) đặc hiệu Plasmid có cấu trúc mạch vịng kép, nằm tế bào chất ngồi nhân, có khả chép độc lập nhiễm sắc thể tế bào Tồn sinh vật prokaryote eukaryote Ngày nay, plasmid thiết kế nhân tạo sử dụng rộng rãi vector dùng kỹ thuật tạo dòng biểu gen Polyacrylamide Là polymer acrylamide bisacrylamide có cấu trúc gồm liên kết chéo tạo mảng xốp (giống bọt biển) Các chất phải chui vào lỗ gel được, chất có khối lượng phân tử nhỏ trước ngược lại Polymer Một đoạn dài monomer Polynucleotide Trình tự nucleotide nối đồng hóa trị với nhau, vị trí 3’ pentose nucleotide nối với liên kết phosphodieste vị trí 5’ pentose nucleotide Polypeptide Một chuỗi dài amino acid nối với liên kết peptide Nhập môn Công nghệ sinh học 345 Prokaryote Sinh vật đơn bào khơng có nhân tế bào điển hình, DNA nằm tế bào chất khơng có màng bao bọc, khơng có ngun phân giảm phân; đại diện điển hình vi khuẩn Prophage Phage ơn hòa xen vào nhiễm sắc thể vi khuẩn tiềm tan Nó chép đồng thời với nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn chủ Protein Một phân tử lớn gồm nhiều chuỗi polypeptide, chuỗi có trình tự amino acid khối lượng phân tử đặc trưng Protein hợp chất quan trọng bậc thể sống Về cấu trúc, protein phân tử mạch dài gồm đơn vị cấu trúc nhỏ amino acid nối với qua mối liên kết peptide Khối lượng phân tử protein từ vài nghìn đến vài triệu Có khoảng 20 loại amino acid Các loại protein phức tạp có liên kết thêm với nhóm bổ sung Protein dung hợp (fusion protein) Là protein tái tổ hợp lai mã hóa gen lai (fusion gene) dung hợp in vitro đoạn gen khác plasmid vector sau biến nạp vào vi sinh vật chủ (chẳng hạn E coli) Vì vậy, protein dung hợp mang trình tự amino acid hai protein khác biệt tổng hợp từ đầu N vector biểu Protein nguyên thể (native protein) Là protein tái tổ hợp mã hóa gen ngoại lai (foreign gene) vi sinh vật chủ Khác với protein dung hợp, protein nguyên thể tổng hợp từ đầu N khơng phải từ đầu N vector Purine Một hợp chất dị vòng, kiềm, có nitrogen, thành phần nucleotide nucleic acid Purine chứa nhân pyrimidine kết hợp với nhân imidazol Pyrimidine Một nitrogen base dị vịng có nucleotide nucleic acid Quá trình chuẩn bị chất nguyên liệu sản xuất (upstream processing) Giai đoạn thiết kế môi trường dinh dưỡng (cơ chất) sử dụng chủng tế bào (nguyên liệu sản xuất) thích hợp cho trình sinh học (bioprocessing) Quá trình phân tách tinh đầu (downstream processing) Gia Nhập môn Công nghệ sinh học 346 Retrovirus Là loại virus RNA chứa enzyme reverse transcriptase sinh sản dạng DNA mạch kép Chúng có khả xâm nhiễm tế bào vật chủ cao Khi xâm nhiễm có khả gắn hệ gen virus với hệ gen tế bào vật chủ, sở để thiết kế vector liệu pháp gen hiệu Ribonuclease Enzyme xúc tác đặc hiệu việc phân hủy RNA cách cắt mối liên kết phosphodiester RNA Ribonucleic acid (RNA) Thường phân tử đa phân mạch đơn gồm đơn vị cấu trúc sở ribonucleotide Về mặt hóa học RNA giống với DNA RNA v Ribonucleotide Đơn vị cấu trúc sở RNA, gồm ba thành phần: đường ribose, nitrogen base nhóm phosphate Ribosome Người ta thấy ribosome ty thể, có tổng hợp số protein ty thể Ribozyme enzyme RNA bổ sung (complementary RNA) RNA kích thước nhỏ nhân (small nuclear RNA, snRNA) RNA polymerase RNA ribosome (ribosomal RNA, rRNA) L 5S; Nhập môn Công nghệ sinh học E coli 347 RNA thông tin (messenger RNA, mRNA) Một loại RNA phiên mã từ trình tự DNA mRNA truyền thông tin di truyền từ nhiễm sắc thể tới ribosome để ribosome (transfer RNA, tRNA) Sàng lọc (screening) Kỹ thuật nhận dạng dòng DNA thư viện hệ gen (genomic library) thư viện cDNA (cDNA library) phương pháp lai mẫu dò có đánh dấu [ -32P]dCTP với vết tan (trường hợp dùng bacteriophage λ làm vector tạo dòng cho xâm nhiễm vào vi khuẩn E coli) khuẩn lạc (dùng plasmid làm vector tạo dòng) thư viện màng nylon nitrocellulose Tín hiệu lai phát phóng xạ tự ghi phim X-quang Sao chép (replication) Sự nhân vật chất di truyền chu trình phân bào tổng hợp DNA phage phage sinh sản tế bào vi khuẩn Sephadex Là loại dextran có liên kết chéo mạch polysaccharide với tạo thành cấu trúc mạng lưới ba chiều Sephadex trung hịa điện tích nên khơng có tương tác cation anion, loại bột khô, không tan nước, ngâm nước trương tạo thành gel Mắt lưới sephadex gel thường to nhỏ Nhập môn Công nghệ sinh học 348 khác nhau, tùy theo mức độ liên kết Nếu chuỗi polysaccharide có liên kết gel có mắt lưới lớn, ngậm nước nhiều ngược lại Sephadex bền môi trường acid yếu kiềm yếu, môi trường acid mạnh kiềm mạnh liên kết glucoside gel bị thủy phân Dựa vào độ liên kết người ta chia sephadex làm năm loại: sephadex G-25, G-50, G-75, G-100 G-200 Sinh học phân tử (molecular biology) Khoa học nghiên cứu tượng sống mức độ phân tử Lĩnh vực khoa học trẻ tuổi điểm gặp khoa học kinh điển di truyền học, hóa sinh học, tế bào học, vật lý học, hóa học hữu hóa lý Theo cách hiểu phổ biến nay, sinh học phân tử khoa học nghiên cứu gen hoạt động chúng mức độ phân tử, bao gồm phiên mã, dịch mã, chép, điều hòa biểu gen, tái tổ hợp chuyển gen Sinh tổng hợp protein (protein synthesis) Phản ứng hóa học diễn ribosome tạo nên phân tử protein từ amino acid sở thông tin di truyền nhận từ nhân tế bào thông qua mRNA Somatotropin Southern blot Kỹ thuật chuyển cố định DNA biến tính từ agarose gel (sau phân đoạn điện di) lên màng lai nylon hay nitrocellulose để lai với mẫu dò (probe) đánh dấu đồng vị phóng xạ [ -32P]dCTP digoxigenin-dUTP Tín hiệu lai sau phát phim X-quang (trường hợp [ -32P]dCTP) màng lai (trường hợp digoxigenin-dUTP) Tái tổ hợp (recombination) Q trình mà nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt phần đứt nối lại theo tổ hợp Q trình xảy tế bào sống (qua trao đổi chéo phân bào giảm nhiễm) hay ống nghiệm nhờ enzyme cắt nối DNA Tạo dòng (cloning) Còn gọi nhân dòng, tách dịng hay dịng hóa, sản sinh nhiều phân tử DNA, thường phân tử DNA tái tổ hợp plasmid vector, cách chép phân tử vật chủ thích hợp chẳng hạn vi khuẩn E coli Nhập môn Công nghệ sinh học 349 Terminal transferase Enzyme bổ sung gốc nucleotide vào đầu 3’ oligonucleotide polynucleotide Tế bào khả biến (competent cell) Các tế bào vi khuẩn có khả tiếp nhận DNA ngoại lai trình biến nạp Tế bào lympho B (B lymphocyte) Phát triển tủy xương (bone marrow) ký hi Tế bào lympho T (T lymphocyte) Phát triển thục tuyến ức (thymus) nên ký hiệu T Tế bào Hfr (high frequency recombination cell) Tế bào giới tính đực E coli, có mang nhân tố F gắn liền với nhiễm sắc thể vi khuẩn Khi nhân tố F thúc đẩy tiếp hợp tế bào Hfr với tế bào (F-) gen vi khuẩn truyền sang tế bào với tần số cao Tế bào NK Là tế bào lympho có hạt lớn, có khả nhận biết tế bào bị ung thư, vi sinh vật xâm nhiễm tiêu diệt chúng nên gọi tế bào giết tự nhiên, ký hiệu NK hay TNK (natural killer) Tế bào mầm phôi (embryonic stem cell) Tế bào phôi chưa biệt hóa, đa thể chuột, nuôi cấy thời gian dài mà giữ tính đa thể, nghĩa khả biệt hóa theo nhiều hướng để phát triển thành tế bào khác tế bào tim, tế bào thần kinh, tế bào gan Tế bào trần (protoplast) Tế bào thực vật bị thành cellulose xử lý enzyme (cellulase, hemicellulase pectinase), thường dùng thí nghiệm dung hợp tế bào (protoplast fusion) hay gọi lai tế bào sinh dưỡng (somatic hybridization) để mở rộng nguồn gen tạo giống cấy trồng mang đặc tính ưu việt Thể Barr Thể Barr nhiễm sắc thể X bị bất hoạt kết đặc có nhân tế bào nữ giới, khơng có nam giới Thể biến nạp (transformant) Tế bào sinh vật nhận gen sinh vật khác trình biến nạp biểu chức gen kiểu hình Thể đột biến (mutant) Sinh vật (hoặc gen) mang đột biến di truyền Thể khảm (mosaic) Phôi thể có tế bào mang hệ gen khơng giống Nhập môn Công nghệ sinh học 350 Thể tái tổ hợp (recombinant) Các cá thể tế bào mang tổ hợp gen khác với cha mẹ chúng trình tái tổ hợp di truyền sinh Thông tin di truyền (genetic information) Thông tin lưu trữ phân tử DNA sinh vật dạng trình tự xếp bốn nucleotide A, T, C G đóng vai trị ”chữ cái” ”ngôn ngữ” di truyền Trong ngôn ngữ này, từ có ba chữ gọi ba Nghĩa từ amino acid có mặt phân tử protein tương ứng Mỗi ”câu” ngôn ngữ di truyền gen chứa đựng thông tin di truyền để đảm nhiệm chức trọn vẹn Mỗi chức đặc tính sinh lý, hình thái hay cấu trúc sống Do chế chép theo kiểu nửa bảo toàn DNA mà thơng tin di truyền truyền xác từ hệ sang hệ không thay đổi Thư viện cDNA (cDNA library) Tập hợp dòng DNA tạo từ mRNA tế bào mô cụ thể bacteriophage vector, đại diện cho thông tin di truyền mà tế bào biểu Thư viện hệ gen (genomic library) Tập hợp tất đoạn DNA tạo từ phản ứng cắt hạn chế genome bacteriophage vector, đại diện cho tồn cho thơng tin di truyền hệ gen Tính tồn thể (totipotency) Là khả sinh sản tái sinh thể hồn chỉnh từ phận Trình tự dẫn đầu (leader sequence) Một ba phần chủ yếu phân tử mRNA Trình tự nằm đầu 5’ mRNA mang thông tin để ribosome protein đặc hiệu nhận biết bắt đầu trình tổng hợp polypeptide, trình tự dẫn đầu khơng dịch mã thành trình tự amino acid Trình tự điều hịa (regulatory sequence) Một trình tự DNA tham gia vào q trình điều hịa gen Ví dụ promoter operator Trình tự khởi động (promoter) Trình tự nucleotide đặc hiệu nằm thành phần operon, có chức điều hòa hoạt động operon, nơi RNA polymerase bám vào để bắt đầu trình phiên mã Trình tự đặc trưng promoter có khoảng 20-200 nitrogen base Trình tự Shine-Dalgarno (Shine Dalgarno sequence, SD) Cịn gọi vùng liên kết ribosome (RBS), phần trình tự nucleotide đầu Nhập môn Công nghệ sinh học 351 5’ mRNA prokaryote kết hợp bổ sung cặp base với đầu 3’ 16S rRNA, dùng làm tín hiệu cho khởi đầu dịch mã Trình tự tăng cường (enhancer) Trình tự nucleotide dạng cis làm tăng cường độ phiên mã promoter gen eukaryote Nó nằm cách promoter hàng ngàn cặp base hoạt động theo hai hướng vị trí so với promoter Trypsin Enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide protein thủy phân phần protein, dẫn xuất từ trypsinogen dịch tụy tiết vào ruột non, enzyme ruột non enterokinase tác động chuyển thành Vật chủ (host) Tế bào dùng để nhân phân tử DNA lên nhiều lần Vector Là phân tử DNA đ gen, biểu o vật chủ (E coli V Vector biểu (expression vector) , ví dụ: E coli Để biểu gen ngoại lai E coli phải bắt đầu việc gắn vào vector biểu (thường plasmid) Vector phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: (1) Gen thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào (2) Một promoter kiểm soát phiên mã cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dịng (3) Các trình tự kiểm sốt dịch mã vùng liên kết ribosome bố trí thích hợp codon khởi đầu AUG (4) Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào hướng xác với promoter Vector liệu pháp (therapeutic vector) Có thể sử dụng viral vector virus Các viral vector thường dùng adenovirus, adenoassociated virus (AAV), retrovirus, lentivirus paramyxovirrus Các vector Nhập môn Công nghệ sinh học 352 virus phức hợp cationic liposome GL67, PEI, plasmid, SecR, Integrin Vector tạo dòng (cloning vector) Phân tử DNA mạch kép có khả tự chép tế bào vật chủ Có thể gắn vào phân tử đoạn vài đoạn DNA khác nguồn tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp dùng để nhân dòng Vết tan (plaque) Vòng tròn suốt xuất thảm đục vi khuẩn mọc môi trường thạch đặc, tan vỡ lặp lại nhiều chu kỳ tế bào vi khuẩn bị bacteriophage xâm nhiễm sinh tan Vi khuẩn hiếu khí (aerobe) Vi khuẩn sống khơng khí sử dụng oxygen tự để sinh trưởng Vi khuẩn kỵ khí (anaerobe) Vi khuẩn sống điều kiện khơng có khơng khí hay oxygen tự do, ngược lại với hiếu khí Trong q trình kỵ khí, H2S tạo gây mùi khó chịu Virus Phức hợp chứa nucleic acid (DNA RNA) nằm vỏ bọc protein, có khả gây nhiễm tái bên tế bào vật chủ đặc hiệu, tạo nhiều virus, lan truyền từ tế bào sang tế bào khác Virus dạng sống khơng có cấu trúc tế bào, có khả xâm nhập vào tế bào sống xác định sinh sản bên tế bào Giống tất sinh vật khác, virus có máy di truyền riêng mình, mã hóa việc tổng hợp hạt virus từ chất có tế bào vật chủ Như vậy, virus vật ký sinh nội bào Virus phân bố khắp nơi tự nhiên, xâm nhập vào tất nhóm sinh vật Người ta biết khoảng 500 loại virus xâm nhập động vật máu nóng, 300 loại xâm nhập thực vật bậc cao Một số khối u ung thư động vật người virus Virus tồn hai dạng: dạng nghỉ hay ngoại bào dạng sinh sản hay nội bào Kích thước hạt virus từ 15-350 nm, chiều dài số loại virus đạt tới 2000 nm Phần lớn virus nhìn thấy qua kính hiển vi điển tử Chất mang thông tin di truyền virus nucleic acid: DNA RNA Vì vậy, phân virus thành hai loại: loại mang DNA loại mang RNA Vi tiêm (microinjection) Kỹ thuật đưa DNA vào nhân vào tế bào chất tế bào kim mao dẫn bơm áp lực Toàn thao tác tiến hành kính hiển vi ngược pha (inverted microscope) Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 353 Vị trí cos (cos site) phage λ Vị trí liên kết kháng nguyên đơn (unique antigen combining site) Vị trí liên kết với kháng thể nằm phân tử kháng ngun Vịng cặp tóc (hairpin loop) Vùng chuỗi đơn bổ sung tạo nếp gấp chứa cặp base tạo thành xoắn kép, Vùng hướng (downtream region) Đề cập đến vị trí đoạn trình tự nằm phía đầu 3’ gen đoạn gen quan tâm Vùng đa nối (polylinker hay polycloning site) Một trình tự DNA mạch kép tổng hợp nhân tạo có mang loạt vị trí nhận biết enzyme hạn chế Trình tự gắn vào vector dùng kỹ thuật tạo dòng gen (như vùng tạo dòng) Vùng liên kết ribosome (ribosome binding site, RBS) (xem trình tự Shine-Dalgarno) Vùng ngược hướng (upstream region).Vị trí trình tự nucleotide nằm phía đầu 5’ phân tử DNA so với gen quan tâm Vùng tạo dòng (multiple cloning sites, MCS) t số enzyme cắt hạn chế thông dụng, thiết kế để chèn đoạn DNA ngoại lai vào Western blot Kỹ thuật chuyển protein tổng số phân tách điện di SDS polyacrylamide gel lên màng nylon nitrocellulose để lai với kháng thể thứ đặc hiệu sau kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme nhằm phát protein kháng nguyên tương ứng Xenobiotic Một loại hợp chất tìm thấy thể sống khơng sản xuất bình thường mong đợi có mặt thể Nó bao gồm chất diện với nồng độ cao bình thường nhiều lần Đặc biệt, loại thuốc kháng sinh xem xenobiotic người thể người không tự sản xuất chúng Tuy nhiên, lĩnh vực môi trường thuật ngữ thường sử dụng để chất gây Nhập môn Công nghệ sinh học 354 ô nhiễm dioxin, polychlorinated biphenyl , ảnh hưởng chúng lên khu hệ sinh vật (biota) X-gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl- -D-galactopyranoside) Cơ chất sinh màu với -galactosidase cho sản phẩm có màu xanh lam YAC (Yeast artificial chromosome) Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, dùng làm vector để tạo dòng đoạn DNA có kích thước lớn nấm men Yếu tố tác động cis (cis-acting element) Đoạn trình tự DNA biểu hiệu phân tử DNA mà tác động Ví dụ: hộp CAAT phần tử tác động cis trình phiên mã sinh vật eukaryote Yếu tố tác động trans (trans-acting element) Yếu tố di truyền biểu hiệu mà không cần nằm phân tử với đoạn trình tự đích Thường yếu tố mã hóa cho sản phẩm protein (có thể enzyme hay protein điều hòa) sản phẩm khuếch tán đến điểm tác động Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ban Từ điển-NXB Khoa học Kỹ thuật 2002 Từ điển Bách khoa Sinh học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press Inc New York, USA Lawrence E 1995 Henderson’s Dictionary of Biological Terms 7th ed Longman Group Ltd Singapore Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Singleton P and Sainsbury D 2001 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed John Wiley & Sons, Ltd UK Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology ed The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK th Nhập môn Công nghệ sinh học 355 NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC HUẾ Địa chỉ: 01 Điện Biên Phủ, Huế - Điện thoại: 054.834486 Chịu trách nhiệm xuất bản: Giám đốc: Nguyễn Xuân Khoát Tổng biên tập: Hồng Hữu Hịa Người phản biện: PGS TS Lê Trần Bình Biên tập nội dung: PGS Nguyễn Khải Biên tập kỹ thuật-mỹ thuật: Hồng Minh Trình bày bìa: Nguyễn Hồng Lộc Chế vi tính: Nguyễn Hồng Lộc NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC In 500 khổ 16×24 cm, Cơng ty In Thống kê Sản xuất Bao bì Huế, 36 Phạm Hồng Thái, Huế Số đăng ký KHXB: 151-2007/CXB/01-03/ĐHH Quyết định xuất số: 07/QĐ-ĐHH-NXB, cấp ngày 12/4/2007 In xong nộp lưu chiểu tháng năm 2007 ... nghĩa công nghệ sinh học Định nghĩa tổng quát 1.1 Công nghệ sinh học truyền thống 1.2 Công nghệ sinh học đại 6 7 Nội dung khoa học công nghệ sinh học Các lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học 3.1 Công. .. Công nghệ sinh học nông nghiệp 3.2 Công nghệ sinh học y dược 3.3 Công nghệ sinh học công nghiệp chế biến thực phẩm 3.4 Công nghệ sinh học môi trường II Sơ lược lịch sử hình thành cơng nghệ sinh học. .. có Nhập mơn Cơng nghệ sinh học sách đầu tư hợp lý ưu tiên cho công nghệ sinh học Dưới lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học quan tâm hàng đầu Các lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học 3.1 Công nghệ