Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp gs ts nguyễn quang thạch (chủ biên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I HÀ NỘI GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH (Chủ biên) TS NGUYEN THI LY ANH - TS NGUYEN THỊ PHƯƠNG THẢO Giao trinh CONG NGHE SINH HOC NONG NGHIEP TL TRU Vib iv 2272 _+).› [AF SS NHA XUAT BAN NONG NGHIEP HA NOI - 2005 MỤC LỤC Lời nói đầu Chương I GIĨI THIỆU CHƯNG Khái niệm định nghĩa công nghệ sinh học Sơ lược lịch sử phát triển 10 Phân loại công nghệ sinh học Thành tựu xu phát triển \ Câu hỏi ôn tập Chương II CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI Các kỹ thuật sử dụng tạo ADN tái tổ hợp 1.1 Khái niệm 1.2 Các enzym chủ yếu sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 Các Các Các Các enzym giới hạn (restriction enzym) ligase polymerase nuclease 12 14 15 16 l6 16 16 16 20 21 21 1.2.5 Các enzym sửa đổi ADN 21 tái tổ hợp 21 1.3.2 Các vectơ nhân dòng chủ yếu 23 1.3 Các vectơ nhân dòng (cloning vector) sử dụng công nghệ ADN 1.3.1 Khái niệm 21 1.4 Nhân dòng gen (gene cloning) 27 Các kỹ thuật sử dụng phân tích ADN 29 2.1 Phương pháp chiết tách ADN 2.1.1 Phương pháp chiết tách ADN từ thực vật 2.1.2 Phương pháp chiết tách ADN động vật 2.1.3 Phương pháp chiết tách ADN từ mẫu vi khuẩn 2.1.4 Phương pháp chiết tách ARN 2.1.5 Định lượng đánh giá độ tỉnh axit nucleic chiết tách 2.2 Các kỹ thuật lai axit nucleic 2.2.1 Phương pháp lai Southerm Blot 2.2.2 Phương pháp lai Northern Blot 2.2.3 Phương pháp lai Western Blot 2.3 Các phương pháp giải trình tự gen 2.3.1 Phương pháp Maxam Gilbert 2.3.2 Phương pháp Sanger 2.3.3 Giải trình tự gen phương pháp tự động Ũ 29 29 30 30 31 31 32 32 36 36 37 37 38 38 2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 38 2.4.1 Khái niệm chung 38 2.4.2 Nguyên lý phương pháp 2.4.3 Độ tin cậy phản ứng PCR số yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR cần lưu ý 2.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR 2.5 Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa PCR 2.5.1 Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN) - Da hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên 2.5.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Sự đa hình chiều dài phân đoạn ADN nhân 2.5.3 Ky thuat STS (Sequence Tagged Site) - Điểm trình tự đánh dau 2.5.4 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) - Đa hình trình tự lặp 2.6 cADN 2.6.1 2.6.2 2.7 Chọn 2.7.1 lại đơn giản (Complementary DNA) - Ngân hàng cADN Khái niệm Kỹ thuật tạo cADN ngân hàng cADN lọc gen có ý nghĩa Phương pháp lai ADN vẽ 2.7.2 Phương pháp nhận biết qua protein 2.8 K¥ thuat Microarray (microscofic arrays) 2.8.1 Nguyén ly 2.8.2 Phương pháp tiến hành : 2.8.3 Kha nang ting dung Câu hỏi ôn tập Chương II CÔNG 39 39 40 43 44 45 "46 46 46 46 47 48 49 49 50 50 50 51 52 NGHỆ SINH HỌC TRONG TRỒNG TRỌT Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật ; Ị 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cơ sở kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 1.2 Nhân giống trồng nuôi cấy mô 1.2.1 Ý nghĩa 1.2.2 Các bước nhân vơ tính in vitro 1.2.3 Các phương thức nhân giống vơ tính in vitro 1.2.4 Các hạn chế nhân giống trồng nuôi cấy mô 1.3 Làm bệnh virus qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) 1.3.1 Cơ sở khoa học 1.3.2 Kỹ thuật làm virus qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh 1.3.2 Các kỹ thuật làm virus ín vitro 1.3.3 Nhân nhanh trì tình trạng bệnh 1.4 Chọn tạo giống nhờ công nghệ tế bào 53 54 54 54 55 58 58 59 60 63 64 64 65 66 66 70 1.4.1 Kỹ thuật tạo đơn bội in vitro ứng dụng công tác giống trồng 1.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần ứng dụng công tác giống trồng 1.4.3 Biến dị dịng soma ni cấy mô 13s Kỹ thuật thụ phấn ống nghiệm nuôi cấy phôi in vitro 1.5.1 Thu phan in vitro 1.5.2 Nuôi cấy phôi in vitro ; 1:6: Công nghệ tế bào bảo quản nguồn gen 1.6.1 Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu 1.6.2 Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật Qiks Ky thuat chuyén gen 1a gi 2:2: Các phương pháp chuyển gen 2;2:1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 2.2.2 Chuyển gen trực tiếp 2.3: Cơ sở khoa học hướng tạo giống bang chuyển gen 2.3.1 Chuyển gen kháng sâu 2.3.2 Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 2.3.3 Chuyển gen tạo kháng virus nhờ chuyển nạp gen protein vỏ Virus 2.3.4 Chuyển gen tạo giống fee có kiểu mầu sắc 2.3.5 Chuyển gen sản xuất protein động vật vào thực vật 2.3.6 Chuyển gen thay đổi protein thực phẩm thức ăn gia súc 2.3.7 Chuyển gen tạo tính bất dục trồng Chỉ thị phân tử ứng dụng chọn tạo giống 3.1 Giới thiệu chung 3:2, Khả ứng dụng thị phân tử công tác giống 8:3, Giới thiệu số thị phân tử thường dùng 3.4 Chọn tạo giống nhờ thị phân tử MAS (Marker Assibeda Selection) 86 86 91 96 96 97 98 98 100 100 101 102 103 104 104 104 Câu hỏi ôn tập 107 Chuong IV CONG NGHE SINH HOC TRONG CHAN NUOI VA THU Y 108 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 1.1 Đưa tế bào vào ni cấy 1.2 Dịng tế bào liên tục 1.3 Môi trường nuôi cấy 1.4 Các cách nuôi cấy 1.4.1 Nuôi cấy quy mô nhỏ 1.4.2 Nuôi cấy quy mô lớn 15, Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào động vật 1.5.1 Để đánh giá d6 déc in vitro (in vitro toxicity testing) 1.5.2 Sản xuất vacxin virus 108 108 109 109 lll lll lll lil 111 111 112 112 112 114 114 Sản xuất tế bào gốc 2.1 Tính tồn tế bào động vật 2.2 Định nghĩa tế bào gốc (stem cell) 2.3 Khả ứng dụng tế bào gốc 2.3.1 Trong nghiên cứu 2.3.2 Đối tượng để thử nghiệm an toàn dược phẩm 114 2.3.3 Tế bào trị liệu 115 Kỹ thuật cấy chuyển phôi 3.1 Đặc điểm phát triển phôi giai đoạn sớm : 115 116 3.2 Kỹ thuật lấy phôi cấy phôi 117 3.3 Ứng dụng cấy chuyển phôi 118 Nhân động vật - kỹ thuật cloning 121 Công nghệ tạo vật nuôi chuyển gen 126 3.3.1 Nhân nhanh gia súc thú đặc biệt quý 3.3.4 Nhân nhanh phôi 5.1 Các phương pháp chuyển gen vào tế bào động vật 5.2 Các hướng nghiên cứu khả ứng dụng động vật chuyển gen 5.2.1 Chuyển gen làm tăng sức sinh trưởng bổ sung số đặc tính 5.2.2 Chuyển gen vào động vật để sản xuất protein giá trị cao 5.2.3 Chuyển gen người vào động vật nhằm sản xuất nội tạng thay 5.2.4 Chuyển gen tạo côn trùng kháng tác nhân gây người bệnh cho Công nghệ sinh học sản xuất kít chẩn đốn, thuốc điều trị bệnh thức ăn cho vật nuôi 118 120 126 127 127 128 129 129 129 | 6.1 Cơng nghệ sản xuất kháng thể đơn dịng 6.2 Vacxin tái tổ hợp 129 131 | | 6.3 Các sinh phẩm kích thích sinh trưởng vật ni 133 | 6.4 Chỉ thị phân tử ứng dụng chẩn đoán bệnh vật nuôi 15 Câu hỏi ôn tập 135 Chương Y AN TỒN SINH HỌC TRONG CƠNG NGHỆ SINH HỌC 136 Khái niệm t Những lợi ích trồng chuyển gen Câu hỏi ôn tập- Tài liệu tham khảo ; | 136 : 136 i 137 155 ; “Thuật ngữ chuyên dụng : 137 Những rủi ro có chuyển gen Các quy định an toàn sinh học | 156 160 LỜI NÓI ĐẦU Càng với phát triển thiết bị công nghệ tỉnh vi công cụ tin học, công nghệ sinh học đại đời phát triển vũ bão, mang lại thành tựu tuyệt vời cho nhân loại Hiện nay, công nghệ sinh học không công cụ nghiên cứu sắc bén cho phép nghiên cứu chế tượng sống mức phân tử mà cịn nhanh chóng trở thành công nghệ sản xuất với sản phẩm hoàn toàn mẻ, độc đáo phục vụ nhiều lĩnh vực, trước hết y tế nông nghiệp Tuy vậy, hiểu biết công nghệ sinh học cộng đồng hạn chế chưa thống Việc cung cấp kiến thức cơng nghệ sinh học nói chung cơng nghệ sinh học nơng nghiệp nói riêng sở giáo dục, đào tạo nước ta (một nước có gân 80% dân số làm nóng nghiệp) yêu cầu xúc h Nhằm đáp ứng nhu cầu học tập sinh viên, tập thể tác giả giao nhiệm vụ biên soạn giáo trình “Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp” Cuốn sách gồm chương: Chương I: Giới thiệu chung Chương đề cập đến vấn đề chung công nghệ sinh học như: công nghệ sinh học gì? phân loại cơng nghệ sinh học, lịch sử phát triển triển vọng công nghệ sinh học Chương I giúp người đọc có nhìn tồn diện đắn công nghệ sinh học Chương II: Các kỹ thuật nên công nghệ sinh học đại Đây chương trình bày sở khoa học, nguyên lý, nội dung số kỹ thuật công nghệ sinh học đại với công nghệ chìa khố cơng nghệ ADN bao gồm ngun lý kỹ thuật cụ thể thao tác phân tử ADN: kỹ thuật chiết tách, kỹ thuật nhân dịng, kỹ thuật PCR, kỹ thuật xác định trình tự, kỹ thuật nhận biết biểu gen Chương IHII: Công nghệ sinh học trồng trọt Nội dung chương đề cập đến sở khoa học, kỹ thuật khả ứng dựng công nghệ tế bào công nghệ gen - hai công nghệ quan trọng công nghệ sinh học thực vật Chương tập trung vào vấn đề: sở kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, tổ chức phịng thí nghiệm, kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro, kỹ thuật tạo bệnh virus, kỹ thuật tạo đơn bội, kỹ thuật tách, nuôi cấy dung hợp tế bào trần, kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro, van đề biến dị dịng vơ tính ứng dụng nó, phương pháp chuyển gen vào thực vật hướng tạo chuyển gen Chương IV Công nghệ sinh học chăn nuôi thú y Chương tập trung đề cập đến lĩnh vực bật công nghệ sinh học động vat: công nghệ cấy chuyển phôi, công nghệ nhân động vật (cloning), động vật chuyển gen ứng dụng mể công nghệ sinh học chăn nuôi thú y: vacxin tái tổ hợp, kháng thể đơn dòng, tế bào gốc Chương V: Vấn đê an toàn sinh học công nghệ sinh học Đây vấn để cân thiết nhầm giúp cho việc sử dụng sản phẩm công nghệ sinh học cách chủ động, có hiệu quả, đảm bảo an tồn cho mơi trường, xã hội Trong chương trình bày lợi ích rủi ro sinh vật chuyển sen, giới thiệu dự thảo nhà nước an tồn sình sinh hoc Có thể nói, thời đại bàng nổ thông tin phát triển khơng ngừng cơng nghệ sinh học, với trình độ có hạn, việc lựa chọn nội dung cần giới thiệu giáo trình cho nhất, đại nhất, Việt Nam điều khơng đơn giản đẩy khó khăn cho nhóm tác giả Chúng cố gắng tập hợp, kế thừa tài liệu nhiều tác giả nước, chọn lọc thông tin, biên soạn mạnh dạn sớm mắt bạn đọc giáo trình “Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp” Giáo trình biện soạn lần yếu nhằm phục vụ giảng dạy cho sinh viên năm cuối Trường Đại học Nông nghiệp thuộc chuyên ngành công nghệ sinh học, nông học, chăn nuôi thú y, phạm kỹ thuật Chúng hy vọng tài liệu hữu ích cho cán giảng dạy sinh viên trường Đại học Khoa học, trường Đại học, Cao đẳng Nông, Lâm, Ngư, Y nhà nghiên cứu bạn đọc có quan tâm đến công nghệ sinh học Chúng mong nhận nhiêu ý kiến đóng góp để sách ngày hoàn thiện Các tác giả ChươngI GIỚI THIỆU CHUNG Chương đề cập đến nguồn gốc, định nghĩa lịch sử phát triển công nghệ sinh học Bên cạnh làm rõ việc phân loại lĩnh vực công nghệ sinh học theo quan điểm khác trình bày xu hướng phát triển, triển vọng công nghệ sinh học Những khái niệm chung mang lại nhìn tổng qt cơng nghệ sinh học tương lai KHÁI NIỆM VÀ ĐỊNH NGHĨA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khai niém Biotechnology - công nghệ sinh học đề xuất năm 1917 kỹ sư người Hungari tên Karl Erky để mơ tả q trình chế biến củ cải đỏ làm nguồn thức ăn phục vụ sản xuất lợn với qui mé ldn: Theo Karl Erky, Biotechnology la tir ding để “Tất công việc sản phẩm sản xuất từ nguyên liệu thô với giúp đỡ vật chất sống” Năm 1961 nhà vi sinh vật học người Thuy Điển Carl Goren Hedén dé nghị đổi tén tap chi khoa hoc Journal of microbiological and Biochemical Engineering and technology Biotechnology and Bioengineering để đăng tải nghiên cứu lĩnh vực vi sinh học ứng dụng lên men cơng nghiệp Từ đó, Biorechnology trở nên rõ ràng gắn liền với nghiên cứu “sự sản xuất công nghiệp loại hàng hố dịch vụ thơng qua q trình có sử dụng thể, hệ thống sinh học chế biến” Các nghiên cứu công nghệ sinh học phát triển dựa lĩnh vực chun mơn vi sinh, hố sinh cơng nghệ hố học + Cơng nghệ sinh học theo W.H Stone (1987) định nghĩa: “Là cơng nghệ sử dụng thể sống phần thể nhu tế bào, để tạo thay đổi sản phẩm nhằm cải tiến trồng vật nuôi, phát triển vi sinh vật vào ứng dụng đặc hiệu” Theo liên đồn cơng nghệ sinh học chau Au (EFB): “Công nghệ sinh học ứng dụng tổng hợp sinh hoá học, vi sinh vật khoa học công nghệ để đạt tới ứng dụng công nghiệp lực vi sinh vật, tế bào, tổ chức nuôi cấy thành phần chúng” Nam Theo nghị 18/CP ngày 11/3/1994 phát triển công nghệ sinh học Việt đến năm 2010: “Công nghệ sinh học tập hợp ngành khoa học (sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học cơng nghệ học) nhằm tạo công nghệ khai thác quy mô công nghiệp hoạt động sống vi sinh vật, tế bào thực vật động vật" Như khái quát chung định nghĩa công nghệ sinh học sau: “Cơng nghệ sinh học q trình sản xuất quy mơ cơng nghiệp có tham gia tác nhân sinh học (ở mức độ thể, tế bào tế bào) dựa thành tựu tổng hợp nhiều môn khoa học, phục vụ cho việc tăng cải vật chất xã hội bảo vệ lợi ích người ” Theo quan điểm đại, tác nhân sinh học tham gia vào trình sản xuất giống sinh vật sản phẩm chúng tạo kỹ thuật di truyền đại (công nghệ gen) Từ định nghĩa cô đọng thấy: + CNSH khơng phải mơn khoa học tốn, lý, hố, sinh học phân tử mà phạm trù sản xuất + CNSH không tạo thêm cải vật chất mà hướng vào việc bảo vệ tăng cường chất lượng sống người + Công nghệ gen xem cơng nghệ chìa khố CNSH đại + Thực tế, công nghệ sinh học mang tính ứng dụng, nhiên hàng loạt kỹ thuật công nghệ sinh học công cụ sắc bén để nghiên cứu khoa học sinh học làm sáng tỏ chế tượng sống mức phân tử SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Sự phát triển công nghệ sinh học chia làm giai đoạn: Giai đoạn I: Từ xa xưa lịch sử phát triển, người sử dụng tác nhân sinh học, đặc biệt vi sinh vật vào việc bảo quản chế biến thực phẩm: tạo đồ uống lên men (rượu, bia), sản xuất mát, sữa chua, đậu phụ, chao chưa hiểu rõ chất cơng nghệ nói Thực chất q trình cơng nghệ sinh học Đặc điểm giai đoạn nhận thức hạn chế người khoa học sinh học Các sản phẩm nhờ áp dụng sinh học áp dụng qua thực nghiệm, kinh nghiệm, sản xuất thủ công Giai đoạn 2: từ cuối kỷ 19 Con người bất đầu hiểu biết trình sinh lý, sinh hoá, di truyền sinh vật áp dụng vào sản xuất Trước hết sử dụng vi sinh vật sản xuất sinh khối, hoạt chất thứ cấp Vào đầu năm 1900, người ta sử dụng qui trình lên men vào cơng nghiệp hố học qui mơ lớn để sản xuất axeton, butanol, ethanol Trong Đại chiến giới lần thứ II với phát triển cơng nghệ lên men tính ví, người sản xuất khối lượng lớn penicillin chất kháng sinh khác Sau chiến tranh, với phát triển mạnh mẽ, nhiều hợp chất steroid, enzym số vitamin đời 10 | | 2.2 Nhà kính ngăn chặn B Các điều kiện ban đánh giá thao tác di truyền xác định thay đổi theo tác nhân gây bệnh thực theo trường hợp a) Những điều kiện đặc biệt cần thêm vào điều nói nhà kính ngăn chặn “A”' để ngăn chặn việc lan truyền tác nhân gây bệnh thực vật xử lý mặt di truyền, đặc biệt chuyển từ phịng thí nghiệm nhà kính, bố trí thiết bị qua sống sót hạt phấn, hạt giống vật truyền sinh học khác b) Cần có áp suất bên nhà kính thấp áp suất mơi trường ngồi cửa kép c) Cần có thiết bị xử lý nước thải nước thải nguy hiểm lọc khí, trường hợp phân tán khí khơng nguy hiểm d) Cân xây dựng nhà kính thích hợp (nền sàn, tường thấp, ngưỡng cửa ) e) Cần ngăn ngừa việc thụ phấn gieo hạt, cần cất chứa hạt phấn hạt giống trường hợp phát tán nhờ nước đất nguy hiểm _ Cần có biện pháp phịng ngừa nhiễm khử nhiễm quần áo nhân viên dụng cụ, bình/chậu, thiết bị, , truyền nhiễm giới mức rủi ro trung bình g) Cần hạn chế trồng chủ gần phương tiện ngăn chặn kiểm tra ngồi tác nhân truyền nhiễm Chuồng nhốt vật nuôi 3.1 Nguyên tắc chung - Khi vật nuôi dùng cho mục đích thí nghiệm chẩn đốn, người sử dụng cần có ý thức thực tất biện pháp cần thiết để tránh cho chúng đau đớn vơ ích Động vật phải bố trí thoải mái, vệ sinh, có nước thức ăn đảm bảo đủ chất đủ lượng Sau kết thúc thí nghiệm, chúng hiến thân theo đạo đức không bị đau đớn - Chuồng nhốt phải độc lập, tách rời phịng thí nghiệm Nếu gắn vào phịng thí nghiệm, chuồng phải dự kiến cho cách ly với khu vực chung trường hợp cần thiết khử nhiễm, tẩy uế - Giống phịng thí nghiệm, chuồng nhốt dự kiến theo nhóm rủi ro tác nhân nghiên cứu, so với mức an toàn Cần lưu ý đến thể tích nồng độ mà tác nhân sử dụng, đường nhiễm truyền đường tiết khả di Đối với vật nuôi, cần lưu ý đến chất, tính xu hướng cắn, cào, cấu chúng, vật nuôi ngoại ký sinh, bệnh dễ truyền cho người tác nhân gây di ting dễ lan 3.2 Quy định chuồng nhốt an toàn mức _ Đây mức phù hợp để giữ phần lớn vật nuôi sau kiểm dịch (trừ dạng khỉ động vật nhiễm truyền cố ý tác nhân thuộc nhóm rủi ro) 151 3.3 Quy định chuồng nhốt an toàn mức Đây mức phù hợp với công việc động vật nhiễm truyền cố ý tác nhân thuộc nhóm rủi ro Cần áp dụng biện pháp an toàn sau đây: 1/ Các biển báo an toàn sinh học phải gắn lên cửa vào chỗ thích hợp 2/ Chuồng phải dự kiến cho cọ rửa bảo dưỡng 3/ Cửa phải mở vào phía đóng tự động 4/ Hệ thống sưởi, thơng khí độ chiếu sáng thích hợp 5/ Nếu thơng khí học, luồng khí phải hướng vào bên đảm bảo lấy khí khí quyền Khí khơng tái chu chuyển ngăn chuồng 6/ Sự vào giới hạn cho người phép 7/ Không đưa vào động vật khác, trừ vật dành cho thí nghiệm 8/ Phải có biện pháp phịng chống lồi chân khớp gặm nhấm 9/ Phải có rào chắn động vật chân khớp qua lại - 10/ Diện tích làm việc phải khử nhiễm chất tẩy uế có hiệu sau sử dụng 11/ Phải sử dụng tường bao an toàn sinh học (loại I loại II) cho hoạt động dễ tạo xon khí 12/ Phải có nồi hấp chỗ bên cạnh 13/ Phải dọn rơm rác độn chuồng cho hạn chế đến mức tối đa tạo bụi xon khí 14/ Tất chất thải rơm rác phải khử nhiễm trước loại bỏ +_15/ Đồ dùng phải hấp thiêu huỷ phải chở an toàn đồ đựng kín 16/ Lồng động vật phải khử nhiễm sau dùng 17/ Phải thiêu huỷ xác động vật 18/ Phải có bồn rửa Nhân viên phải rửa tay trước rời khỏi khu chuồng 19/ Phải mặc quần áo bảo hộ chuồng nhốt với găng tay thích hợp cởi lúc ngồi 20/ Phải thông báo ghi lại vết thương, dù nhỏ 21/ Không ãn, uống, hút thuốc trang điểm chuồng nuôi 3.4 Quy định chuồng nhốt an toàn mức Đây mức phù hợp với công việc động vật nhiễm truyền cố ý tác nhân thuộc nhóm rủi ro 1/ Phải áp dụng tất khuyến nghị loại chuồng mức an toàn sinh hoc va 152 ae 2/ Phai quy dinh chat ché su tiếp cận 3/ Nơi bố trí phải tách riêng khỏi phần cịn lại phịng thí nghiệm chuồng khác phịng đợi có hai cửa, tạo thành buồng thơng khí 4/ Phịng ngồi phải có bồn rửa vòi tắm 5/ Phải đảm bảo khơng khí thường xun tất gian hệ thống học Khí thải phải lọc HEPA trước vào khí (khơng tái chu chuyển) Hệ thống phải dự kiến để ngăn ngừa đảo ngược ngẫu nhiên hướng luồng khơng khí 6/ Phải có nồi hấp khử trùng chuồng 1/ Phải có lị thiêu huỷ dùng chỗ 8/ Các vật bị nhiễm tác nhân thuộc nhóm rủi ro cần cho vào lồng để gian cách ly mà lỗ hệ thống khí bố trí sau lồng 9/ Rơm rác độn chuồng cần tạo bụi 10/ Quần áo bảo hộ dành riêng phải để khu chuồng, cởi trước hấp trước loại bỏ 11/ Nhân viên phải tiêm vacxin xét thấy cần 3.5 Quy định chuồng nhốt an toàn mức Đây mức dành cho công việc gắn liền với thao tác phịng thí nghiệm giam hãm có độ an tồn cao áp dụng theo mức hài hồ nơi 1/Phải áp dụng khuyến nghị chuồng mức an toàn 1, 2, theo nhu cầu 2/ Phải quy định nghiêm ngặt việc tiếp cận (khoá); nhân viên giám đốc quan định phép vào 3/ Không làm việc Phải có hai người 4/ Nhân viên phải đào tao vé vi sinh hoc đủ biết rõ rủi ro gắn liền với cơng việc cách đề phịng cần thiết 5/ Nếu chuồng phận phịng thí nghiệm giam hãm có độ an tồn cao (mức 4) phải nằm khu cách ly 6/ Phải vào chuồng qua phòng đợi tạo thành buồng thơng khí, phía phải tách riêng phía tiếp cận tiếp cận quy định phịng để quần áo có vịi tảm 7/ Chuồng phải thơng khí nhờ hệ thống khí có lọc HEPA dự kiến để tạo giảm áp 8/ Hệ thống khí phải dự kiến để ngăn ngừa tượng đảo chiều luồng khí bố trí khu vực có áp suất dương 3/ Phải có nồi hấp cửa, phía mở gian bên chuồng 153 10/ Nhân viên phải cởi quần áo đường vào, mặc quần áo bảo hộ dành riêng Sau làm việc phải cởi quần áo bảo hộ để dụng cụ đựng để hấp loại bỏ, tắm rửa trước 11/ Cần chuyển giao dụng cụ qua phịng thơng khí dự kiến cho mục đích 12/ Mọi thao tác động vật phải tiến hành tường bao an toàn loại 13/ Tất vật phải gian cách ly 14/ Toàn chất thải rơm rác phải hấp trước đưa khỏi chuồng 15/ Nhân viên phải giám sát y tế tiêm chủng theo nhu cầu Các mức an toàn chuồng, thực hành phương tiện 4m Nhóm rủi ro Mức an tồn sinh học i e cas h Thực hành phịng thí nghiệm Số š Phương tiện an tồn 1 Lui tới hạn chế, quần áo bảo hộ găng 2 Lui tới hạn chế; có biển báo rủi ro; quần Tường bao an toàn loại ! loại áo bảo hộ găng tay; khử nhiễm phế | II cho hoạt động tạo xon khí; tay thải lồng trước cọ rửa thiết bị bảo hộ nhân viên 3 Lui tới quy định; quần áo bảo hộ Tường bao an toàn loạiI, II cho tất đặc biệt; mức 1,2 cho phần lại |cả hoạt động; thiết bị bảo hộ nhân viên 4 Lui tới quy định nghiêm ngặt; | Tường bao loại III quần áo biện pháp cho mức cộng phòng để | dính liền áp dụng cho tất quần áo vòi tắm; khử nhiễm tất | hoạt động phế thải trước 3.6 Động vát không xương sống Động vật không xương sống dùng cho thí nghiệm phịng thí nghiệm thường ổ vật truyền mầm bệnh, trường hợp nghiên cứu sinh thái môi trường, lây nhiễm tự nhiên mầm bệnh đưa vào thức ăn Số động vật không xương sống thường dùng gồm có: giun đốt, chân khớp, da gai, thân mềm (nhuyễn thể), giun dẹp động vật nguyên sinh Giống động vật có xương sống, mức an tồn chuẻng unường nhóm rủi ro tác nhân nghiên cứu có mặt tự nhiên qui định Tuy nhiên, cần có thêm biện pháp đềnets đặc biệt số lồi chân khớp, trùng có cánh 1/ Động vật khơng xương sống bị nhiễm ? không bị nhiễm phải cho vào ngăn riêng biệt 2/ Các ngăn phải khép kín để khử nhiễm cách xơng 3/ Phải có sắn bình phun thuốc sâu 4/ Phải dự kiến trước hệ thống làm lạnh cần, để giảm hoạt động động vật khổng xương sống 154 5/ Việc tiếp cận phải qua phịng có bẫy trùng cửa phải có lưới } i | | 6/ Mọi đường khí cửa sổ dễ mở phải chắn lưới 7/ Xiphông bồn rửa cống không tháo khô 8/ Tất chất thải phải khử nhiễm nhiệt, số lồi động vật khơng xương sống khơng bị chết tất chất tẩy uế 9/ Phải kiểm soát số dạng ấu trùng trưởng thành lồi chân khớp có cánh, bò nhảy 10/ Lồng chứa ve, bét phải đặt mâm có chứa dầu hoả 11/ Những trùng có cánh bị nhiễm tác nhân thuộc nhóm có rủi ro cao phải cho vào lồng có hai vách 12/ Chân khớp bị nhiễm tác nhân thuộc nhóm có rủi ro cao phải xử lý tường bao an tồn sinh học gian cách ly Nói chung Mục đích quy chế đặt yêu cầu có liên quan đến việc sử dụng lồi sinh vật biến đổi gen, loài lạ sản phẩm chúng sản xuất tiêu dùng nhằm đảm bảo an tồn cho mơi trường, tính đa dạng sinh học sức khoẻ người l CÂU HỎI ÔN TẬP ˆ1 Sinh vật biến đổi di truyền mang lại lợi ích gì? Vì phải đặt vấn đề an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen? Những điều cần quan tâm sử dụng sinh vật biến đổi gen? 155 THUẬT NGỮ CHUYÊN DỤNG ADN: Chữ viết tắt axit deoxyribonucleic, vật sinh vật ADN thường chứa nhân tế bào, ADN cịn có quan tử ty thể, lục di truyền nhân, ADN quan tử định đặc chất nằm lạp tính mang thơng tin di truyền nhiễm sắc thể Ngoài ADN nhân định đặc tính di truyền tế bào chất ADN khn: đoạn ADN mà trình tự nucleotid dùng làm khn để tổng hợp nên đoạn ADN để tổng hợp nên sợi ARN thơng tin q trình phiên mã ADNpolymerase (DNApolymerase): enzym xúc tác gắn nucleotid đầu mạch polynucleotid (kéo dài mạch) trình tổng hợp chuỗi ADN ADN ARN tái tổ hợp (Recombinant DNA): ADN tạo thành từ đoạn ADN có nguồn gốc khác thơng qua vi thao tác người - Antisen: gọi ARN đối bản, đoạn ARN có trình tự nucleotid tương ứng theo nguyên tắc bổ sung với gốc, thường ARN thông tin đặc trưng cho gen ARN đối đễ dàng tương tác với ARN thông tin gốc làm hoạt động dịch mã ARN thơng tin bị khố Biến nạp (transformation): Q trình đưa ADN (gen) lạ vào tế bào chủ kỹ thuật khác Kết trình biến nạp thu thể biến đổi di truyền Bộ gen (genome): Tồn vật liệu thơng tin di truyền có mặt tế bào bao gồm genome nhân, genome lục lạp genome ty thể Cảm ứng (hố chu chất (induction): Q trình kích thích hình thành loại cấu trúc hay phận thể, quan ni cấy nhận tác nhân gây cảm ứng chất, yếu tố môi trường ): cảm ứng hoa tác động quang kỳ, cảm ứng tạo mô sẹo (callus induction) quan nuôi cấy hợp auxin Cấy chuyển (subculture): việc chuyển tế bào, mơ hay mẫu vật ni câý sang bình ni có chứa mơi trường Có thể kết hợp cấy chuyển vớáoư nhân nhanh tách nhỏ mẫu cấy pha loãng mật độ tế bào Chủng tế bào (cell strain): gồm tế bào có đặc điểm riêng biệt chọn từ mô nuôi cấy ban đầu hay dịng tế bào có trước Con lai tế bào soma (somatic cell hybrid): 1a thể lai (tế bào thể hồn chỉnh) tạo nên nhờ q trình dung hợp tế bào trần (protoplast) Công nghệ nano sinh học (bionanotechnology): lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học thực kích thước nano (kích thước tới hạn năm chiều dài phân tử bước sóng ánh sáng nhìn thấy từ 0,1-500nm) 156 Di truyền tế bào chất (cytoplasmic inheritance): Hiện tượng di truyền gen thuộc quan tử (ty thể, lục lạp) hay plasmid tự tế bào chất định Dòng (clone): Tập hợp tế bào thể nhân phương thức vơ tính từ tế bào hay thể Dòng tế bào (cell line): khái niệm để tập nguồn gốc từ tế bào ban đầu Dung hợp tế bào trần (protoplast fusion): kỹ thuật hoà vào thành tế bào mang thông tin dung hợp, thể dung hợp có khả nãng tái hình Điện di (Electrophoresis): phương pháp để phân hợp tế bào giống có chung làm cho hai hay nhiều tế bào trần di truyền tế bào tham gia thành vỏ phát triển tiếp tục tách phân tử tích điện (các mảnh ADN; Protein; Axit amin; ) từ hỗn hợp cho chúng di chuyển điện trường gel (agarose; polyacrylamid; ) Tốc độ di chuyển tiểu phần gel phụ thuộc vào kích thước độ tích điện chúng Escherichia Coli (E coli): loại vi khuẩn đường ruột người động vật có xương sống Các chủng yếu vi khuẩn (nhược chủng) thường dùng làm tế bào chủ nhiều thí nghiệm cơng nghệ gen Gen: dãy nucleotid có chiều dài định nằm chuỗi ADN mã hoá cho phân tử protein mạch polypeptit tương ứng cho tính trạng sinh vật (hiểu theo nghĩa rộng) Mỗi gen có vị trí xác định nhiễm sắc thể gọi locus Genom học (genomic): ngành khoa học nghiên cứu cấu trúc chức gen Giao tử (gamete): tế bào sinh sản đơn bội (đực hay cái) kết hợp để tạo hợp tử lưỡng bội trình sinh sản hữu tính Hệ protein học (Proteomics): Lĩnh vực nghiên cứu tồn hệ protein gen mã hố điều khiển sinh tổng hợp giai đoạn phát triển, trạng thái sinh lý, bệnh lý sinh vật nhằm làm sáng tỏ chức sinh học hệ gen, chất trình sống trước mắt làm sở cho biện pháp chẩn đốn, phịng trừ điều trị y học Hợp tử (zygote): sản phẩm kết hợp giao tử đực giao tử tạo nên tế bào lưỡng bội Tế bào tiếp tục phân bào ngun nhiễm phát triển thành phơi Interferon: nhóm protein chứa từ 146-166 axit amin sản sinh tế bào động vật có xương sống bị nhiễm virus giúp tế bào kháng lại virus In vitro: Trong ống nghiệm, thể sống In vivo: Trong trạng thái tự nhiên, tế bào hay thể Isozym: Nhóm enzym xúc tác cho phản ứng có cấu trúc khác nên có phân bố khác gel điện di Kháng nguyên (Antigen): chất (thường protein hay gluxit) xâm nhập vào thể người hay động vật bậc cao kích thích sản sinh kháng thể Kháng thể phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên xâm nhập 15 Kháng thể (Antibody): protein (Immunoglobulin) hệ thống miễn dịch người hay động vật bậc cao sản sinh phản ứng trả lời có mặt kháng nguyên đặc hiệu Kết phản ứng làm bất hoạt kháng nguyên Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): tập hợp phân tử kháng thể đồng mặt cấu trúc tính chất tạo dịng tế bào lai tế bào ung thư myeloma với tế bào lympho hệ miễn dịch động vật người Kháng thể đơn địng có độ đặc hiệu cao với kháng nguyên tương ứng Kilô-bazơ (kilobase-kb): 1000 cặp bazơ bazơ, đơn vị xác định kích thước phân tử, đoạn ADN ARN Kỹ thuật di truyền (genetic ingeneering): hệ thống phương pháp cho phép thao tác (tách chiết, cắt, nối, nhân dòng, xác định trình tự, chuyển nạp ) vật chất mang thong tin di truyền (ADN va ARN) sinh vật khác Kỹ thuật xem kỹ thuật then chốt cơng nghệ sinh học đại Có nhiều thuật ngữ khác dùng để chung khái niệm như: thao tác gen (gene manipulation), công nghệ gen (gene technology), kỹ thuật gen (gene ingeneering), công nghệ di truyền (genetic technology), công nghệ ADN tái tổ hợp (Recombinant DNA technology), k¥ thuat sinh hoc (bioingeneering) Ở Trung quốc khái niệm gọi công học di truyền, Cộng hồ liên bang Nga gọi cơng nghệ gen, Liên hợp quốc sử dụng thuật ngữ: “công nghệ sinh học dai” Kỹ thuật vô trùng (aseptic technique): Cách ngăn ngừa nhiễm nấm, khuẩn mô tế bào nuôi cấy điều kiện in viiro Lần cấy chuyển (passage number): Số lần chuyển tế bào hay mô từ môi trường cũ sang môi trường mới, dựa vào tính tuổi hệ số tăng trưởng chúng Lai ADN (DNA hybridization): Quá trình lắp ghép hai chuỗi bổ sung ADN ADN với ARN để hình thành phân tử chuỗi kép Kỹ thuật dùng để phát tương đồng mặt cấu trúc vật chất mang thông tin di truyền Ligaza (ligase): Các enzym xúc tác hình thành liên kết đồng hố trị đầu tự phân tử ADN nhằm nối đoạn ADN với Trong công nghệ gen ligaza xem “hồ dán phân tử” : Mau cay (explant): M6 thực vật vừa tách để tién hanh nudi cay in vitro Mô sẹo (callus): Khối mô thực vật bao gồm tế bào không phân hố, có khả phân chia liên tục Ni cấy callus kỹ thuật cho phép biến đổi mô thực vật nuôi cấy thành mô sẹo từ mơ sẹo tái sinh hồn chỉnh làm ngun liệu ni cấy huyền phù tế bào Mô phân sinh chồi (shoot apical meristem): Phân mô gồm tế bào phân sinh tạo thành đỉnh lồi cao khoảng 0,1 mm nằm đỉnh chồi.' Nhân giống in viro (in vitro propagation) - gọi vi nhân giống (micropropagation): Nhân giống thực vật thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào 158 Nuôi cấy huyền phù (suspension culture): Kỹ thuật nuôi tế bao don (single cells) hoac cum nho té bao (cell aggregate) môi trường lỏng Phan ứng chuỗi tổng hợp ADN nhờ polymeraza (Polymerase chain reaction - PCR): phương pháp nhân đoạn ADN đặc thù ống nghiệm với tốc độ cực lớn độ xác cao (hàng triệu vài giờ) Phương pháp Kary Mullis (Mỹ) phát minh năm 1984 nhận giải thưởng Nobel 1993 Phân hố (differentiation): Q trình chuyển tế bào phơi sinh (chưa chun hố) thành tế bào chun hố có chức hình thái cụ thể để tạo loại mô, quan thể hoàn chỉnh Plasmid: phân tử ADN có cấu trúc dạng vịng kép, kích thước nhỏ, có khả tự nhân độc lập với nhiễm sắc thể Nó tồn tế bào chất sinh vật nhân sơ nhân chuẩn, thường thiết kế lại để sử dụng rộng rãi làm vectơ nhân dịng ADN Phát sinh hình thái (morphogenesis): Q trình hình thành quan cấu trúc tương tự quan thực vật (chồi, rễ, hoa, ) nuôi cấy mô tế bào mô sẹo Sinh học phân tử (molecular biology): khoa học sinh học nghiên cứu mức độ phân tử (gen chế hoạt động chúng) Sinh vật nhân sơ (prokaryote): sinh vật có vật chất di truyền nằm tự tế bào chất, chưa hình thành nhân Sinh vật nhân sơ chủ yếu vi khuẩn vi khuẩn lam Sinh vật nhân chuẩn (eukaryote): sinh vật có nhân tế bào điển hình Sinh vật nhân chuẩn gồm động vật, thực vật, vi nấm Tách dòng gen (gene cloning) - Còn gọi nhân dịng gen (Thuật ngữ dùng cơng nghệ ADN): trình nhân đoạn ADN, bao gồm bước: ghép đoạn ADN cần nhân vào vectơ nhân dòng tạo ADN tái tổ hợp, chuyển nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân với trình nhân tế bào Kết thu đòng tế bào mà dòng mang loại ADN tái tổ hợp đoạn ADN cần nhân tách nhân thành vô số , š Tai sinh (regeneration): Hién tugng mo va té bao nuéi cay in vitro phan phan hod tao callus tiếp tục phân hố thành cấu trúc (phơi, mầm chỏi, rễ hoàn chỉnh) Tế bào gốc (stem cell): tế bào có khả phân chia liên tục nuôi cấy phát triển thành tế bào chuyên hoá Tế bào trần (protoplast): Khái niệm dùng chủ yếu cho tế bào thực vật; tế bào bị làm toàn lớp vỏ bao bọc (cell wall) lại khối nguyệt sinh chất bao bọc màng nguyên sinh Vectơ tách dịng (cloning vector): phân tử ADN có khả tự nhân độc lập tế bào vật chủ Chúng thiết kế có vùng có thé cat dé gắn với đoạn ADN khác nguồn tạo nên ADN tái tổ hợp vùng mang gen thị để chọn lọc chúng có mặt tế bào chủ 159 TAI LIEU THAM KHAO Animal cloning, www.rds- online.org/hspva/academic/science/thinkquest/gail/text/benefits.html Babiuk L.A., J P Phillips, M Moo-Young, Press, 1989 Animal Biotechnology, Pergamon Đái Duy Ban, “Tổng luận phân tích Động vật chuyển øen - hướng công nghệ cao công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp y học”, Trung tâm thông tin tư liệu - Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia, 1998 Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân, Công nghệ gen công nghệ sinh học ứng dụng _ nông nghiệp đại Nhà xuất Nông nghiệp, 1994 Bộ Khoa học công nghệ môi trường, Dự thảo quy chế quản lý an toàn loài sinh vật biến đổi gen, loài lạ sản phẩm từ nó, 1999, Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật cơng tác cải tiến giống trồng (giáo trình cao học), Nhà xuất Nông nghiệp, 1997 Bộ Khoa học công nghệ môi trường, Dự thảo quy chế tạm thời an toàn sinh học Việt Nam, 1998 Bộ Khoa học công nghệ môi trường, Dự thảo quy chế quản lý an toàn loài sinh vật biến đổi gen sản phẩm chúng, 2003 Bodemer, Phôi sinh học đại (Dịch từ tiếng Nga), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 1978 10 Bruce 11: Clive James, Global status of Commercialized crops: ISAAA Briefs, Preview, 2003 12 Albert, Dennis Watson, Molecular London, 1994 Bray, Julian Biology Lewis, Martin Raff, Keith of the Cell, Garland Publishing, Roberts, James Inc New D York - Cloning &stem cells home page www.srtp.org.ul/cloning.html 15; Nguyễn Lân Dũng, Công nghệ sinh học hôm qua hôm ngày mai, Tài liệu cá 14 Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn, Zani Federico Nấm ăn, sở khoa học công nghệ nuôi trồng, Nhà xuất Nông nghiệp, 2003 15 Embryo and genetic micromanipulation, Proceeding of the 2nd Asian symposium on Animal Biotechnology Nanjing China November 11-14, 1996 16 Gamborg O.L., G.C Phillips, Plant cell, tissue and organ culture - Fundamental methods (Eds), Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995 ii George 160 ' nhân, 1997 E.F., edition, 1993 Plant propagation by tissue culture Exegetics Limited, second 18 Gerhard Wenzel, Biotechnology in Agriculture - an Overview- Biotechnology, Vol 19 Hans Giinter Gassen, Klaus Minlol, Gentechnik, 1996 20 Hans 21 Quản Lệ Hà, Ngô Minh Ngọc, Phân lập tuyển chọn ching vi sinh vật đối kháng 22 Nguyễn Mộng Hùng, Tế bào gốc, Tạp chí Những vấn để sinh học ngày nay, T.8 N.1 27)/2002 Nguyễn Mộng Hùng, Công nghệ phôi tế bào động vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia, 2004 23 6b VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1988 1995 Henning Steibiss, Transgene Pflanzen, Spektrum bảo quản cam, Báo cáo hội nghị công nghệ 17/12/2003, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 2003 Akademischer Verlag, sinh học toàn quốc, 16- 24 http://www.biotech.ubc 293 Hughes Monica A., Plant molecular genetics, 1996 26 Irina A Arkhipchenko, Microbial fertilizers from pig farm wastes, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, St.Petersburg-Pushkin, RUSSIA, 1998 ahs Kasornchandra J, S Boonyaratpalin, T.Itami, Detection of White spot syndrom in culture penaeid shrimp in ASIA: Microscopic observation ADN PCR, Aquaculture 164, 1998 28 Kempken R Kempken, Gentechnik bei Pflanzen, Springer, 2000 25: Kim CK, PK Kim, DS Sim, M A Park, M S Heo, T H Lee, J D Lee, H K Jun, K L Jang, Development of a polymerase chain reaction (PCR) procedure for the detection of baculovirut associated with White spot syndrom baculovirut in penaeid shrimp, JouARNI of fish diseases 21, 1998 30 Libbert E., Lehrbuch der Pflanzenphysiologie VEB Gustav Fischer Verlag Jena, oh Định Đoàn Long, Kỹ thuật chuyển gen ứng dụng chọn giống thực 1987 vật, Tài liệu cá nhân, 2005 Tks Lê Đình Lương, Nguyên lý kỹ thuật di truyền Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 33 Lê Đình Lương, Nguyễn Bá, Thái Trần Bái, Bùi Đình Hội, Trần Kiên, Lê Quang 2001 Long, Nguyễn Đình Quyến, Từ điển sinh học phổ thông, Nhà xuất Giáo dục, 2001 34 Max Planck-insttut fur Ziictungsforschung, 33 - Planck-Institut Max Biotechnologie, 1992 fur Zuchtungsforschung, - Biotechnologie, 1992 Pflanezenproduktion und Planzenproduktion und 161 36 Microbial and organic fertilizers in Asia, www fftc.agnet.org/library/article/ac1994.html Nghị định thư Cartagena an toàn sinh học đính kèm cơng ước da dạng sinh học 38 39 (toàn văn phụ lục) Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống trồng (bản thảo) Lê Văn Nhương, Nguyễn Lân Dũng, Công nghệ sinh học - hội cho tất Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, 1992 40 Paul Taylor, 4I 42 Pieric K M, In vitro culture of higher plants, 1997 43 Primrose S.B “Molecular Biotechnology”, Blackwell scientific publication, second 44 Production 45 Robert N Trigiano, Dennis J Gray, Plant tissue culture concept and laboratory exercises, second edition, 2000 46 47 48 Eddie Pang, Huyen Phan, Orarat Mong Kolporn the University of Melbourne Australia, Aplication of Molecular marker to Crop Production, Advances in Plant Breeding Methodologies Tài liệu tập huấn, 12/1998 Plant biotechnology including tissue culture Development Programe, New York, 1989 and cell culture, United Nations edition, 1991 of microbial granulated fertilizer www.greenworld.org.ru/eng/publ/sust/udobr.htm Schenkel, Johanes, Transgene Tiere/Johannes Oxford; Spektrum, Akad Verl, 1995 from Schenkel livestock - Heidelberg;’ wastes, Berlin; Stephen Yarrow, Environmental assessment of the products of plant biotechnology, Canadian Food Inspection Agency Khuất Hữu Thanh, Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 2003 49 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Bài giảng Công nghệ sinh học thực vật, Đại học Nông nghiệp I, Hà nội, 1997 50 Nguyễn Quang Thạch, Nghiên cứu thử nghiệm tiếp thu công nghệ EM (vi sinh vật hữu hiệu) lĩnh vực nông nghiệp vệ sinh môi trường (Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp Nhà nước 1997 - 2000) Sl 52 Phạm Văn Thành, Công nghệ sản xuất khí sinh học kỹ thuật xây dựng hầm biogas VACVINA, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 2002 Nguyễn Hương Trà, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thuỳ Châu, Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic sinh chất diệt khuẩn sinh học bacteriocin Báo cáo hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, 16-17/12/2003 Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 2003 162 53 Phạm Văn Toản, Nghiên cứu áp dụng giải pháp công nghệ nhằm mở rộng Việc sản xuất ứng dụng phân bón ví sinh vật cố định nitơ phân giải lan nông lâm nghiệp (Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.06) Hà Nội, 12/1998 34 Phạm Văn Toản, Kết nghiên cứu ứng dụng phân bón vi sinh vật nông nghiệp Tài liệu cá nhân, 2004 5S Trung Tâm trí thức tồn cầu cơng nghệ sinh học trồng: Pocket K NO 1, NO 56 Ulmer, Biotechnologic der Pflanzen Dieter Hess, 1992 57 Nguyễn Văn Uyển, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Nhà xuất Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 1996 Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng, Những kiến thức vẻ công nghệ sinh học, Nhà xuất Giáo dục, 1996, Định Thương Vân, Sử dụng kỹ thuật RealTime-PCR với SYBR green để xác định 58 59 60 2, N0 3, N0 4, N0 5, N0 6, N0 7, NO http://www.isaaa.Org định lượng virut YHV gây nhiễm bệnh tôm, Tài liệu cá nhân, 2004 Nguyễn Kim Vũ, Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng phân vi sinh vật cố định nitơ nhằm nâng cao suất lúa trồng cạn (Báo cáo tổng kết để tài khoa học cấp Nhà nước KC-08-01), Hà Nội, 12/1995 61 -Wakayma T., I Rodriguez, A.C.F Perry, R Yanagimachi, P Mombaerts, Mice - cloned from embryonic stem cells, PNAS, Vol 96, Issue 26, December 21, 1999 62 Watson J.D., Michael Gilman, Jan Witkowski, Mark Zoller, Recombinant ADN, second edition, Scientific American Books distributed by W.H Free man ADN company, New York, 1992 63 Werner Odenbh (Hrsg), Buchverlag Berlin, 1997 Biologische Grundlagen der Pflanzenziichtung, Parey Chịu trách nhiệm xuất NGUYỄN CAO DOANH Biên tập sửa chữa in BÍCH HOA - HỒI ANH Trình bày, bìa LÊ THƯ NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 167/6 - Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội Tel : 04.5763470 - 04.8523887 Fax : 04.5760748 CHI NHÁNH NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 58 Nguyễn Bỉnh Khiêm - Quận - Tp Hồ Chí Minh Tel : 08.8297157 - 08.8299521 Fax : 08.9101036 In 715 bản, khổ 19 x 27cm Công ty cổ phần in Phúc Yên Giấy chứng nhận đăng ký kế hoạch xuất sơ: 199/622 XB - QLXB Cục Xuất cấp ngày 29 tháng năm 2005 In xong nộp lưu chiểu quý III/2005 164 Giá: 29.000 đ