Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới NGS để phân tích gen HBB ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β thalassemia

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Ngơ Kim Ngân ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS) ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Ngô Kim Ngân ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS) ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DƯƠNG QUỐC CHÍNH TS TRẦN ĐỨC LONG Hà Nội – 2020 Lời cảm ơn Để thực thành cơng khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Dương Quốc Chính, Trưởng khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương với Tiến sĩ Trần Đức Long người hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian em thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Lê Anh, Thạc sĩ Trần Tuấn Anh toàn thể nhân viên khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương giúp đỡ chia sẻ kiến thức chuyên môn, thường xuyên động viên tinh thần giúp em vững tin suốt trình thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu Em xin cảm ơn Bộ mơn Di truyền học, Phịng sau đại học, Phịng cơng tác trị Học sinh - Sinh viên tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ Xin cảm ơn dự án “Nghiên cứu sản xuất chip sinh học DNA microarray để chẩn đoán số bệnh người” mã số 01/2017/CNC_HDKHCN công ty BIMEDTECH hỗ trợ thực nghiên cứu Cuối em xin gửi lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết động viên, bên cạnh em thời gian em thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2020 Sinh viên Ngô Kim Ngân BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ ý nghĩa Viết tắt bp DNA Cluster Base pair Deoxyribonucleic Acid Cụm khuếch đại DNA khuôn gắn bề mặt flowcell Mỗi cụm khuếch đại từ sợi DNA khuôn ban đầu có khoảng 1000 Mỗi cluster tạo trình tự đọc HbA Hemoglobin A HbA2 Hemoglobin A2 HbE Hemoglobin E HbF Hemoglobin F Index Là trình tự DNA tag gắn vào trình tự đích, cho phép kết hợp nhiều mẫu bể thư viện phân tách liệu sau hoàn thành lần chạy kb kilobase = 1000 bp MCH Mean Cell Hemoglobin: lượng hemoglobin trung bình hồng cầu MCV Mean Corpuscular Volume: thể tích trung bình hồng cầu PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế giới MỤC LỤC Chương 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 Đại cương β-thalassemia .2 1.1.1 Đặc điểm chế sinh bệnh Thalassemia 1.1.2 Đặc điểm phân loại bệnh β-thalassemia .3 1.1.3 Dịch tễ học bệnh β-thalassemia .5 1.1.4 Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia 1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia 11 1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia 13 1.2.1 Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) 13 1.2.2 Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay) 15 1.2.3 Giải trình tự 16 1.3 Hệ thống giải trình tự hệ Illumina - MiSeq .20 1.3.1 Lịch sử phát triển 20 1.3.2 Nguyên tắc hoạt động 21 1.4 Các nghiên cứu đột biến gây bệnh β-thalassemia Việt Nam 24 1.4.1 Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR 24 1.4.2 Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử 25 Chương 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 Đối tượng, hóa chất thiết bị 28 2.1.1 Đối tượng .28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Trình tự mồi sử dụng .29 2.1.4 Thiết bị 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.2.2 Quy trình thí nghiệm .30 Chương 3.1 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .37 Kết tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB hệ thống NGS 37 i 3.1.1 Thiết kế mồi tối ưu phản ứng PCR 37 3.1.2 Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu 40 3.2 Kết phân tích đột biến gen HBB mẫu nghiên cứu 42 3.2.1 Thông tin lần chạy máy MiSeq 42 3.2.2 Kết phân tích đột biến gen HBB .42 3.2.3 Kết phân tích đột biến gen HBB kiểm chứng lại phương pháp giải trình tự gen Sanger 46 3.2.4 Giá trị số sàng lọc nghiên cứu 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB a PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU b ii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc gen HBB, vị trí mức độ nghiêm trọng đột biến gây bệnh β-thalassemia [7] .7 Hình 2: Tên vị trí gen HBB đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp Việt Nam Hình 3: Mơ tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon [48] 11 Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16] 12 Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR 14 Hình 6: Quy trình giải trình tự hệ Illumina 21 Hình 7: Thơng tin lần chạy phần mềm Sequencing Analysis Viewer .23 Hình 8: Kết phân tích đột biến Miseq Reporter 24 Hình 9: Kết phân tích đột biến phần mềm IGV 24 Hình 10: Sơ đồ nghiên cứu .30 Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB chưa tối ưu .31 Hình 12: Kết blast cặp mồi HBB NCBI 37 Hình 13: Kết điện di sản phầm PCR trước tối ưu gel agarose 1,5% 38 Hình 14: Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi điện di gel agarose 1.5% 38 Hình 15: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB sau tối ưu 39 Hình 16: Kết điện di sản phẩm sau tối ưu gel agarose 1,5% 39 Hình 17: Kết chất lượng giải trình tự NGS gen HBB trước tối ưu 40 Hình 18: Kết chất lượng giải trình tự NGS gen HBB sau tối ưu 41 Hình 19: Kết giải trình tự NGS mẫu đột biến codon 26 45 Hình 20: Kết so sánh đột biến codon 26(G→T) codon 26 (G→A) với 46 Hình 21: Kết kiểm chứng phương pháp giải trình tự Sanger 47 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Đặc điểm thể bệnh β–thalassemia [3], [31] Bảng 2: Đặc điểm thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31] Bảng 3: Trình tự mồi HBB 29 Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen HBB .31 Bảng 5: Kết phân tích đột biến gen HBB 42 Bảng 6: Tỷ lệ loại đột biến phổ biến Việt Nam .43 Bảng 7: Tỷ lệ dạng đột biến HbE .43 Bảng 8: Tỷ lệ dạng đột biến gặp Việt Nam 44 Bảng 9: Kết giải trình tự NGS Sanger 47 Bảng 10: Tỷ lệ phát đột biến MCH MCV .49 Bảng 11: Tỷ lệ phát đột biến số Hb 49 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Beta thalassemia (β-thalassemia) bệnh thiếu máu, tan máu di truyền gây giảm tổng hợp hoàn toàn chuỗi β-globin, thành phần hemoglobin gen HBB nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 quy định Ở Việt Nam, nguyên nhân hàng đầu gây tình trạng thiếu máu, tan máu nặng trẻ em Người mắc bệnh β-thalassemia thể nặng đòi hỏi phải điều trị truyền hồng cầu thay suốt đời thải sắt định kỳ Việc điều trị tốn lâu dài, gánh nặng lớn cho gia đình, xã hội làm tăng chi tiêu ngân sách nhà nước cho lĩnh vực y tế Đến nay, giới phát 200 đột biến gây bệnh β-thalassemia [11], [17], [43] Vì vậy, cần có chương trình tầm sốt bệnh β-thalassemia cộng đồng nhằm hạn chế phổ biến gen bệnh, việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định xác loại đột biến kiểu gen bệnh Giải trình tự gen coi tiêu chuẩn vàng việc phát nhiều đột biến Next-Generation Sequencing (NGS) phương pháp giải trình tự hệ có ưu hiệu suất, cho phép phát nhiều đột biến lúc dần trở thành công cụ chẩn đoán thường quy [21] Năm 2011, hãng Illumina đưa thị trường hệ thống giải trình tự hệ – MiSeq sử dụng nhiều phòng xét nghiệm sinh học phân tử với ưu điểm cho phép phân tích mẫu lần chạy, giảm giá thành, thuận lợi cho xét nghiệm Vì vậy, để tăng cường hiệu việc chẩn đốn bệnh β-thalassemia chúng tơi thực đề tài “Ứng dụng phương pháp giải trình tự hệ (NGS) để phân tích gen HBB người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh βthalassemia” Đề tài thực khoa Di truyền Sinh học phân tử - Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương với mục tiêu: Tối ưu quy trình “ứng dụng phương pháp giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing – NGS) để phân tích gen HBB” Ứng dụng quy trình NGS để phân tích đột biến gen HBB số người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-thalassemia Chương 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cương β-thalassemia 1.1.1 Đặc điểm chế sinh bệnh Thalassemia Thalassemia nhóm bệnh tan máu di truyền, xảy đột biến gen quy định việc sản xuất hemoglobin – thành phần hồng cầu, đảm nhiệm việc vận chuyển oxy thể Cấu trúc phân tử Hb bình thường bao gồm chuỗi α-globin liên kết với chuỗi β-globin (α2β2) bốn nhân Hem, phân tử có khả vận chuyển bốn phân tử oxy Bệnh thalassemia gây cân tổng hợp chuỗi α-globin chuỗi β-globin Nguyên nhân rối loạn trình tổng hợp hai chuỗi dẫn đến gây thiếu hụt loại chuỗi thừa lượng chuỗi lại làm thay đổi tỷ lệ phân tử huyết sắc tố dẫn đến tình trạng bệnh lý Số lượng chuỗi globin thừa trùng hợp tạo nên thể vùi huyết sắc tố Những thể vùi khơng có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuống màng hồng cầu nguyên sinh chất hồng cầu Với hồng cầu máu ngoại vi, thể vùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo màng với gia tăng diện tích tiếp xúc, dễ bị phá hủy tác nhân oxi hóa, từ dẫn đến hồng cầu bị vỡ sớm gây nên tượng tan máu Còn tủy xương, thể vùi gắn lên nguyên sinh chất màng hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh hồng cầu non tủy xương làm cho xương bị biến dạng, tăng hấp thụ sắt gây nhiễm sắt cho thể [13], [14] Thalassemia bệnh di truyền phổ biến giới với ước tính khoảng 7% dân số mang gen bệnh [31] Theo thống kê, nước ta, ước tính có khoảng 12 triệu người mang gen bệnh (chiếm khoảng 12% dân số Việt Nam), năm có 8.000 trẻ sinh bị bệnh, có 2.000 trẻ mắc bệnh mức độ nặng cần điều trị đời 20.000 bệnh nhân cần điều trị theo loại gen bị ảnh hưởng mà phân biệt thành bệnh alpha thalassemia (α-thalassemia) beta thalassemia (β-thalassemia) [52] Hình 20: Kết so sánh đột biến codon 26(G→T) codon 26 (G→A) với sở liệu HbVar Trong trình tự phát thấy có đột biến SNP (khoanh đỏ hình 19) nằm codon 26 Đột biến codon 26 (G→A) thuộc exon 1, làm thay đổi acid amin Glutamate thành Lysin, tham khảo HbVar, đột biến tạo biến thể Hemoglobin E (hình 20) Ngồi mẫu phát thêm đột biến codon 26 (G→T), làm biến đổi GAG (Glutamate) thành TAG (stop codon), làm dừng dịch mã codon 26, tham khảo HbVar loại đột biến β0thalassemia Ở thể HbE, với kiểu gen dị hợp tử gây thiếu máu nhẹ, kiểu gen đồng hợp tử rối loạn lành tính Tuy nhiên trường HbE kết hợp với thể β0-thalassemia gây tượng thiếu máu nặng bệnh nhân [31] 3.2.3 Kết phân tích đột biến gen HBB kiểm chứng lại phương pháp giải trình tự gen Sanger Để đánh giá độ tương đồng kết thực hệ thống giải trình tự hệ phương pháp điện di mao quản truyền thống, chọn bảy mẫu DNA để thực đồng thời giải trình tự Sanger máy điện di mao quản ABI-3500 hãng Applied Biosystem Bảy mẫu thực thu kết hồn tồn có tương đồng kết thu (Bảng Hình 21) 46 Bảng 9: Kết giải trình tự NGS Sanger Tên mẫu KQ giải trình tự NGS KQ giải trình tự Sanger -28 (A→G) -28 (A→G) 15 -29 (A→G) -29 (A→G) 19 -30 (T→C) -30 (T→C) 31 Codon 26 (G→T); Codon 26 (G→T) 41 IVS-I-1 (G→T) IVS-I-1 (G→T) 60 IVS-II-848 (C→G) IVS-II-848 (C→G) 64 Codon 15 (G→A) Codon 15 (G→A) Hình 21: Kết kiểm chứng phương pháp giải trình tự Sanger (a): đột biến codon 26(G→T); (b): đột biến -30 (T→C) 47 Trong phương pháp giải trình tự Sanger, việc gọi tên nucleotide dựa vào cường độ đỉnh sáng (peak) phát điện di, sau máy so dịng đỉnh tương ứng với phân tích thành trình tự đoạn DNA Còn phương pháp NGS, chu kì nucleotide đọc thơng qua tín hiệu huỳnh quang gắn nucleotide bổ sung Sự khác biệt quan trọng thay giải trình tự đoạn DNA đơn lẻ, có trình tự ngắn NGS nâng cấp lên thành thực hàng triệu đoạn đọc thời điểm với độ xác cao, liệu đầu lớn khả đọc nucleotide đạt Qscore 30 (tức 1000 nucleotide khả gọi tên sai nucleotide) Thơng qua hệ thống phần mềm phân tích, sai khác rõ với tần suất xuất tương ứng để người phân tích phát Bên cạnh đó, giải trình tự nhiều mẫu Sanger việc phân tích kết giải trình tự thủ công tốn nhiều thời gian Với NGS, liệu đưa phân tích phần mềm chuyên dụng hãng cho phép phân tích đồng thời hàng trăm mẫu với thông số như: vị trí biến đổi, tên biến đổi, tần suất… từ rút ngắn thời gian phân tích cho kết đáng tin cậy 3.2.4 Giá trị số sàng lọc nghiên cứu 3.2.4.1 Giá trị số MCH MCV Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi dựa vào hai số MCV < 80 fl cho biết hồng cầu nhỏ MCH < 27 pg cho biết hồng cầu nhược sắc Trong nghiên cứu sử dụng 69/75 mẫu có số MCV < 80 fl, có 43 trường hợp phát đột biến (chiếm 58.6%) Tỷ lệ phát đột biến nhóm đối tượng có MCH 80fl, MCH > 27 pg 16.7% 25% (Bảng 10) Điều phù hợp với sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [15] 48 Bảng 10: Tỷ lệ phát đột biến MCH MCV Đặc điểm Số mẫu Số mẫu phát đột biến % phát đột biến MCV < 80fl 69 42 60,8 MCH < 27pg 71 43 58,6 MCH < 27pg MCV < 80fl 69 42 60,8 MCV > 80fl 16,7 MCH > 27pg 25 3.2.4.2 Giá trị thành phần Hb Trong xét nghiệm điện di huyết sắc tố, tỷ kệ HbA2 > 4% HbF > 2% chẩn đốn β-thalassemia Trong nghiên cứu chúng tơi có 35/75 mẫu có HbA2 > 4% có 30/37 mẫu phát đột biến chiếm 85.7%, 39/75 mẫu có HbF > 1% có 18/39 mẫu phát đột biến chiếm 46.1% 11 mẫu có xuất HbE kết điện di huyết sắc tố phát đột biến (Bảng 11) Bảng 11: Tỷ lệ phát đột biến số Hb Đặc điểm Số mẫu Số mẫu phát đột biến % phát đột biến HbA2 > 4% 35 30 85,7 HbF > 1% 39 18 46,1 Có xuất HbE 11 11 100 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu q trình nghiên cứu chúng tơi có số kết luận sau: Đã tối ưu thành cơng quy trình “ứng dụng phương pháp giải trình tự hệ (NGS) để phân tích gen HBB” Sử dụng quy trình tối ưu, chúng tơi phân tích 75 mẫu nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-thalassemia phát 44 mẫu (chiếm 58,6%) mang 10 loại đột biến loại đột biến phổ biến loại đột biến gặp Việt Nam Phát tỷ lệ âm tính giả kỹ thuật multiplex PCR loại đột biến phổ biến Việt Nam 4,68% KIẾN NGHỊ Với kết thu việc tối ưu phương pháp giải trình tự NGS để phân tích gen HBB áp dụng thành công 75 mẫu bệnh phẩm Chúng đề xuất số hướng nghiên cứu sau: Ứng dụng quy trình tối ưu để phân tích gen HBB người nghi ngờ mắc β-thalassemia Viện Huyết học - Truyền máu trung ương sở y tế khác có nhiều người nghi ngờ mắc bệnh, hỗ trợ cho chẩn đoán điều trị β-thalassemia Ứng dụng quy trình thiết lập để phân tích gen HBB người nghi ngờ mắc beta thalassemia để phát loại đột biến tỉ lệ đột biến người Việt Nam 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Khắc Hân Hoan, Quách Thị Hồng Oanh, Phạm Việt Thanh & Trương Đình Kiệt, (2008),"Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh beta thalassemia Bệnh viện Từ Dũ", Y học Thành phố Hồ Chí Minh, tập 12 (phụ số 1) pp tr.341347 Lê Thị Thu Hà, (2017), Phát đột biến gen Beta globin kỹ thuật ARMS-PCR lai điểm ngược (Reverse dot blot) Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội, Luận văn thạc sĩ Nguyễn Khắc Hân Hoan, (2013), Nghiên cứu tầm soát chẩn đoán trước sinh bệnh alpha bêta thalassemia, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Luận án Tiến sĩ y học Nguyễn Thị Thu Hà, (2017), Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin theo dõi điều trị thải sắt bệnh nhân thalassemia Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương giai đoạn 2013 - 2016, Đại học Y Hà Nội, Luận án Tiến sĩ Y học Trần Thị Thuý Minh, (2015), Tỷ lệ mắc kiểu hình gen bệnh alpha beta thalassemia trẻ em dân tộc Ê đê M’nông tỉnh Đắk Lắk, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Luận án Tiến sĩ Y học Trần Vân Khánh, Phạm Thanh Loan, Hồ Cẩm Tú, Trần Thị Oanh, Nguyễn Đức Hinh, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, (2014),"Phát đột biến gen gây bệnh beta thalassemia kỹ thuật multiplex ARMS-PCR", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 90 (5) pp.17-25 Tiếng Anh Birgens Henrik and Ljung Rolf, (2007),"The thalassaemia syndromes", Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation, 67 (1), pp.11-26 BORGNA‐PIGNATTI Caterina, Cappellini M.D., De Stefano P., Del Vecchio G.C., Forni G.L., Gamberini M.R., Ghilardi R., Origa R., Piga A and Romeo M.A., (2005),"Survival and complications in thalassemia", Annals of the New York Academy of Sciences, 1054 (1), pp.40-47 Buermans HPJ and Den Dunnen JT, (2014),"Next generation sequencing technology: advances and applications", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)Molecular Basis of Disease, 1842 (10), pp.1932-1941 10 Bulger Michael, Bender MA, Van Doorninck J Hikke, Wertman Brett, Farrell Catherine M, Felsenfeld Gary, Groudine Mark and Hardison Ross, (2000),"Comparative structural and functional analysis of the olfactory receptor genes flanking the human and mouse β-globin gene clusters", Proceedings of the National Academy of Sciences, 97 (26), pp.14560-14565 11 Cai Liuhong, Bai Hao, Mahairaki Vasiliki, Gao Yongxing, He Chaoxia, Wen Yanfei, Jin You‐Chuan, Wang You, Pan Rachel L and Qasba Armaan, (2018),"A universal approach to correct various HBB gene mutations in human stem cells for gene therapy of beta‐thalassemia and sickle cell disease", Stem cells translational medicine, (1), pp.87-97 51 12 Cai SP, Zhang JZ, Doherty M and Kan YW, (1989),"A new TAT3A box mutation detected at prenatal diagnosis for beta-thalassemia", American journal of human genetics, 45 (1), pp.112 13 Capellini M., Cohen A., Eleftheriou A., Piga A., Porter J and Taher A., (2008),"Guidelines for the clinical management of thalassemia", Thalassaemia International Federation (TIF) April 2000, 14 Cappellini Maria-Domenica, Cohen A., Porter J., Taher A and Viprakasit V., (2014), Guidelines for the management of transfusion dependent thalassaemia (TDT), Thalassaemia International Federation Nicosia, Cyprus, 15 Chang Judy C and Kan Yuet Wai, (1979),"beta thalassemia, a nonsense mutation in man", Proceedings of the National Academy of Sciences, 76 (6), pp.2886-2889 16 Colah Roshan, Gorakshakar Ajit and Nadkarni Anita, (2010),"Global burden, distribution and prevention of β-thalassemias and hemoglobin E disorders", Expert review of hematology, (1), pp.103-117 17 Edison Eunice S, Venkatesan Rajkumar S, Govindanattar Sankari Devi, George Biju and Shaji Ramachandran V, (2012),"A novel 26 bp deletion [HBB: c 20_45del26bp] in exon of the β-globin gene causing β-thalassemia major", Hemoglobin, 36 (1), pp.98-102 18 Efstratiadis Argiris, Posakony James W, Maniatis Tom, Lawn Richard M, O'Connell Catherine, Spritz Richard A, Deriel Jon K, Forget Bernard G, Weissman Sherman M and Slightom Jerry L, (1980),"The structure and evolution of the human β-globin gene family", Cell, 21 (3), pp.653-668 19 Fucharoen Goonnapa, Fucharoen Supan, Jetsrisuparb Arunee and Fukumaki Yasuyuki, (1990),"Molecular basis of HbE-β-thalassemia and the origin of HbE in northeast Thailand: Identification of one novel mutation using amplified DNA from buffy coat specimens", Biochemical and biophysical research communications, 170 (2), pp.698-704 20 Galanello Renzo and Origa Raffaella, (2010),"Beta-thalassemia", Orphanet journal of rare diseases, (1), pp.11 21 Goodwin Sara, McPherson John D and McCombie W Richard, (2016),"Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies", Nature Reviews Genetics, 17 (6), pp.333 22 Gray GR, Manson HE, Gu L‐H, Ye Leonova J and Huisman THJ, (1995),"Hb lulu island (α2β2107 [G9] Gly→ Asp)‐β°‐thalassemia (codon 15; TGG→ TAG), a form of thalassemia intermedia", American journal of hematology, 50 (1), pp.26-29 23 Grosso M., Sessa R., Puzone S., Storino M R and Izzo P., (2012),"Molecular basis of Thalassemia", Anemia, 24 Grosveld Frank, van Assendelft Greet Blom, Greaves David R and Kollias George, (1987),"Position-independent, high-level expression of the human β-globin gene in transgenic mice", Cell, 51 (6), pp.975-985 52 25 Hattori Y, Yamamoto Ku, Yamashiro Y, Ohba Y, Miyamura S, Yamamoto Ki, Matsuno Y, Morishita M, Miyaji T and Era T, (1992),"Three β-Thalassemia Mutations in the Japanese: IVS-II-1 (G→ A) IVS-II-848 (C→ G), and Cooon 90 (GAG→ TAG)", Hemoglobin, 16 (1-2), pp.93-97 26 Heather James M and Chain Benjamin, (2016),"The sequence of sequencers: the history of sequencing DNA", Genomics, 107 (1), pp.1-8 27 Illumina, (2014),"MiSeq® System User Guide", 28 illumina, (2012),"Nextera®XT DNA Sample Preparation Guide", 29 Illumina, An introduction to Next-Generation Sequencing Technology", 30 Illumina, (2016),"Nextera®XT DNA Library Prep Reference Guide", V01 31 Kohne Elisabeth, (2011),"Hemoglobinopathies: clinical manifestations, diagnosis, and treatment", Deutsches Ärzteblatt International, 108 (31-32), pp.532 32 Li Dongzhi, Liao Can, Li Jian, Huang Yining, Xie Xingmei, Wei Jiaxue and Wu Shaoqing, (2006),"Prenatal diagnosis of β-thalassemia by reverse dot-blot hybridization in southern China", Hemoglobin, 30 (3), pp.365-370 33 Little Stephen, (1995),"Amplification‐refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations", Current protocols in human genetics, (1), pp.9.8 19.8 12 34 Liu Lin, Li Yinhu, Li Siliang, Hu Ni, He Yimin, Pong Ray, Lin Danni, Lu Lihua and Law Maggie, (2012),"Comparison of next-generation sequencing systems", BioMed Research International, 2012 35 Maxam Allan M and Gilbert Walter, (1977),"A new method for sequencing DNA", Proceedings of the National Academy of Sciences, 74 (2), pp.560-564 36 Olivieri Nancy F, (1999),"The β-thalassemias", New England journal of medicine, 341 (2), pp.99-109 37 Passarge Eberhard, (1995), Color atlas of genetics, Georg Thieme Verlag, 38 PK Menon, Nimmakayalu M, Bylappa SK, Kumar M and Abdalhaleem HM, A comparison of in-house Hemoglobin DNA Mutation analysis for β thalassemia by ARMS PCR with a Commercial Line Probe Assay", President’s Message, pp.79 39 Punia P and Saunders NA, (2009),"The Quantitative amplification refractory mutation system", Real-time PCR: current technology and applications Norfolk (VA): Horizon Scientific Press, Inc, 40 Sanger Frederick, Nicklen Steven and Coulson Alan R, (1977),"DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", Proceedings of the national academy of sciences, 74 (12), pp.5463-5467 41 Sgourou Argyro, Routledge Samantha, Antoniou Michael, Papachatzopoulou Adamantia, Psiouri Lambrini and Athanassiadou Aglaia, (2004),"Thalassaemia mutations within the 5′ UTR of the human β‐globin gene disrupt transcription", British journal of haematology, 124 (6), pp.828-835 42 Steensma David P, (2006),"JAK2 V617F in myeloid disorders: molecular diagnostic techniques and their clinical utility: a paper from the 2005 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology", The Journal of Molecular Diagnostics, (4), pp.397-411 53 43 Svasti ML Saovaros, Hieu Tran Minh, Munkongdee Thongperm, Winichagoon Pranee, Van Be Tran, Van Binh Tran and Fucharoen Suthat, (2002),"Molecular analysis of β‐thalassemia in South Vietnam", American journal of hematology, 71 (2), pp.85-88 44 Teimourian Shahram, Khatibi Talayeh, Pourfarzad Farzin, Jalil-Nejad Sayeh and Azad Maryam, (2001),"Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and reverse hybridization in the detection of beta-thalassemia mutations", Archives of Iranian Medicine, (4), pp.165 45 Thein Swee Lay, (2013),"The molecular basis of β-thalassemia", Cold Spring Harbor perspectives in medicine, (5), pp.a011700 46 Thein Swee Lay, (2004),"Genetic insights into the clinical diversity of β thalassaemia", British journal of haematology, 124 (3), pp.264-274 47 Treisman Richard, Orkin Stuart H and Maniatis Tom, (1983),"Specific transcription and RNA splicing defects in five cloned β-thalassaemia genes", Nature, 302 (5909), pp.591 48 Winichagoon Pranee, Fucharoen Suthat, Wilairat Prapon, Chihara Kazuo, Fukumaki Yasuyuki and Wasi Prawase, (1992),"Identification of five rare mutations including a novel frameshift mutation causing β0-thalassemia in Thai patients with β0-thalassemia/hemoglobin E disease", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 1139 (4), pp.280-286 49 Wolcott Mark J, (1992),"Advances in nucleic acid-based detection methods", Clinical microbiology reviews, (4), pp.370-386 50 Nguyễn Công Khanh (2008) Thalassemia-Huyết học lâm sàng Nhi khoa Xuất lần Nhà xuất Y học: 132-146 51 Galanello R, Eleftheriou A, Old J.,Petrou M, Angastinictis M (2005) Prevention of Thalassemia and other Hemoglobin Disorders Thalassemia International Federation Publications V 1: 10 52 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Lý Tuyết Minh cs (1987) Sự lưu hành bệnh huyết sắc tố số người dân tộc miền bắc Y học Việt Nam, 4: 9-15 53 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực (1993) Β-thalassemia hemoglobin E Viện Bảo vệ Sức khỏa Trẻ em: Y học Việt Nam 174 (8): 23-30 54 Nguyễn Cơng Khanh (2008) Hemoglobin bình thường phân loại bệnh hemoglobin Huyết học lâm sàng Nhi khoa, XB lần 2, NXB Y học: 124-132 55 Weatherall DJ, Clegg JB (2001) The Thalassemia syndromes Oxford Blackwell Science: 191 56 Brown JM, Thein SL, Mar KM, Weatherall DJ (1989) The spectrum of βthalassemia in Burma Hemoglobin Switching: 161-169 57 Laig M, Sanguasermesri T, Wiangnon S (1989) The spectrum of βthalassemia mutation in Northern Thailand Human Genetics 84:47-50 58 Kenvin TM, Arthur WN (1993) The Thalassemia In : Nathan DG., Oski FA (eds) Hematology of Infancy and Childhood, 4th ed Saunders Company : 785-805 59 Modell B (2008) Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators Public health reviews Bulletin of WHO: 480-487 54 PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB Ghi chú: Kết điện di 75 mẫu nghiên cứu khuếch đại gen HBB quy trình PCR tối ưu; 1-75: kí hiệu mẫu; M: marker 1kb (ThermoFisher) PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU STT TỔNG PHÂN TÍCH TẾ BÀO MÁU ĐIỆN DI HUYẾT SẮC TỐ GIẢI TRÌNH TỰ NGS MCV (fL) MCH (pg) HbA1 (%) HbA2 (%) 72.2 23.2 80.7 4.7 14.60 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 72.0 23.0 71.3 4.1 24.60 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 68.7 20.6 90.1 2.7 7.10 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 92.2 27.8 97.8 2.2 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 82.2 27.5 96.4 3.6 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 73.0 22.8 92.8 4.8 79.9 26.0 95.7 4.3 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 76.4 23.2 95.4 4.6 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 62.3 18.2 62.5 2.6 34.90 Hb Hope Dị hợp tử 10 66.8 20.3 2.7 3.2 94.10 Hb Hope Đồng hợp tử 11 78.9 25.0 81.3 2.0 16.70 12 86.4 27.2 56.3 2.8 40.90 Hb Hope Dị hợp tử 13 72.6 22.8 39.8 42.00 Hb E Dị hợp tử 14 82.4 25.4 72.6 3.1 24.30 15 77.7 24.1 91.5 4.9 3.60 16 73.0 24.8 76.6 3.3 20.10 HbE (%) HbF (%) 2.40 18.2 Tên đột biến -28 (A->G) Kiểu gen Dị hợp tử KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN -29 (A→G) Dị hợp tử KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN Codons 41/42 (-TTCT); TTCTTT(Phe-Phe) 17 64.4 19.2 94.9 5.1 18 73.8 23.3 78.2 3.0 19 73.1 23.6 96.0 4.0 -30 (T→C) Dị hợp tử 20 78.4 24.8 95.7 4.3 -30 (T→C) Dị hợp tử 21 82.3 26.2 95.7 4.3 -30 (T→C) Dị hợp tử 22 65.0 19.3 95.0 5.0 Codon 26 (G->T); GAG(Glu)>TAG(stop codon) Dị hợp tử 23 55.1 13.2 11.8 0.8 Hb E Dị hợp tử 24 58.5 16.2 95.1 4.9 Codon 26 (G→T); GAG(Glu→TAG(stop codon) Dị hợp tử 25 62.5 17.4 95.5 4.5 Codon 26 (G→T); GAG(Glu) →TAG(stop codon) Dị hợp tử 26 69.1 18.9 90.6 5.2 Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Dị hợp tử HbE Dị hợp tử Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Dị hợp tử Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Dị hợp tử 27 55.1 12.4 12.0 28 58.7 16.2 94.4 18.80 65.0 4.20 62.8 5.6 22.40 25.20 Dị hợp tử KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 62.3 16.8 5.9 0.7 30 64.1 17.8 95.6 4.4 31 60.4 17.8 95.8 4.2 32 75.7 22.8 68.9 1.7 33 78.2 24.6 59.6 3.3 34 66.7 19.5 95.7 4.3 35 69.5 20.5 95.5 4.5 36 59.0 17.9 95.1 4.9 37 59.7 17.2 97.6 2.4 38 61.7 18.5 94.4 5.6 39 59.4 17.2 95.1 4.9 40 70.0 20.7 95.2 4.8 41 71.6 21.9 92.3 4.5 42 63.2 19.4 94.9 5.1 29 41.8 51.60 26.5 HbE Dị hợp tử Codon 26 (G→T); Dị hợp tử GAG(Glu)→TAG(stop codon) Codon 26 (G→T); Dị hợp tử GAG(Glu)→TAG(stop codon) Codon 26 (G→T); Dị hợp tử GAG(Glu)→TAG(stop codon) KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN Hb E Dị hợp tử Codon 26 (G→T); Dị hợp tử GAG(Glu)→TAG(stop codon) Codon 26 (G→T); Dị hợp tử GAG(Glu)→TAG(stop codon) Codon 26 (G→T); Dị hợp tử GAG(Glu)→TAG(stop codon) KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 3.20 Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) IVS-I-1 (G→T); AG^GTTGGT→AGTTTGGT Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 43 81.4 27.1 97.4 2.6 44 66.0 19.6 95.0 5.0 Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Dị hợp tử 45 73.3 21.4 95.1 4.9 Codon 26 (G→T); GAG(Glu)→TAG(stop codon) Dị hợp tử 46 70.2 16.3 79.9 11.6 2.50 Hb E Dị hợp tử 47 68.6 16.9 71.0 10.7 7.90 Hb E Dị hợp tử 48 77.1 24.8 75.7 1.8 22.50 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 49 71.7 22.3 82.5 2.2 15.30 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 50 71.0 23.3 85.6 1.9 12.50 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 51 76.4 23.6 82.7 2.3 15.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 52 65.2 21.6 6.7 53 73.5 23.0 84.1 1.9 14.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 54 70.0 21.1 87.5 2.1 10.40 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 55 71.6 22.3 87.1 2.5 10.40 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 56 70.4 21.4 83.5 2.1 14.40 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 57 64.8 20.5 6.2 58 71.3 22.2 81.8 59 69.8 22.6 6.8 60 58.1 17.2 95.6 45.7 47.2 2.4 46.60 15.80 52.2 4.4 47.60 41.00 Hb E Hb E Đồng hợp tử Đồng hợp tử KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN Hb E Đồng hợp tử IVS-II-848 (C→G); beta+ Dị hợp tử KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 61 67.9 18.5 95.0 5.0 62 78.0 23.6 78.4 3.6 18.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 63 71.6 21.8 84.5 1.8 13.70 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 64 64.3 19.7 95.1 4.9 Codon 15 (G→A); TGG(Trp) →TAG(stop codon) Dị hợp tử 65 69.0 19.4 95.6 4.4 Codon 15 (G→A); TGG(Trp) →TAG(stop codon) beta0 Dị hợp tử 66 66.7 19.0 91.9 5.5 Codon 15 (G→A); TGG(Trp) →TAG(stop codon) beta0 Dị hợp tử 67 63.3 17.8 95.1 4.9 Codon 15 (G→A); TGG(Trp)>TAG(stop codon) beta0 Dị hợp tử 68 65.1 19.7 95.5 4.5 Codon 15 (G→A); TGG(Trp) →TAG(stop codon) beta0 Dị hợp tử 69 75.7 23.7 79.2 1.7 70 56.3 17.1 95.2 4.8 71 77.6 25.0 5.7 72 74.2 23.2 78.2 1.8 20.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 73 75.2 24.6 86.1 2.1 11.80 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 74 79.8 24.7 75.2 1.1 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 75 72.9 22.8 79.0 0.9 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 2.60 19.10 42.7 51.60 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN Codon 15 (G→A); TGG(Trp) →TAG(stop codon) beta0 Dị hợp tử Hb E Đồng hợp tử ... Sequencing – NGS) để phân tích gen HBB? ?? Ứng dụng quy trình NGS để phân tích đột biến gen HBB số người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β- thalassemia Chương 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cương β- thalassemia. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Ngơ Kim Ngân ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS) ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH β- THALASSEMIA Chuyên ngành:... xét nghi? ??m Vì vậy, để tăng cường hiệu việc chẩn đốn bệnh β- thalassemia chúng tơi thực đề tài ? ?Ứng dụng phương pháp giải trình tự hệ (NGS) để phân tích gen HBB người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh