Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VI SINH VẬT TẠO CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC TỪ DỊCH LÊN MEN PHỤ PHẨM RAU QUẢ Người hướng dẫn: TS ĐẶNG ĐỨC LONG Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ HỒNG NGỌC Số thẻ sinh viên: 107120262 Lớp: 12SH Đà Nẵng, 5/2017 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ HỒNG NGỌC Mã số sinh viên: 107120262 - Lớp: 12SH Tóm tắt: Các chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) hợp chất lưỡng cực có hoạt tính bề mặt vi sinh vật tạo đường lên men CHĐBMSH trì hoạt tính thay đổi nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl điều kiện khắc nghiệt Hơn CHĐBMSH cịn có khả tự phân hủy, khơng gây độc sản xuất nguồn chất phế thải nông nghiệp, công nghiệp chế biến để sản xuất với quy mô lớn Chính ưu điểm vượt trội nêu mà CHĐBMSH ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực sống như: Y học, nông nghiệp, cơng nghiệp, dược phẩm xử lí mơi trường Trong nghiên cứu tiến hành phân lập hai chủng nấm men có khả tạo CHĐBMSH từ dịch lên men phụ phẩm rau quả, đồng thời nhân giống hai chủng nấm men tiến hành lên men lại với chất giống ban đầu cách bổ sung hai chủng nấm men phân lập Những kết cho thấy vi sinh vật thu có khả sử dụng phụ phẩm rau việc sản xuất quy mô công nghiệp CHĐBMSH Từ khóa: chất hoạt hóa bề mặt sinh học, vi khuẩn, nấm men, phụ phẩm thực vật, khuẩn lạc Abstract: Biosurfactants are surface-active dipole compounds produced by microorganisms by fermentation Biosurfactants can maintain activity when changing temperature, pH, NaCl concentration, under extreme conditions Furthermore, biosurfactants is self-decomposable, non-toxic and can be produced on the basis of agricultural and processing industrial wastes for large-scale production Because of the above advantages, biosurfactants have been applied in many fields such as medicine, agriculture, industry, medicine and environmental treatment In this study, I have isolated two yeast strains capable of producing biosurfactants, propagated those two yeast strains and fermented vegetable by-products to produce biosurfactants using the seed cultures of these strains These results suggest that the obtained microorganisms can be a source for the production of biosurfactants in an industrial scale Key words: biosurfactants; bacteria; yeast; plant by-products; colony ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: HỒ THỊ HỒNG NGỌC Lớp:12SH Khoa: HĨA Số thẻ sinh viên: 107120262 Ngành: Cơng nghệ sinh học Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả” Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu Cam đoan Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình ảnh Danh sách ký hiệu chữ viết tắt Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Giáo viên hướng dẫn: TS Đặng Đức Long Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 10/02/2017 Ngày hoàn thành đồ án: 26/05/2017 Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Đà Nẵng, ngày 25 tháng 05 năm 2017 Người hướng dẫn TS LÊ LÝ THÙY TRÂM TS ĐẶNG ĐỨC LONG Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau LỜI CẢM ƠN Với khoảng thời gian năm học trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng thân em tích lũy nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu đặc biệt em trưởng thành nhiều Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giúp đỡ tất thầy cô công tác trường đại học Bách Khoa Đà Nẵng, thầy khoa Hóa, đặc biệt thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học tận tình giúp đỡ, tận tâm dạy dỗ em suốt thời gian ngồi ghế giảng đường khơng kiến thức mà cịn cách sống đối nhân xử Những kiến thức vô giá theo em suốt đời, giúp ích em nhiều tương lai phía trước Sau tháng thực nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả”, đến em hoàn thành đề tài Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Đức Long, người tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Cảm ơn Thầy chủ nhiệm T.S Bùi Xn Đơng sư tận tâm tận tụy thầy dìu dắt em suốt năm qua, dạy cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới KS.Võ Công Tuấn Ths.Phạm Thị Kim Thảo chun viên phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, người giúp đỡ em nhiều suốt thời gian thực nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm, thầy cô bạn sinh viên lớp 12SH Bộ môn Công nghệ Sinh học tạo điều kiện, giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Vì lần đầu làm đồ án nghiên cứu nên khơng tránh khỏi sai sót, em mong thầy góp ý để đồ án tốt nghiệp em hoàn thiện hơn, em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2017 Hồ Thị Hồng Ngọc SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang i Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn Ts Đặng Đức Long Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên thực Hồ Thị Hồng Ngọc SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang ii Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau MỤC LỤC TÓM TẮT NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT .vi Trang MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung phụ phẩm thực vật Giới thiệu chất hoạt động bề mặt chất hoạt động bề mặt sinh học 1.2.1 Chất hoạt động bề mặt 1.2.2 Chất hoạt động bề mặt sinh học ( Biosurfactant) Tình hình nghiên cứu 15 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Đà Nẵng 15 vật liệu phương pháp nghiên cứu .18 Tên đề tài, thời gian địa điểm tiến hành .18 2.1.1 Tên đề tài .18 2.1.2 Địa điểm 18 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 18 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ thiết bị thí nghiệm, hóa chất 18 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị q trình thí nghiệm .19 2.2.3 Hóa chất .20 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phân lập vi khuẩn tạo chất hoạt động bề mặt sinh học môi trường thạch thịt Pepton .22 2.3.2 Phân lập nấm men tạo chất hoạt động bề mặt sinh học môi trường Hansen22 2.3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn nấm men kính hiển vi 22 2.3.4 Thử hoạt tính tạo chất hoạt động bề mặt sinh học chủng vi sinh vật phân lập phương pháp ”drop collasape test” 27 SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang iii Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau 2.3.5 Nhân giống hai chủng nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 28 2.3.6 Theo dõi đường cong sinh trưởng nấm men 29 2.3.7 Tiến hành lên men chất có bổ sung hai chủng nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phân lập 30 2.3.8 Phương pháp xử lí số liệu .30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật phân lập từ dịch lên men phụ phẩm thực vật 31 Kết kiểm tra hoạt tính tạo chất hoạt động bề mặt sinh học chủng vi sinh vật phân lập 33 Kết nhân giống hai chủng nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học .34 Kết theo dõi đường cong sinh trưởng hai chủng nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 35 3.4.1 Chủng nấm men 35 3.4.2 Chủng nấm men 37 Kết tiến hành lên men phụ phẩm rau có bổ sung hai chủng nấm men phân lập 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .42 PHỤ LỤC PHỤC LỤC PHỤ LỤC SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang iv Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào kính hiển vi chủng vi sinh vật phân lập 31 Hình 1.1 Phụ phẩm rau chợ Hình 1.2 Các lĩnh vực ứng dụng chất hoạt động bề mặt sinh học [44] 13 Hình 1.3 Sản phẩm nước rửa chén sinh học Đà Nẵng 16 Hình 2.1 Dịch lên men phụ phẩm rau 19 Hình 2.2 Tiêu vi sinh vật 23 Hình 2.3 Cách làm tiêu giọt treo .24 Hình 2.4 Một số hình thái vi khuẩn .25 Hình 2.5 Ngun lí nhuộm Gram 26 Hình 2.6 Cơ chế bắt màu gram .26 Hình 2.7 Quy trình nhân giống nấm men .28 Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng vi khuẩn .31 Hình 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng vi khuẩn .32 Hình 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào nấm men .32 Hình 3.4 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng nấm men 32 Hình 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng nấm men 33 Hình 3.6 Kết kiểm tra khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học chủng vi sinh vật phân lập 33 Hình 3.7 Chủng nấm men nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 34 Hình 3.8 Ống giống gốc chủng nấm men chủng nấm men 34 Hình 3.9 Nhân giống hai chủng nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 35 Hình 3.10 Đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610 chủng nấm men .36 Hình 3.11 Đường cong tăng trưởng chủng nấm men 36 Hình 3.12 Đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610nm chủng nấm men 37 Hình 3.13 Đường cong tăng trưởng chủng nấm men 38 Hình 3.14 Sản phẩm lên men có bổ sung chủng nấm men 39 Hình 3.15 Sản phẩm lên men có bổ sung chủng nấm men 39 Hình 3.16 Dụng cụ hóa chất dùng cho phép thử phá vỡ giọt .40 Hình 3.17 Kết phép thử phá vỡ giọt 40 SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang v Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT CHĐBMSH: Chất hoạt động bề mặt sinh học CHĐBMHH: Chất hoạt động bề mặt hóa học CHĐBM: Chất hoạt động bề mặt VK: vi khuẩn NM: nấm men SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang vi MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Hiện ô nhiễm môi trường vấn đề đặc biệt ý quan tâm nhà khoa học nước mà cịn nước ngồi Hàng ngày lượng chất thải hữu thải lớn, tận dụng lượng chất thải để tạo sản phẩm có hoạt tính bề mặt sinh học thân thiện với môi trường đồng thời đảm bảo sức khỏe hạn chế việc sử dụng chất tẩy rửa hóa học gây hại đến mơi trường sức khỏe người Bên cạnh chất hoạt động bề mặt sinh học cịn có khả xử lý chất thải hữu cơ, thay sản phẩm tổng hợp từ hố chất khơng tái tạo (đa phần có nguồn gốc từ dầu mỏ), tạo sản phẩm không độc hại với người môi trường Ở Đà Nẵng có Trịnh Thị Hồng làm nước rửa chén sinh học từ phụ phẩm rau quả, nhiên phương pháp cịn mang tính thủ công, chưa theo sở khoa học chứng minh Chính lí mà tơi thực đề tài “Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt từ dịch lên men phụ phẩm rau quả” Mục đích đề tài nghiên cứu lần ta cần khắc phục tồn mà cô Minh Hồng làm sản phẩm tốt Thêm vào đó, ta phân lập chủng VSV tạo CHĐBMSH chủ động điều chỉnh thời gian lên men, cho sản phẩm tối ưu Sau phân lập chủng VSV ta tiến hành lên men lại chủng đem so sánh thời gian lên men chất lượng sản phẩm mẫu với 2.Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu 1: Phân lập chủng vi sinh vật có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học Mục tiêu 2: Nhân giống chủng vi sinh vật có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phân lập Mục tiêu 3: Dựng đường cong sinh trưởng chủng vi sinh vật có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phân lập Mục tiêu 4: Từ chủng vi sinh vật phân lập tiến hành lên men lại từ chất phụ phẩm rau có bổ sung chủng vi sinh vật để từ kiểm tra hoạt tính đem so sánh với mẫu khơng bổ sung vi sinh vật Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Dịch lên men từ phụ phẩm rau cụ thể dịch lên men vỏ bưởi loại rau bầm dập thu thập Chợ Hòa Khánh SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang [20] Cavalero DA, Cooper DG (2003) The effect of medium composition on the structure and physical state of sophorolipids produced by Candida bombicola ATCC 22214 Journal of Biotechnology, 103: 31-41 [21] Solaiman DKY, Ashby RD, Nun˜ez A, Foglia A (2004) Production of sophorolipids by Candida bombicola grown on soy molasses as substrate Biotechnology Letters, 26: 1241-1245 [22] Mata-sandoval JC, Karns J, Torrens A (2001) Effect of nutritional and environmental conditions on the production and composition of rhamnolipids by P aeruginosa UG2 Microbiology Research, 155: 249-256 [23] Johnson V, Singh M, Saini VS (1992) Bioemulsifier production by an oleaginous yeast Rhodotorulaglutinis IIP-30 Biotechnology Letters, 14: 487490 [24] Dubey K, Juwarkar A (2001) Distillery and curd whey wastes as viable alternative sources for biosurfactant production World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17: 61-69 [25] Amezcua-Vega CA, Varaldo PHM, Garcia F (2007) Effect of culture conditions on fatty acids composition of a biosurfactant produced by Candida ingens and changes of surface tension of culture media Bioresource Technology, 98: 237-240 [26] Kitamoto D, Ikegami T, Suzuki GT (2001) Microbial conversion of n-alkanes into glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by Pseudozyma (Candida antarctica) Biotechnology Letters, 23: 1709-14 [27] Zinjarde SS, Pant A (2002) Emulsifier from tropical marine yeast, Yarrowia lipolytica NCIM 3589 Journal of Basic Microbiology 42: 67-73 [28] Bednarski W, Adamczak M, Tomasik J (2004) Application of oil refinery waste in the biosynthesis of glycolipids by yeast Bioresource Technology, 95: 15-18 [29] Casas JA, Garcia-Ochoa F (1999) Sophorolipid production by Candida bombicola medium composition and culture methods Journal of Bioscience and Bioengineering, 88: 488-494 [30] Deshpande M, Daniels L (1995) Evaluation of sophorolipid biosurfactant production by Candida bombicola using animal fat Bioresource Technology, SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang 44 54: 143-150.68 [31] Kitamoto D, Ikegami T, Suzuki GT (2001) Microbial conversion of n-alkanes into glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by Pseudozyma (Candida antarctica) Biotechnology Letters, 23: 1709-14 [32] Thimon L, Peypoux F, Michel G (1992) Interaction of surfactin, a biosurfactant from Bacillus subtilis, with inorganic cations Biotechnology Letters, 14: 713-718 [33] Desai JD, Banat IM (1997) Microbial production of surfactants and their commercial potential, Microbiol Molecular Review 61: 47-64 [34] Guilmanov V, Ballistreri A, Impallomeni G (2002) Oxygen transfer rate and sophorose lipid production by Candida bombicola Biotechnology and Bioengineering, 77: 489-495 [35] Cameotra, S.S and Singh, P (2009) Synthesis of rhamnolipid biosurfactant and mode of hexadecane uptake by Pseudomonas species Microb Cell Factories, 8: 16 [36] Karanth, N.G.R., Deo, P.G and Veenading, N.K (1999) Microbial production of biosurfactants and their importance, Current Science on Line, 77: 116–126 [37] Mulligan, C.N (2005) Environmental applications for biosurfactants Environmental Polution, 133: 183–198 [38] Rosenberg, E., Rubinovitz, C., Legmann, R and Ron, E.Z (1987) Purification and chemical properties of Acinetobacter calcoaceticus A2 biodispersan Applied Environmental Microbiology, 54: 323–326 [39] Muthusamy, K., Gopalakrishnan, S., Ravi, T.K and Sivachidambaram, P.(2008) Biosurfactants: Properties, commercial production and application Current Science, 94: 736–747 [40] Biosurfactants Market Analysis By Product (Rhamnolipids, Sophorolipids, MES, APG, Sorbitan Esters, Sucrose Esters) And Segment Forecast To 2020 [41] Tugba Tugrul and Emir Cansunar (2005) Detecting surfactant- producing micoorganisms by the drop-collapse test World Jouranl of Microbiology anh Biotechnology (2005) 21: 851- 853 Tài liệu internet SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang 45 [42] https://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%E1%BA%A5t_ho%E1%BA%A1t_%C4%9 1%E1%BB%99ng_b%E1%BB%81_m%E1%BA%B7t(truy cập ngày 27/3/2017) [43] http://www.vinachem.com.vn/tin-tuc/so-72014vnc/thi_truong_toan_cau_cac_chat_hoat_dong_be_mat_sinh_hoc_ngay_cang_ phat_trien.html.( truy cập ngày 27/3/2017) [44] http://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/biosurfactants-industry (truy cập ngày 2/4/2017) [45] http://khoi.nghiep.vn/tin-tuc/khoi-nghiep-bien-rac-thai-thanh-nuoc-ruachen.html (truy cập ngày 20/03/2017) [46] https://vi.wikipedia.org/wiki/Nhu%E1%BB%99m_Gram (truy cập ngày 15/04/2017) SVTH: HỒ THỊ HỒNG NGỌC GVHD:T.S.ĐẶNG ĐỨC LONG Trang 46 PHỤ LỤC 1.1 Các bước phân lập vi khuẩn từ dịch lên men phụ phẩm rau Bước 1: Phân phối môi trường vào đĩa petri Đun chảy lỏng thạch, để nguội đến 50 -60 °C Mở giấy bọc hộp, đặt lên bàn phẳng Tay phải cầm bình ống môi trường chảy lỏng, giữ nghiên, dùng tay trái xoay rút nút ra, vô khuẩn miệng bình (miệng ống nghiệm) đèn cồn Dùng tay trái mở nắp hộp vừa phải nhanh tay rót vào hộp lượng mơi trường thích hợp Nhanh chóng đậy nắp hộp lại xoay tròn hộp từ từ bàn, để thạch dàn thành lớp đáy hộp Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên Hé mở nắp hộp để yên lúc thạch đặc lại hoàn toàn Đậy nắp hộp, lật ngược hộp cho đáy lên Cần ý thạch cho vào hộp đĩa Petri không làm vô khuẩn lại nữa, nên đổ phải làm nhanh, cẩn thận, đảm bảo khơng bị nhiễm khuẩn từ bên ngồi Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, phẳng, lớp thạch không dày mỏng (thường – mm) Bước 2: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Chuẩn bị ống nghiệm chứa 9ml nước muối vô trùng 0,85% (đã vơ trùng) Cân xác 1g mẫu đất cho vào ống fancol chứa sẵn ml dung dịch nước muối, vortex khoảng phút, để lắng – 10 phút, nồng độ mẫu 10-1, tiếp tục hút 1ml dịch pha loãng ống thứ cho vào ống thứ vortex để lắng ta nồng độ 10-2 , tiến hành lặp lại ta có nồng độ khác 10-4, 10-5, 10-6 Hình 1: Cách pha lỗng mẫu Phụ lục Bước 3: Nuôi cấy mẫu Hút 100 μl dịch pha loãng nồng độ 10-5, 10-6, phân phối vào đĩa Petri, nồng độ cấy lên đĩa (Trong thí nghiệm số lượng vi sinh vật mẫu lớn nên ta dùng độ pha loãng 10-5 10-6 số lượng khuẩn lạc phù hợp) Dùng que trang, trải dịch mẫu lên bề mặt môi trường nuôi cấy, đến thấy mặt thạch khơ dừng lại Ghi rõ nội dung sau lên đĩa petri trước gieo cấy: Tên môi trường, ngày gieo cấy, mức độ pha loãng Đặt hộp đĩa petri gieo cấy vi sinh vật vào tủ ấm ủ nhiệt độ 30°C, 24h Bước 4: Quan sát khuẩn lạc (KL), mô tả đặc điểm khuẩn lạc mọc đĩa thạch + Hình dạng: trịn, bầu dục hay khơng có hình dạng xác định + Kích thước: to, nhỏ cách đo đường kính khuẩn lạc + Bề mặt KL: nhẵn bóng hay xù xì, nhăn nheo, xếp loại S, R hay M Dạng S(smooth): KL xám nhạt trong, bờ đều, mặt lồi đều, bóng lõm Dạng R(rough): KL thường dẹt có bề mặt sần, bờ khơng đều, mặt gồ ghề, khơ Dạng M ((Mucous) KL đục, trịn, lồi khuẩn lạc S, quánh dính + Mép khuẩn lạc phẳng hay lỗi lõm, cưa + Độ KL: mền, cứng hay dai, có khả bám vào môi trường hay không Màu sắc khuẩn lạc mơi trường Hình 4: Một số hình thái khuẩn lạc thường gặp Bước 5: Làm Phụ lục Sử dụng que ria, nhặt khuẩn lạc riêng rẽ từ canh trường tập trung cấy ria sang canh trường khiết( môi trường thạch thịt Pepton) chuẩn bị cho vi khuẩn Đặt hộp đĩa gieo cấy vào tủ ấm 30°C nuôi Vi khuẩn 24h Quan sát đặc điểm khuẩn lạc môi trường 1.2 Các bước phân lập nấm men từ dịch lên men phụ phẩm rau Bước 1: Phân phối môi trường vào đĩa petri Đun chảy lỏng thạch, để nguội đến 50 -60 °C Mở giấy bọc hộp, đặt lên bàn phẳng Tay phải cầm bình ống mơi trường chảy lỏng, giữ nghiên, dùng tay trái xoay rút nút bơng ra, vơ khuẩn miệng bình (miệng ống nghiệm) đèn cồn Dùng tay trái mở nắp hộp vừa phải nhanh tay rót vào hộp lượng mơi trường thích hợp Nhanh chóng đậy nắp hộp lại xoay tròn hộp từ từ bàn, để thạch dàn thành lớp đáy hộp Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên Hé mở nắp hộp để yên lúc thạch đặc lại hoàn toàn Đậy nắp hộp, lật ngược hộp cho đáy lên Cần ý thạch cho vào hộp đĩa Petri không làm vô khuẩn lại nữa, nên đổ phải làm nhanh, cẩn thận, đảm bảo không bị nhiễm khuẩn từ bên Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, phẳng, lớp thạch không dày mỏng (thường – mm) Bước 2: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Chuẩn bị ống nghiệm chứa 9ml nước muối vô trùng 0,85% (đã vô trùng) Hút 1ml dịch lên men li tâm cho vào ống fancol chứa sẵn ml dung dịch nước muối, vortex khoảng phút, để lắng – 10 phút, nồng độ mẫu 10-1, tiếp tục hút 1ml dịch pha loãng ống thứ cho vào ống thứ vortex để lắng ta nồng độ 10-2 , tiến hành lặp lại ta có nồng độ khác 10-4, 10-5, 10-6 Bước 3: Nuôi cấy mẫu Hút 100 μl dịch pha loãng nồng độ 10-5, 10-6, phân phối vào đĩa Petri, nồng độ cấy lên đĩa (Trong thí nghiệm số lượng vi sinh vật mẫu lớn nên ta dùng độ pha loãng 10-5 10-6 để thu số khuẩn lạc phù hợp) Dùng que trang, trải dịch mẫu lên bề mặt môi trường nuôi cấy, đến thấy mặt thạch khơ dừng lại Ghi rõ nội dung sau lên đĩa petri trước gieo cấy: Tên mơi trường, ngày gieo cấy, mức độ pha lỗng Đặt hộp đĩa petri gieo cấy vi sinh vật vào tủ ấm ủ nhiệt độ 30°C, 48h Phụ lục Bước 4: Quan sát khuẩn lạc (KL), mô tả đặc điểm khuẩn lạc mọc đĩa thạch + Hình dạng: trịn, bầu dục hay khơng có hình dạng xác định + Kích thước: to, nhỏ cách đo đường kính khuẩn lạc + Bề mặt KL: nhẵn bóng hay xù xì, nhăn nheo, xếp loại S, R hay M Dạng S(smooth): KL xám nhạt trong, bờ đều, mặt lồi đều, bóng lõm Dạng R(rough): KL thường dẹt có bề mặt sần, bờ khơng đều, mặt gồ ghề, khơ Dạng M ((Mucous) KL đục, trịn, lồi khuẩn lạc S, quánh dính + Mép khuẩn lạc phẳng hay lỗi lõm, cưa + Độ KL: mền, cứng hay dai, có khả bám vào môi trường hay không Màu sắc khuẩn lạc môi trường Bước 5: Làm Sử dụng que ria, nhặt khuẩn lạc riêng rẽ từ canh trường tập trung cấy ria sang canh trường khiết( môi trường dinh dưỡng Hasen) chuẩn bị cho nấm men Đặt hộp đĩa gieo cấy vào tử ấm 30°C nuôi nấm men 48-72h Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nấm men môi trường 1.3 Làm tiêu tạm thời có nhuộm màu Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính Dùng que cấy pipet lấy cach trường vi sinh vật đặt lên phiến kính Với canh trường đặc cho trước lên phiến kính vài giọt nước muối sinh lí (0,5 – 0,85%) sau hịa canh trường vi sinh vật vào Lưu ý: lấy giọt canh trường vừa phải, không nhiều ( nhiều bị trào ngồi) q ( tiêu khơ hay tạo thành bọt khí gây khó khăn cho việc quan sát) Ép kính lên giọt canh trường: trước tiên để kính nghiên 60° cạnh phiến kính tiếp xúc với mép giọt canh trường cho canh trường chảy cạnh bề mặt tiếp xúc kính phiến kính Quan sát tiêu vật kính (x 10) (x 40) Đặt tiêu lên khay kính quan sát 1.4 Phương pháp nhuộm Gram Bước 1: Làm tiêu Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi (2 loại vi khuẩn phân lập được) phiến kính (ở vị trí hai đầu phiến kính) Dùng que cấy lấy chút khuẩn lạc chúng làm vết bôi theo thứ tự sau: Bên trái phiến kính chủng vi khuẩn 1(VK1) Bên phải phiến kính chủng vi khuẩn 2(VK2) Phụ lục Để khơ vết bơi khơng khí cố định nhẹ lửa đèn cồn Bước 2: Nhuộm tiêu Đặt miếng giấy lọc lên vết bơi Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc phút Nhuộm lugol phút Rửa nước Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu nhỏ từ từ giọt cồn tan hết màu Rửa nước Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ 10 - 30 giây Làm khơ soi tiêu với vật kính dầu 1.5 Quan sát hình thái nấm men Bước 1: Làm tiêu Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi (3 loại vi khuẩn phân lập được) phiến kính (ở vị trí hai đầu phiến kính) Dùng que cấy lấy chút khuẩn lạc chúng làm vết bôi theo thứ tự sau: Bên trái phiến kính chủng nấm men (NM1) Ở phiến kính chủng nấm men (NM2) Bên phải phiến kính chủng vi khuẩn (NM3) Để khơ vết bơi khơng khí cố định nhẹ lửa đèn cồn Bước 2: Quan sát kính hiển vi Đặt phiến kính vào vị trí tiến hành điều chỉnh quan sát vật kính 40 Lần lượt quan sát vị trí để biết hình dạng nấm men 1.6 Phép thử phá vỡ giọt Ở phép thử phá vỡ giọt, giọt huyền phù tế bào đặt bề mặt phủ dầu Các giọt chứa dung dịch có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phá vỡ giọt dầu để tạo vết loang, giọt khơng có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học ổn định Sử dụng microwell sau đánh số từ tới Trong giếng 1, 2, chứa ba mẫu nấm men Giếng 4, chứa hai mẫu vi khuẩn.Giếng số dung dịch rửa tay (thành phần có chứa natri lauroyl sulfate) Giếng số chứa dung dịch SDS (natri dodecyl sulfate) giếng số chứa nước cất Mẫu đến mẫu thử, mẫu 6,7 mẫu đối chứng dương, mẫu mẫu đối chứng âm Trong phép thử dầu đậu nành sử dụng để kiểm tra khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học Sử dụng microwell 96 giếng, giếng có đường kính 8mm chiều dày 0,30 mm Mỗi giếng phủ lớp dầu đậu nành μl để 24 nhiệt độ phịng Sau đó, 20 μl nước 20 μl dung dịch đối Phụ lục chứng thêm vào giếng ống micropippet theo góc nghiêng 450 Sau phút, tiến hành kiểm tra mắt Đầu côn phải rửa nước cất, ba lần với rượu ba lần với ete lần thí nghiệm Tất thí nghiệm lặp lại ba lần Sau ghi nhận kết Phụ lục PHỤC LỤC 2.1 Kết xác định mật độ tế bào huyền phù có OD610nm khác chủng nấm men OD610 0.135 0.234 0.355 0.466 0.540 Độ loãng pha 0.25:4 0.5:4 0.75:4 1:4 1.25:4 2.55x107 2.93x107 3.32x107 3.63x107 3.99x107 7.407 7.466 7.522 7.560 7.601 Mật độ tế bào (N/ml) Log (N/ml) 2.2 Kết theo dõi tăng trưởng giống theo thời gian nuôi cấy chủng nấm men Thời 7.38 7.423 12 15 18 21 24 8.012 9.797 10.213 10.401 10.478 gian (h) Log (N/ml) 7.539 7.663 2.3 Kết xác định mật độ tế bào huyền phù có OD610nm khác chủng nấm men OD610 0.195 0.244 0.305 0.434 0.52 Độ pha loãng 0.25:4 1:4 1.5:4 2.5:4 3:4 Mật độ tế bào (N/ml) 1.8x107 2x107 2.11x107 2.47x107 2.8x107 Log (N/ml) 7.255 7.301 7.324 7.393 7.447 Phụ lục 2.4 Kết theo dõi tăng trưởng giống theo thời gian nuôi cấy chủng nấm men Thời gian 12 15 18 21 24 Độ 4 10 15 15 15 7.246 7.396 7.431 7.822 9.267 10.22 10.821 10.872 pha loãng Mật độ tế 7.21 bào Phụ lục PHỤ LỤC 3: CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 3.1 Cân phân tích 3.2 Cân kỹ thuật Phụ lục 3.3 Máy đo pH 3.4 Bếp điện 3.5 Tủ lạnh 4oC Phụ lục 10 3.6 Máy lắc khô 3.7 Nồi hấp vô trùng 3.8 Máy đo quang phổ UV-Vis Phụ lục 11 3.9 Kính hiển vi điện tử 3.10 Tủ cấy Phụ lục 12 ... động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VI? ??T TẮT CHĐBMSH: Chất hoạt động bề mặt sinh học CHĐBMHH: Chất hoạt động bề mặt hóa học CHĐBM: Chất hoạt động bề mặt. .. vi sinh vật có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phân lập Mục tiêu 4: Từ chủng vi sinh vật phân lập tiến hành lên men lại từ chất phụ phẩm rau có bổ sung chủng vi sinh vật để từ kiểm tra hoạt. .. Đã phân lập hai chủng nấm men có khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau Đã tiến hành nhân giống hai chủng nấm mencó khả tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phân lập