Nghiên cứu phương pháp sản xuất và một số đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng hải sâm (holothuroidea) (tt)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ NGUYỄN THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ NỘI TẠNG HẢI SÂM (Holothuroidea) C C R UT.L D Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 8420201 TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng – Năm 2020 Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: T.S Tạ Ngọc Ly PGS.TS Đặng Minh Nhật Phản biện 1: PGS.TS Trần Thị Xô Phản biện 2: TS Bùi Xuân Đông C C R UT.L D Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Công nghệ Sinh học họp Trường Đại học Bách khoa vào ngày 16 tháng 12 năm 2020 Có thể tìm hiểu luận văn tại: − Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Trường Đại học Bách khoa − Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hải sâm loài hải sản có giá trị dinh dưỡng y học cao Ở Việt Nam, Hải sâm nhóm nguồn lợi quan trọng, có mức độ phong phú thành phần lồi, có nhiều lồi có giá trị thương mại cao (khoảng loài) khai thác với sản lượng lớn (trong năm 90) Ước chừng nội tạng Hải sâm chiếm 40% trọng lượng thể Nhiều thành phần nội tạng Hải sâm nghiên cứu phát EPA, DHA axit béo chiếm 13,09% 6,88% , loại axit amin thiết yếu chiếm 39,93% tổng axit amin toàn thể [1] Các quan nội tạng giàu khoáng chất C C R UT.L nguyên tố Mg, Fe, Zn, V, Se [1], lectin [2] [3] [4] Với hàm lượng chất dinh dưỡng, protein lớn vậy, nội tạng Hải sâm cần ứng dụng D nhiều vào lĩnh lực chế biến đồ hộp, sản xuất nước mắm, phân bón, ngồi cịn nghiên cứu cho lĩnh vực dược phẩm Sự đánh giá ngày cao Hải sâm thị trường châu Á, châu Âu công nhận nhà khoa học hàm lượng dinh dưỡng Hải sâm dẫn đến việc sức tiêu thụ Hải sâm ngày tăng giới, kéo theo lượng phụ phẩm Hải sâm bị thải bỏ tăng theo Chính vậy, việc chế biến, xử lý phụ phẩm Hải sâm nhằm thu protein có giá trị thương mại cao hơn, đồng thời tránh vấn đề môi trường mục tiêu quan tâm nghiên cứu Hiện nhu cầu thực phẩm chế biến sẵn ngày tăng cao toàn giới, nên protease đối tượng nghiên cứu rộng rãi lĩnh vực chúng có khả phân giải làm mềm thịt, tạo dịch đạm thủy phân giàu dinh dưỡng Do đó, việc thủy phân protease để thu hồi protein từ phụ phẩm Hải sâm cách tiếp cận hiệu nên ứng dụng rộng rãi Tuy nhiên chưa có cơng trình cơng bố việc nghiên cứu nội tạng Hải sâm để ứng dụng vào lĩnh vực cụ thể Do đó, nghiên cứu này, tơi tiến hành xác định điều kiện tối ưu hóa nội tạng Hải sâm, từ thu nhận dịch đạm thủy phân đánh giá hoạt tính sinh học chúng, nhằm góp phần giảm thiểu nhiễm mơi trường góp phần xử lý chất thải cách khoa học, giúp phát triển bền vững ngành khai thác, chế biến thủy - hải sản Mục đích nghiên cứu Đề tài hướng đến mục đích nghiên cứu chính: - Xác định động học phản ứng enzyme - Xác định thông số cơng nghệ sản xuất hồn thiện quy C C R UT.L trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm - Xác định số đặc tính dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm D Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài a Ý nghĩa khoa học - Thu quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm cách tối ưu - Từ đặc tính dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm, ứng dụng rộng rãi đối tượng khác lĩnh vực khác b Ý nghĩa thực tiễn Tận dụng nguồn nguyên liệu bỏ nội tạng Hải sâm để tạo nên sản phẩm thủy phân với hàm lượng dinh dưỡng cao, đồng thời góp phần giảm thiểu nhiễm môi trường, hướng đến việc khai thác chế biến Hải sâm bền vững CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hải sâm 1.1.1 Khái niệm phân bố C C R UT.L Hình 1.1 Hải sâm Hải sâm hay gọi dưa biển, sâm biển, đỉa biển, lồi động D vật khơng xương sống, thành viên lớp Holothuroidea, ngành động vật da gai với biển, nhím biển,… Thân có dạng ống dài dưa, phình thon nhỏ hai đầu với gai thịt nhỏ Phía trước miệng có vành tua rõ rệt, phía sau hậu mơn Dọc thân dãy chân ống Da mềm có phiến xương nằm rải rác da Hải sâm động vật phân tính, trừ số lồi thuộc Không chân (Apoda) Trứng thụ tinh phát triển thể mẹ Hải sâm coi loại thuốc bổ thận, bổ âm, tráng dương ích tinh, nhuận táo, chữa lị, chữa viêm phế quản, thần kinh suy nhược, cầm máu, thành phần lipit Hải sâm có tác dụng chữa xơ vữa động mạch, hen suyễn Hải sâm nhóm đa dạng phong phú, chúng phân bố khắp đại dương giới với khoảng 2500 loài thuộc 25 họ khác [6] Nghiên cứu năm 2009 rạn san hô Biển Đơng, Biển Sulu Biển Sulawesi tìm thấy 12 loài Hải sâm từ họ chi khác Họ chiếm ưu Holothurridae (5 loài), Stichopodidae (3 loài), Synaptidae (3 loài), Cucumarridae (1 loài) [8] Năm 1991, khảo sát phân bố loại Hải sâm điển hình Hải sâm đỏ vùng biển Đơng Nam Alaska cho thấy mật độ Hải sâm đếm tuyến trung bình 20,8 cá thể 1ha tầng trong; 70,9 cá thể tầng 103,7 cá thể tầng ngồi vịnh Có loại địa tầng bắt gặp Hải sâm bùn/cát, mảnh vụn, đá, vỏ sò, tường đá tảo Hải sâm thu thập thức ăn cách lấy thức ăn dạng hạt từ đáy biển cách nuốt lượng lớn chất chứa đầy dinh dưỡng mà chúng đào bới [11] 1.1.2 Vai trò, giá trị Hải sâm Hải sâm có chất dinh dưỡng quý Vitamin A, Vitamin C C R UT.L B1 (thiamine), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (niacin) khoáng chất, đặc biệt canxi, magiê, sắt kẽm [13] Thành thể D Hải sâm chứa nhiều collagen, sử dụng chất bổ sung dinh dưỡng cho trình tạo máu Protein Hải sâm giàu lysine, arginine tryptophan Ở Đông Á, Hải sâm từ lâu sử dụng loại thuốc truyền thống để điều trị hen suyễn, tăng huyết áp, thấp khớp, thiếu máu tắc nghẽn xoang [15] Chúng báo cáo có hiệu việc chữa lành vết thương bên khác [15] Hải sâm có khả ức chế hình thành gốc tự AAPH DPPH, mẫu có quan nội tạng có khả ức chế gốc oxy hóa cao so với mẫu khơng có nội tạng, cho thấy quan nội tạng có hoạt chống oxy hóa cao thành thể chúng [18] Trong hệ sinh thái, Hải sâm giữ vai trò quan trọng chúng động vật ăn lọc, ăn mùn bã mồi Trong khu rừng tảo bẹ rạn san hô, chúng tiêu thụ kết hợp vi khuẩn, tảo cát mùn bã hữu [19] [20] Chức chúng hệ thống treo lọc có giá trị đáng kể đáy biển Ngoài tầm quan trọng sinh thái, Hải sâm cịn có giá trị xã hội kinh tế to lớn cộng đồng dân cư ven biển Chẳng hạn, nghề khai thác Hải sâm nguồn thu nhập nhiều cộng đồng ven biển Quần đảo Solomon [29] cho 4000 – 5000 gia đình Sri Lanka [30] 1.1.3 Tình hình khai thác Hải sâm 1.1.3.1 Trên giới Vào năm 1990, tổng sản lượng đánh bắt Hải sâm thương mại toàn giới đạt mức 30.000 tấn/năm, chủ yếu nhu cầu ngày tăng thị trường Trung Quốc C C R UT.L Nghề khai thác Hải sâm mở rộng toàn giới sản lượng giá trị hai đến ba thập kỷ qua [40] [41] [42] Các khu D vực Ấn Độ - Thái Bình Dương thu hoạch khai thác năm để cung cấp cho thị trường châu Á, chủ yếu Trung Quốc [40] Tuy nhiên việc quản lý không đầy đủ nghề khai thác Hải sâm dẫn đến tình trạng đánh bắt nghiêm trọng nhiều quốc gia, nguồn dự trữ thiên nhiên bị cạn kiệt hầu hết nơi mà chúng phân bố Quần thể Hải sâm dễ bị đánh bắt q mức hai lý Đầu tiên, người đánh bắt dễ dàng thu hoạch Hải sâm vùng nước nông [43] [24] Thứ hai, tuổi trưởng thành chúng muộn, tăng trưởng chậm [43] [44], mật độ quần thể thấp, việc sinh sản chúng gây hiệu ứng Allee [45], dẫn đến suy thoái quần thể ức chế phục hồi [46] [44] Do yếu tố với việc đánh bắt mức làm suy giảm nghiêm trọng số lượng nhiều quần thể Hải sâm Ở Việt Nam 1.1.3.2 Ở Việt Nam, nghiên cứu đặc điểm phân bố Hải sâm Việt Nam cho thấy, vùng biển nước ta có khoảng 60 lồi Hải sâm, chủ yếu tập trung vùng biển Phú Yên, Khánh Hòa đảo xa bờ Phú Quốc, Thổ Chu, Trường Sa, Côn Đảo… với nhiều loại Hải sâm vú, Hải sâm mít, Hải sâm lựu, Hải sâm trắng, hải sâm đen, hải sâm gai [48] Hải sâm vú (Holothuria fuscogilva) Hải sâm lựu (Thelenota ananas) hai lồi có nguy bị tuyệt chủng Tại huyện Phú Quý (Bình Thuận) sản lượng khai thác khoảng năm 2012 khoảng 15 tấn/chuyến Sau sản lượng giảm dần qua năm Đến năm 2017, sản lượng cịn tấn/chuyến Qua đó, thấy nguồn lợi Hải sâm vú C C R UT.L Hải sâm lựu bị suy giảm nghiêm trọng Tương tự vùng biển Nha Trang, sản lượng khai thác Hải sâm suy giảm, cụ thể năm D 2012 sản lượng khai thác tấn/chuyến, sau giảm dần qua năm Đến năm 2017, sản lượng khai thác cịn tấn/chuyến Ngồi khai thác từ tự nhiên, Hải sâm nuôi thương phẩm theo mơ hình ni bãi, ni lồng, nuôi biển phổ biến tỉnh ven biển Vân Đồn – Quảng Ninh, Khánh Hòa, Vũng Tàu…, ước tính ni 1.000 ha; suất ni đạt 2,5 tấn/ha [50] 1.2 Tình hình nghiên cứu việc sử dụng chế phẩm nội tạng hải sản 1.2.1 Nghiên cứu giới Holanda and Netto (2006) nghiên cứu thu hồi thành phần phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin việc sử dụng enzyme alcalase pancreatin [56] Sản phẩm thủy phân protein nguồn peptit có hoạt tính sinh học mang đến tiềm đáng kể dược phẩm như: khả chống oxy hóa, khả kiểm sốt enzyme gây cao huyết áp [56] [57] [58], khả chống đột biến gen có khả gây ung thư [59] [60] Các thành phần chất lượng dinh dưỡng sản phẩm phụ chế biến (đầu, vỏ đuôi) tôm hồng Bắc tôm đốm đánh bắt gần Tongyeong, Hàn Quốc, Min Soo Heu (2003) khảo sát Hàm lượng protein thô nằm khoảng 9,31% tổng lượng chất béo xấp xỉ 0,7% Axit aspartic, axit glutamic, phenylalanine, lysine arginine axit amin chiếm ưu phần protein 1.2.2 Nghiên cứu nước Một nghiên cứu khác phụ phẩm cá Tra, kết hoạt độ chống oxy hóa dịch đạm thủy phân cho thấy nồng độ ức chế 50% DPPH (IC50) dịch đạm thủy phân đạt khoảng 6775 μg / mL cao C C R UT.L 1645 lần so với vitamin C cao 17 lần so với BHT ( Butylated Hydroxytoluene) với mức độ thủy phân (DH) dịch đạm D thủy phân 14,6% thời gian thủy phân 5h, tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) 30 U/g protein, nhiệt độ thủy phân 55 oC, pH 7,5 [69] Theo nghiên cứu Trần Kiều Anh (2017), dịch đạm thủy phân thu từ phụ phẩm hồi có hàm lượng acid amin đạt 29,48 mg/ml có hoạt tính chống xi hóa đo qua khả bắt gốc tự DPPH (SC) 70,34% [71] 1.3 Papain 1.3.1 Cấu tạo papain Papain dạng bột màu vàng nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không tan hầu hết chất hữu tan H2O hay glycerine Tâm hoạt động papain gồm có nhóm -SH cystein 25 nitrogen bậc histidine 159 Bên cạnh nhóm imidazole His 159 liên kết với Asp 175 liên kết hydrogen Vùng tâm hoạt động papain chứa mạch polypeptide với acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys [74] Hình 1.2 Cấu trúc 3D papain 1.3.2 C C R UT.L Hoạt tính papain Papain chất endoprotease có chứa 16,1% N 1,2% S D Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động 6,0 ÷ 8,0 Nhiệt độ tối thích để trì hoạt tính đến 60oC Papain thủy phân protein, đóng vai trị vừa endopeptidase vừa exopeptidase Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành peptide Trong đó: i + k = n Các exopeptidase thủy phân protein tạo thành acid amin: Trong đó: i’ + k’ = n 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Đối tượng nghiên cứu C C R UT.L Hình 2.1 Nội tạng Hải sâm - Nội tạng Hải sâm cung cấp công ty TNHH chế biến D thủy sản – xuất nhập Việt Trường, bảo quản tủ lạnh -20◦C Hình 2.2 Papain thương mại - Papain: cung cấp Công ty cổ phần dược phẩm Novaco, nhiệt độ hoạt động tối ưu: 50-60oC, pH tối thích: 6-7 Hoạt lực enzyme kiểm tra lại phương pháp Anson 2.245 UI/g - Papain thô thu nhận từ nhựa đu đủ 11 1.2 Phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Phương pháp thủy phân enzyme Hình 2.3 Mẫu thủy phân tủ ấm 62oC Nội tạng Hải sâm bổ sung nước xay nhuyễn, thủy phân C C R UT.L papain với nồng độ 0,06 g/ml Thủy phân nhiệt độ 62oC, pH 8, thời gian thủy phân 180 phút Thêm TCA 15 phút, đưa D mẫu nhiệt độ phòng ly tâm thu lấy dịch Phần dịch tiếp tục lọc, sau xác định hàm lượng N acid amin [96] 1.2.2 Xác định hàm lượng N acid amin giải phóng phương pháp Ninhydrin Nguyên tắc: Dung dịch protein, peptid acid amin đun nóng với Ninhydrin 8% tạo thành phức chất có màu xanh tím Ninhydrin tạo nên phản ứng khử carboxyl oxy hóa acid amin với H2O tạo thành CO2, NH3, andehyl ngắn cacbon so với acid amin ban đầu ninhydrin bị khử Ninhydrin bị khử tiếp tục tác dụng lại với NH3 phóng thích kết hợp với phân tử Ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím 12 Hình 2.4 Dịch đạm thủy phân sau thêm thuốc thử Ninhydrin Đo mẫu: Hút ml dịch đạm thủy phân cho vào ống nghiệm, thêm vào ml dung dịch Ninhydrin 8% acetone, lắc ống sau đậy miệng ống Đặt ống nghiệm vào bể nước sơi 15 phút, sau làm C C R UT.L nguội nước lạnh Thêm vào ống nghiệm 1ml ethanol 50% D đo bước sóng 570 nm [97] Tính kết quả: ❖ Hàm lượng đạm acid amin tính theo cơng thức: Trong đó: Mn Trong đó: : Hàm lượng đạm amin (mgN/g) VS : Thể tích dịch đạm thủy phân (ml) 14 : Khối lượng mol nguyên tử Nitơ m : Khối lượng mẫu (g) 1000 : Hệ số quy đổi từ µg sang mg CS : Nồng độ mmol/mL Ni có mẫu ODS : Độ hấp thụ mẫu thật 13 : Độ hấp thụ mẫu trắng OD0 0,0086; 0,0449: Lấy từ đường chuẩn Glycine y = 0,0447x + 0,0096 : Khối lượng mol Glycine 75,07 Đường chuẩn Glycine OD A570 nm 2.5 y = 0.0447x + 0.0096 R² = 0.9996 1.5 0.5 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độ Glycine (µg/ml) C C R UT.L Hình Đường chuẩn Glycine D ❖ Mức độ thủy phân: Trong đó: DH : Mức độ thủy phân (%) Mn : Đạm amin dịch đạm thủy phân (mgN/g) Mn tổng số: Đạm amin tổng số (Hàm lượng Nitơ tổng số mgN/g tính theo phương pháp Kjeldahl) Hàm lượng Mn tổng số xác định 13% hàm lượng chất khô 1.2.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng Hải sâm đến mức độ thủy phân Hỗn hợp nội tạng Hải sâm xay nhuyễn với tỷ lệ nước/nội tạng Hải sâm (v/w) là: 0/1; 0,5/1; 1/1; 1,5/1; 2/1; 2,5/1; 5/1 Tiến hành: cài đặt điều kiện thủy phân ban đầu tiến hành thủy phân 14 1.2.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy máy khuấy từ gia nhiệt T.ARE Velp mức độ: không khuấy, mức 1, mức mức Mẫu sau thủy phân lọc xác định hàm lượng N acid amin 1.2.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân Khảo sát mức độ thủy phân thời điểm 20; 40; 60; 80; 100; 120; 140; 160; 180; 210; 240 phút Mẫu sau thủy phân lọc xác định hàm lượng N acid amin 1.2.6 Phương pháp xác định thông số động học (Km, Vmax) phản ứng C C R UT.L Phương trình Michaelis-Menten: D Từ suy ra: Để khảo sát Vmax Km, chuẩn bị hỗn hợp dung dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm với nồng độ chất: 1; 10; 50 mg/L, bổ sung 0,01 g papain Hỗn hợp ủ 62 oC thời gian 2; 4; 6; 8; 10 phút Sau thời gian khảo sát, thêm vào ml TCA 0,4 M để kết thúc phản ứng Độ hấp thụ dịch lọc đo bước sóng 570 nm 1.2.7 Xác định thành phần tỷ lệ acid amin 10 g mẫu Hải sâm xay nhuyễn, thêm 15 ml nước cất 10 ml papain nồng độ 0,06 mg/ml Hỗn hợp ủ 62 oC Thêm 20 ml TCA 0,4 M để dừng phản ứng mang ly tâm, lọc dịch 15 đạm thủy phân Xác định thành phần hàm lượng acid amin dịch đạm thủy phân theo phương pháp TCVN 8764:2012 1.2.8 Xác định hoạt tính chống oxy hóa dịch đạm thủy phân 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Nguyên tắc: Các gốc DPPH tự có độ hấp thụ cực đại mạnh bước sóng 517 nm có màu đỏ tía Đo mẫu: ml dịch đạm thủy phân sau lọc cho vào ống nghiệm, bổ sung ml dung dịch DPPH 0,15 mM ethanol 95 %, mẫu trộn đều, để nhiệt độ phịng bóng tối 30 phút Hoạt tính chống oxy hố đo bước sóng 517 nm ước tính theo phương C C R UT.L pháp Yen Wu (1999) [99] Tính tốn: D Trong đó: ODc : Giá trị mật độ quang mẫu đối chứng âm ODm : Giá trị mật độ quang mẫu nghiên cứu 1.2.9 Phương pháp thu nhận papain thô từ mủ đu đủ Nghiên cứu sử dụng mủ đu đủ để thay papain thương mại Dùng dao vạch từ 5-7 rảnh, chiều sâu 1-2 mm lên bề mặt dọc trái đu đủ, thu mủ vào ống nhựa Sau sấy khơ tủ sấy 55oC đến độ ẩm nhựa khô đạt < 8%, nghiền mịn, trữ mẫu -20oC 1.2.10 Phân tích thống kê Các thí nghiệm lặp lại lần, theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên Kết thu xử lý phần mềm thống kê SPSS 20.0 với độ tin cậy 95% Sử dụng phương pháp xử lý phân tích ANOVA, so sánh khác biệt giá trị trung bình dựa kiểm định LSD 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 2.1 Động học phản ứng thủy phân Kết xác định hàm lượng N acid amin thời gian 2, 4, 6, 8, 10 đc thể Bảng 3.1 biến thiên theo Hình 3.1 Bảng 3.1 Hàm lượng N acid amin mẫu thử nghiệm động học (mgN/g) OD (570 nm) Thời gian (phút) S1 = g/L S2 = 10 g/L S3 = 50 g/L 3,42 4,23 4,54 4,97 6,25 6,53 8,08 9,82 10,42 DUT 13,08 13,68 17,12 17,97 y = 1.7005x + 0.425 R² = 0.9876 y = 1.6305x + 0.317 R² = 0.989 11,19 10 14,29 Nồng độ sản phẩm (mgN/g) 20 C C R L 16 12 y = 1.398x + 0.002 R² = 0.9878 0 10 12 Thời gian (phút) S1 = g/L S2 = 10 g/L S3 = 50 g/L Linear (S1 = g/L) Linear (S2 = 10 g/L) Linear (S3 = 50 g/L) Hình 3.1 Sự biến thiên nồng độ sản phẩm thủy phân theo thời gian 17 Bảng 3.1 cho thấy với nồng độ chất hàm lượng N acid amin giải phóng tăng dần theo thời gian Sau 10 phút thủy phân, hàm lượng N acid amin tăng khoảng lần so với thủy phân phút đầu Khi tăng nồng độ chất từ đến 10 g/L khả thủy phân tăng nhanh khoảng 120%, tăng nồng độ chất lên 50 g/L tăng thêm 6% so với nồng độ 10 g/L Hình 3.1, số tốc độ phản ứng nồng độ chất hệ số góc đường thẳng nối điểm nồng độ sản phẩm thời gian khảo sát, ghi nhận 1,3980; 1,6305; 1,7005 mgN/g tương đương với nồng độ chất [S]: 1; 10 50 g/L Các thông số động học Km, Vmax xác định theo phương pháp Lineweaver – Burk (1934) cách lập đồ thị 1/V = f (1/[S]), C C R UT.L dựa giá trị nghịch đảo 1/V 1/[S] thể Hình 3.2 D 1.2 y = 0.123x + 0.593 R² = 0.9869 1/V 0.8 0.6 0.4 0.2 -2 -1.5 -1 -0.5 0.5 1.5 1/[S] Hình 3.2 Phương trình Lineweaer – Burk để tính Km, Vmax Thơng qua phương trình Lineweaer – Burk: y = 0,123x + 0,593 hay 1/V = 0,123 (1/[S]) + 0,593 18 Giá trị Km Vmax papain khảo sát tính tốn sau: 1/Vmax = 0,593 Km/Vmax = 0,123 Papain có giá trị Vmax đạt 1,69 mgN/phút Km 0,21 g/L Các kết nghiên cứu sở để xác định đặc tính thủy phân papain chất nội tạng Hải sâm, từ xác định cơng nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân 2.2 Hồn thiện công nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân Trong nghiên cứu trước đây, nhóm chúng tơi xác định số thông số công nghệ thủy phân nội tạng Hải sâm, xác định thông số pH = 8, nhiệt độ 62 oC, thời gian thủy C C R UT.L phân [103] 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng D Hải sâm đến mức độ thủy phân Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng Hải sâm ghi nhận kết mức độ thủy phân thể Hình 3.3 16.00 MỨC ĐỘ THỦY PHÂN % 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 0/1 0,5/1 1/1 1,5/1 2/1 2,5/1 5/1 TỶ LỆ NƯỚC/NGUYÊN LIỆU (V/W) Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ nước/nguyên liệu đến mức độ thủy phân 19 Hình 3.3 cho thấy mức độ thủy phân tăng dần tăng tỷ lệ nước/nguyên liệu từ 0/1 đến 1/1 với mức tăng khoảng 0,5 % Tốc độ thủy phân tăng nhanh đạt đỉnh tỷ lệ 1,5/1 với mức độ thủy phân 14,4 % Tuy nhiên tăng pha loãng nồng độ chất lên 2,5/1 5/1 mức độ thủy phân có xu hướng giảm dần, khoảng 10% tỷ lệ 5/1 Nghiên cứu khảo sát tỷ lệ nước/nội tạng Hải sâm tối ưu 1,5/1 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân Mức độ thủy phân mức độ khuấy khác nhau: không khuấy, khuấy mức 1, khuấy mức khuấy mức thể C C R UT.L Hình 3.4 18.00 Mức độ thủy phân % 16.00 D 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 Không khuấy Mức Mức Mức Các mức độ khuấy Hình 3.4 Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân Hình 3.4 cho thấy: hỗn hợp dịch đạm thủy phân khơng khuấy mức độ thủy phân thấp (8,8 %), mức độ thủy phân hỗn 20 hợp khuấy mức cao (15,3 %) So với khơng khuấy khuấy mức hiệu suất tăng gần gấp lần Tuy nhiên mức độ thủy phân giảm tăng tốc độ khuấy lên mức mức Nghiên cứu cho thấy mức độ khuấy tối ưu cho phản ứng thủy phân nội tạng Hải sâm papain mức 2.2.3 Xác định thay đổi mức độ thủy phân theo thời gian Nội tạng hải sâm thủy phân thời gian với kết mức độ thủy phân ghi nhận thời điểm có bước nhảy 20 phút, thể Biểu đồ 3.2 30 C C R UT.L 20 D 15 10 05 240 phút 220 phút 200 phút 180 phút 160 phút 140 phút 120 phút 100 phút 80 phút 60 phút 40 phút 20 phút 00 phút Hiệu suát thủy phân % 25 Thời gian thủy phân Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi mức độ thủy phân theo thời gian Biểu đồ 3.3 cho thấy mức độ thủy phân tăng dần theo thời gian kết thủy phân ghi nhận từ thời điểm từ lúc chưa thủy phân đến 160 phút tăng từ 4,2% đến 17,7% Đến phút 180 mức độ thủy phân tăng nhanh đột ngột đạt cực đại 25,1% Từ phút 200 đến 240 mức độ thủy phân có dấu hiệu giảm từ 22,9 % đến 13,3% Sau khảo sát mức độ thủy phân thời gian từ đến 240 phút, thời gian tối ưu để thủy phân nội tạng Hải sâm papain 180 phút 21 2.2.4 Khả sử dụng papain thô thay papain thương mại Trong nghiên cứu sử dụng mủ đu đủ để thay papain thương mại Kết ra, tiến hành thủy phân với nồng độ chất 0,05%, enzyme thô từ mủ đu đủ chiếm 1% chất, 10 phút, 62 oC, pH =8 mức độ thủy phân lên đến 16,95 % Từ cho thấy, papain thơ từ mủ đu đủ hồn tồn thay papain thương mại nghiên cứu hoạt động sản xuất, giúp giảm chi phí sản xuất Từ kết khảo sát điều kiện tối ưu để thu nhận dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm, nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất Nội tạng •Lạnh đơng HS •100 g C C R UT.L D Xay •Thêm 150 ml nước cất Điều chỉnh pH •pH = Thủy phân • • • • mg enzyme papain Nhiệt độ 62oC Tốc độ khuấy: mức Thời gian: Dừng phản ứng Lọc Dịch đạm thủy phân Hình 3.5 Sơ đồ hồn thiện quy trình thủy phần nội tạng Hải sâm 22 2.3 Đặc tính dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm 2.3.1 Thành phần acid amin sản phẩm dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm Thành phần acid amin sản phẩm thủy phân nội tạng Hải sâm sau thủy phân phân tích trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Thành phần acid amin sản phẩm dịch đạm thủy phân (mg/g chất khô) Thành phần acid Nội tạng amin Hải sâm Alanine 1,925 Arginine 0,066 Aspartic acid 0,116 Glutamic acid 3,182 Glycine 1,415 Histidine * 0,192 Isoleucine * 0,200 Leucine * 0,321 Lysine * 0,417 10 Methionine * 0,113 11 Phenylalanine * 0,222 12 Proline 0,078 13 Serine 0,248 14 Threonine * 0,365 15 Tyrosine 0,090 16 Valine * 0,696 Tổng acid amin 9,642 (*): acid amin không thay STT Hải sâm [110] 14,6 13,3 20,4 30,6 32,0 2,10 7,15 10,9 8,85 3,35 5,10 15,3 10,2 10,9 5,45 9,2 199,4 C C R UT.L D Đầu cá ngừ [111] 44,5 41,2 76,2 24,1 50,8 51,2 42,7 63,8 31,3 21,6 25,8 14,7 23,9 33,2 21,9 36,5 603,4 Kết phát 16/22 loại acid amin, với tổng lượng đạt 9,642 mg/g chất khơ Trong acid amin khơng thay có 8/9 loại, chiếm 26,2 % tổng acid amin Các acid amin có hàm lượng cao Glutamic (3,182 mg/g chất khô), Alanine (1,925 mg/g chất khô) 23 2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm Nghiên cứu tiến hành khảo sát khả chống oxy hóa dịch đạm thủy phân mức độ thủy phân khác (5; 10; 15; 20%) để kiểm tra thay đổi khả bắt gốc tự DPPH theo thời gian kết trình bày Hình 3.4 % bắt gốc tự DPPH 100 y = -0.307x2 + 8.229x + 8.225 R² = 0.9326 80 63 60 60 51 41 40 C C R UT.L 20 00 D 10 15 20 25 Mức độ thủy phân % Hình 3.6 Phần trăm bắt gốc tự dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm Khi tăng mức độ thủy phân từ 5% đến 10% hoạt tính chống oxy hóa tăng dần Theo khảo sát thời điểm mức độ thủy phân 10% cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, đạt 62,8% Tiếp tục tăng mức độ thủy phân lên 15%, 20% tỷ lệ bắt gốc DPPH giảm dần cịn 60 51% Tính IC50 dựa vào phần trăm bắt gốc tự DPPH dịch đạm thủy phân thu kết quả: IC50 = 6,8% mức độ thủy phân tương đương với nồng độ 589,3 mgN/l 24 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Xử lý phụ phẩm hải sâm vấn đề quan tâm lượng thải bỏ chúng lớn Nghiên cứu đưa quy trình cơng nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm papain xác định số hoạt tính sinh học chúng Kết xác định điều kiện tối ưu quy trình thủy phân chứng minh thủy phân nội tạng Hải sâm bị ảnh hưởng nhiều yếu tố tỷ lệ pha loãng nước/nguyên liệu, tốc độ khuấy thời gian thủy phân Giá trị DH tối ưu thủy phân tỷ lệ pha loãng 1,5/1 (v/w), tốc độ khuấy mức thời gian thủy phân 180 phút Nghiên cứu chứng minh khả kháng oxy hóa C C R UT.L dịch đạm thủy phân giàu thành phần acid amin D Kết gợi ý sản phẩm hồn tồn sử dụng để sản xuất sản phẩm có ích thực phẩm, mỹ phẩm, phân bón Tuy nhiên, động vật đáy nên hải sâm tiềm ẩn chất độc cho thể kim loại nặng, nên cần nghiên cứu sâu thành phần trước ứng dụng vào đời sống ... - Xác định thông số công nghệ sản xuất hồn thiện quy C C R UT.L trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm - Xác định số đặc tính dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm D Ý nghĩa khoa... nghiên cứu sở để xác định đặc tính thủy phân papain chất nội tạng Hải sâm, từ xác định cơng nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân 2.2 Hồn thiện cơng nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân Trong nghiên cứu. .. đạm thủy phân Hình 3.5 Sơ đồ hồn thiện quy trình thủy phần nội tạng Hải sâm 22 2.3 Đặc tính dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm 2.3.1 Thành phần acid amin sản phẩm dịch đạm thủy phân nội tạng Hải