Xác định chỉ thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai (late blight) trên cà chua (lycopersicon esculentum mill )

Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ********************** LÊ TRẦN PHÚC KHOA XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI (LATE BLIGHT) TRÊN CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum Mill.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2010 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS TRẦN THỊ DUNG Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 09 tháng 08 năm 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -oOo TP HCM, ngày 31 tháng năm 2010 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ TRẦN PHÚC KHOA Giới tính: NAM Ngày, tháng, năm sinh: 27/09/1985 Nơi sinh: Ninh Thuận Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Khố (Năm trúng tuyển): 2008 1- TÊN ĐỀ TÀI: Xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai (Late blight) cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN - Nghiên cứu tính kháng bệnh sương mai giống cà chua thu thập qua lây nhiễm nhân tạo - Xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai cà chua 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng năm 2010 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 07 năm 2010 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS TRẦN THỊ DUNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thơng qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MƠN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH TS TRẦN THỊ DUNG KHOA QL CHUYÊN NGÀNH i LỜI CẢM ƠN Thành kính ghi nhớ công ơn ba mẹ người thân gia đình ln chỗ dựa vững cho con, động viên, khuyến khích tạo điều kiện cho học tập tốt Xin chân thành cảm ơn: ­ Ban Giám Hiệu trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập trường ­ Quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ sinh học quý thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt khóa học ­ TS Trần Thị Dung, ThS Trương Quốc Ánh tận tình hướng dẫn động viên tơi thời gian thực luận văn tốt nghiệp ­ ThS Bùi Phú Nam Anh anh chị thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài ­ Toàn thể bạn lớp Cao Học khóa 08 hỗ trợ, giúp đỡ động viên tơi suốt hai năm qua TP Hồ Chí Minh, ngày 31 Tháng 07 năm 2010 LÊ TRẦN PHÚC KHOA ii XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI (LATE BLIGHT) TRÊN CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum Mill.) TÓM TẮT Bệnh sương mai (Late blight) nấm Phytophthora infestans de Bary gây bệnh gây hại nghiêm trọng hầu hết vùng trồng cà chua Việt Nam Bệnh gây hại tất phận lá, thân, hạt Hiện nay, biện pháp hoá học sử dụng thuốc trừ nấm biện pháp hiệu việc kiểm soát bệnh Tuy nhiên, biện pháp làm tăng chi phí sản xuất ảnh hưởng xấu đến môi trường sống sức khỏe người tiêu dùng Chính vậy, sử dụng giống kháng phương pháp hữu hiệu để kiểm soát dịch bệnh Mục tiêu luận văn tìm kiếm nguồn gene kháng thích hợp isolate nấm Phytophthora infestans phân lập Việt Nam xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai cà chua Kết phân tích đánh giá kiểu hình hai phương pháp tách rời lây nhiễm toàn giai đoạn cho thấy rằng, giống L3708 chứa gene kháng Ph – thể tính kháng mạnh ổn định với isolate LS, PF12, TF6, RIFAV nấm Phytophthora infestans Việt Nam Kết phân tích microsatellite dịng cà chua mang gen kháng Ph – xác định marker TOM236 liên kết chặt với gene kháng Ph – 3, định vị vùng vai dài nhiễm sắc thể số Kết tạo tiền đề cho công tác chọn, tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai thị phân tử Việt Nam iii IDENTIFICATION OF SSR MOLECULAR MARKER LINKED TO LATE BLIGHT RESISTANT GENE IN TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) ABSTRACT Late blight caused by the fungal pathogen Phytophthora infestans de Bary is one of the most serious diseases of tomato cultivation regions in Vietnam This oomycete pathogen attacks on leaves, stems, fruits and seeds of tomato Spraying fungicides is the most effective method to control this disease However, this strategy increases production costs and badly affects to the environment Introduction of resistant varieties is therefore the most effective measure to control this disease The objective of this thesis is to find out Late blight resistant sources suitable for the isolates of Phytophthora infestans which were collected in Vietnam and identify SSR molecular marker associated with Late blight resistant gene in tomato The result of phenotypic evaluation by both detached – leaflets and natural infection methods showed that L3708 variety containing Ph – resistant gene expressed stably and strongly resistant to four isolates of LS, PF12, TF6, and RIFAV of Phytophthora infestans in Vietnam Microsatellite analysis on the tomato varieties containing Ph – resistant gene identified TOM236 marker shown linkage tighly to Ph – resistant gene, was located on long arm of chromosome This result opens up for MAS (Marker Assisted Selection) of Late blight resistant improvement of tomato varieties in Vietnam iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii MỤC LỤC .iv DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC HÌNH .viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix Chương MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Nội dung .3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 Tổng quan cà chua .4 2.1.1 Đặc điểm thực vật cà chua .6 2.1.2 Giống 11 2.1.3 Thời vụ 13 2.2 Tình hình sản xuất cà chua giới Việt Nam 13 2.2.1 Tình hình sản xuất cà chua nước 13 2.2.2 Tình hình sản xuất cà chua giới 15 2.3 Bệnh sương mai cà chua 16 2.3.1 Triệu chứng nguyên nhân gây bệnh 17 2.3.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển gây hại bệnh 21 2.4 Tổng quan tính kháng bệnh thực vật 22 2.4.1 Khái niệm tính kháng bệnh thực vật 23 2.4.2 Cơ sở sinh hóa, sinh lý tính kháng bệnh thực vật 23 2.4.3 Cơ sở di truyền tính kháng bệnh thực vật 26 2.4.4 Phân loại tính kháng bệnh trồng 27 2.4.5 Khái niệm gene đối gene 28 v 2.4.6 Một số chiến lược nghiên cứu tính kháng thực vật 30 2.5 Tìm hiểu genome cà chua 31 2.5.1 Genome học cấu trúc 32 2.5.2 Chiến lược giải trình tự hệ gen cà chua 33 2.6 Nguyên tắc ly trích DNA tế bào thực vật 34 2.7 Phương pháp PCR 35 2.7.1 Khái niệm 35 2.7.2 Nguyên tắc 35 2.8 Vai trò marker phân tử chọn giống thực vật 37 2.8.1 Các loại marker có tính chất di truyền 37 2.8.2 Các DNA marker sử dụng chọn giống thực vật 41 2.9 Giới thiệu microsatellite 43 2.9.1 Khái niệm microsatellite 43 2.9.2 Các loại microsatellite 43 2.9.3 Vai trò microsatellite 44 2.9.4 Nguyên tắc phát microsatellite primer PCR 46 2.9.5 Ưu, khuyết điểm phương pháp microsatellite 48 2.9.6 Ứng dụng microsatellite 49 2.10 Tình hình nghiên cứu tính kháng bệnh sương mai cà chua 50 2.10.1 Các nghiên cứu nước 50 2.10.2 Các nghiên cứu nước 52 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55 3.1 Thời gian địa điểm thực 55 3.2 Nguyên vật liệu 55 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 55 3.2.2 Nguồn nấm nhiễm bệnh 55 3.3 Phương pháp nghiên cứu 55 3.3.1 Phân tích đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh sương mai 55 3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá tính kháng bệnh sương mai mẫu giống cà chua địa phương giống trồng phổ biến 55 vi 3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Xác định nguồn gene cà chua nhập nội kháng số chủng nấm Phytophthora infestans Việt Nam 59 3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá biểu tính kháng bệnh sương mai số tổ hợp lai F1 mang gene kháng Ph – 60 3.3.2 Xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai 61 3.3.2.1 Quy trình ly trích DNA tổng số 61 3.3.2.2 Tuyển chọn SSR primer cho phản ứng PCR 63 3.3.2.3 Thực phản ứng PCR xác định thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh sương mai 64 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66 4.1 Đánh giá tính kháng bệnh sương mai mẫu giống cà chua địa phương giống trồng phổ biến 66 4.2 Xác định nguồn gene cà chua nhập nội kháng số chủng nấm Phytophthora infestans Việt Nam 70 4.3 Đánh giá biểu tính kháng bệnh sương mai số tổ hợp lai F1 mang gene kháng Ph – 73 4.4 Xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng Ph – bệnh sương mai cà chua 77 4.4.1 Sản phẩm ly trích DNA tổng số 77 4.4.2 Tuyển chọn SSR primer cho phản ứng PCR 81 4.4.3 Thực phản ứng PCR xác định thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh sương mai 85 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 5.1 Kết luận 88 5.2 Kiến nghị 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC 103 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích, suất sản lượng cà chua từ năm 2001 đến 2003 14 Bảng 2.2 Các loại DNA marker 40 Bảng 2.3 Các tỷ lệ phân ly mong muốn cho marker quần thể khác 41 Bảng 3.1 Danh sách dòng, giống cà chua nghiên cứu 56 Bảng 3.2 Thang điểm đánh giá mức độ kháng nhiễm 59 Bảng 3.3 Các giống cà chua nhập nội 59 Bảng 3.4 Thang điểm đánh giá mức độ kháng nhiễm 60 Bảng 3.5 Các tổ hợp lai chứa gen kháng Ph – 61 Bảng 3.6 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 65 Bảng 3.7 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 65 Bảng 4.1 Mức độ mẫn cảm với isolate nấm sương mai mẫu giống cà chua 68 Bảng 4.2 Mức độ mẫn cảm với isolate nấm sương mai mẫu giống cà chua nhập nội 71 Bảng 4.3 Số lượng bào tử tạo thành từ tổ hợp lai F1 74 Bảng 4.4 Mức độ mẫn cảm với isolate RIFAV 26 dòng cà chua dùng phương pháp tách rời 75 Bảng 4.5 Mức độ mẫn cảm với isolate RIFAV 32 dòng cà chua dùng phương pháp lây nhiễm toàn 76 Bảng 4.6 Giá trị OD 32 dòng cà chua dùng để thực phản ứng PCR với SSR primer 79 Bảng 4.7 Danh sách SSR primer nhiễm sắc thể số 84 93 24 Ben – Daniel B H., Petrov L., Sheck L., and Cohen Y., 2004 Screening tomatoes for race – non – specific resistance against late blight Phytoparasitica, 32: 199 – 200 (Abstract) 25 Black L L., Wang T C., Hanson P M., and Chen J T., 1996a Late blight resistance in four wild tomato accessions, effectiveness in diverse locations and inheritance of resistance Phytopathology 96, S24 (Abstract) 26 Black L L., Wang T C., and Huang Y H., 1996b New sources of late blight resistance identified in wild tomatoes Tropical vegetable Information Service Newsletter, 1: 15 – 17 27 Bonde R., and Murphy E F., 1952 Resistance of certain tomato varieties and crosses to late blight Maine agricultural experiment station bulletin, 497: – 15 28 Brouwer D J., and Clair D A., 2004 Fine mapping of three quantitative trait loci for late blight resistance in tomato using near isogenic lines (NILs) and sub – NILs Theor Appl Genet, 108: 628 – 638 29 Brouwer D J., Jones E S., and Clair D A., 2004 QTL analysis of quantitative resistance to Phytophthora infestans (late blight) in tomato and comparisons with potato Genome 47: 475 – 492 30 Christine D., Smart, Steven D., Tanksley, Hilary Mayton, William E., Fry, 2007 Resistance to Phytophthora infestans in Lycopersicon pennellii Plant Dis., 91: 1045 – 1049 31 Chunwongse J., Chunwongse C., Black L., Hanson P., 1998 Mapping of the Ph – gene for late blight from L pimpinellifolium L3708 Report of Tomato Genetics Cooperative, 48: 13 – 14 32 Chunwongse J., Chunwongse C., Black L L., and Hanson P., 2002 Molecular mapping of the Ph – gene for late blight resistance in tomato J Hortic Sci Biotechnol, 77: 281 – 286 33 Clayberg C D., Butler L., Rick C M., and Robinson R W., 1965 List of tomato genes Rep Tomato Genet Coop, January, 15: – 21 94 34 Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005 An introduction to markers, Quantitative Trait Loci (QTL) mapping and marker – assisted selection for crop improvement: The Basis Concepts Euphytica, 142: 169 – 196 35 Cohen Y., 2002 Populations of Phytophthora infestans in Israel underwent three major genetic changes during 1983 to 2000 Phytopathology, 92: 300 – 307 36 Davis R M., Hamilton G., Lanini W T., and Speen T H., 1996 The importance of pesticides and other pest management practices in U.S tomato production USDA, NAPIAP, Document Number – CA – 96 37 Davis R M., Hamilton G., Lanini W T., Speen T H., and Osteen C., 1998 The importance of pesticides and other pest management practices in U.S tomato production USDA, NAPIAP, Document Number – CA – 98 38 Doyle J J, Doyle J l., 1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12, pp: 13 – 15 39 Eagles H., Bariana H., Ogbonnaya F., Rebetzke G., Hollamby G., Henry R., Henschke P., and Carter M., 2001 Implementation of markers in Australian wheat breeding Aust J Agric Res, 52: 1349 – 1356 40 Foolad M R., Stoltz T., Dervinis C., Rodriguez R L., and Jones R A., 1997 Mapping QTLs conferring salt tolerance during germination in tomato by selective genotyping Mol Breed, 3: 269 – 277 41 Fray A., Graham E., Jacob J., Chetelat R T., Tankslet S D., 1998 Identification of QTL for late blight resistant from L pimpinellifolium L3708 Report of Tomato Genetics Cooperative, 48: 19 – 21 42 Frary A., Xu Y., Liu J., Mitchell S., Tedeschi E., and Tanksley S D., 2005 Development of a set of PCR – based anchor markers encompassing the tomato genome and evaluation of their usefulness for genetics and breeding experiments Theoretical and Applied Genetics, vol 111, no 2, pp 291 – 312 43 Fry W E., and Goodwin S B., 1997b Re – emergence of potato and tomato late blight in the United States Plant Disease, 81(12):1349 – 1357 95 44 Fry W E., Goodwin S B., Matuazak J M., Spielman L J, and Milgroom M G., 1992 Population genetic and international migrations of Phytophthora infestans Ann Rev Phytopathol, 30: 107 – 129 45 Gallegly M E., Marvel M E., 1955 Inheritance of resistance to tomato Race – O of Phytophthora infestans Phytopathol, 45: 103 – 109 46 Garelik G., 2002 Taking the bite out of potato blight Science, 298 (5599): 1702 – 1704 47 Goodwin S B., Spielman J L., Matuszak J M., Bergeron S N., and Fry W E., 1992 Clonal diversity and genetic differentiation of Phytophthora infestans population in Northern and Central Mexico Phytopathol, 82: 955 – 961 48 Goodwin S B., Sujkowski L S., and Fry W E., 1995 Rapid evolution of pathogenicity within clonal lineages of the potato late blight disease fungus Phytopathology, 85(6): 669 – 676 49 Harper L C., and Cande W Z., 2000 Mapping a new frontier; development of integrated cytogenetic maps in plants Functional And Integrative Genomics, vol 1, no 2, pp 89 – 98 50 He C., Poysa V., and Yu K., 2003 Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon estulentum Cultivars, Theoretical and Applied Genetics, 106: 363 – 373 51 Irit Irzhansky and Yigal Cohen, 2006 Inheritance of resistance against Phytophthora infestans in Lycopersicon pimpenellifolium L3707 Euphytica, 149: 309 – 316 52 Jones N., Ougham H., and Thomas H., 1997 Markers and mapping: We are all geneticists now New Phytol, 137: 165 – 177 53 Judelson H S., and Blanco F A., 2005 The spores of Phytophthora: Weapons of the plant destroyer Nature Rev Microbiol, 3: 47 – 58 96 54 Kamoun S., Huitema E., Vleeshouwers V G A A., 1999 Resistance to oomycetes: A general role for the hypersensitive response? Trend Plant Sci, 4:196 – 200 55 Kato M., Mizubuti E S., Goodwin S B., and Fry W E., 1997 Sensitivity to protectant fungicides and pathogenic fitness of clonal lineages of Phytophthora infestans in the United State Phytopathology, 87(9): 973 – 978 56 Keen N T Gene for gene complementarity in plant – pahtogen interactions Annu Rev Genet 24: 447 – 463 57 Kim M J., and Mutschler M A., 2006 CULBPT – A46 and CULBPT – A48 series of late blight resistant processing tomato breeding lines HortScience, 41: 263 – 265 58 Lagercrantz U., Ellegren H., and Andersson L., 1993 The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates Nucleic Acids Research, no 21, pp.1111 59 Leontine Colon, 2010 Resistance to late blight (Phytophthora infestans) in potato Plant Research International, pp: – 45 60 Leontine Colon, Bent J., Nielsen and Ulrich Darsow, 2004 Detached leaf test for foliage blight resistance Eucablight, version 1.2 61 Le V H., Ngo X T., Brurberg M B., and Hermansen A., 2008 Characterization of Phytophthora infestans populations from Vietnam Australasian Plant Pathology, 37: 592 – 599 62 Lincoln S., Daly M., and Lander E S., 1993 Constructing genetic maps with MAPMARKER/EXP 3.0 The Whitehead Institute Technical Report, 3rd edition 63 Linkage Committee, 1973 Linkage summary Tomato Genetics Cooperative, vol 23, pp – 11 64 Livingstone K D., Lackney V K., Blauth J., Van Wijk R., and Jahn M K., 1999 Genome mapping in Capsicum and the evolution of genome structure in the Solanaceae Genetics, vol 152, no 3, pp 1183 – 1202 97 65 Lukyanenko A N., 1991 “Disease resistance in tomato,” in Genetic Improvement of Tomato Theoretical and Applied Genetics, Springer, Berlin, Germany, pp 99 – 119 66 Ma Z Q., Roder M., and Sorrells M E., 1996 Frequencies and sequence characteristics of di, tri, and tetra – nucleotide microsatellites in wheat Genome, 39: 123 – 30 67 Martin G B., Brommonschenkel S H., Chumwongse J., Frary A., Ganal M W., Spivey R., Wu T., Earle E D., and Tanksley S D., 1993 Map – based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato Science (Washington, D.C.), 262: 1432 – 1436 68 Michaelson M J., Price H J., Ellison J R., and Johnston J S., 1991 Comparison of plant DNA contents determined by feulgen microspectrophotometry and laser flow cytometry American Journal of Botany, vol 78, no 2, pp 183 – 188 69 Moreau P., Thoquet P., Olivier J., Laterrot H., and Grimsley N., 1998 Genetic mapping of Ph – 2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato Mol Plant – Microbe Interact, 11: 259 – 269 70 Morgante M., and Olivieri A M., 1993 PCR – Amplified microsatellites as markers in plant genetics Plant Journal 3, pp 175 – 182 71 Mueller L A., Solow T H., Taylor N., 2005 The SOL genomics network A comparative resource for Solanaceae biology and beyond Plant Physiology, vol 138, no 3, pp 1310 – 1317 72 Paterson A H., 1996a Making genetic maps Tn: A.H Paterson (Ed.), Genome Mapping in Plants, pp 23 – 39 R G Landes Company, San Diego, California; Academic Press, Austin, Texas 73 Paterson A H., Lander E S., Hewitt J D., Peterson S., Lincoln S E., and Tanksley S D., 1988 Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms Nature, vol 335, no 6192, pp 721 – 726 98 74 Patterson B D., 1998 Genes for cold resistance from wild tomatoes HortScience, 23: 795 – 795 75 Peirce L C., 1971 Linkage tests with Ph conditioning resistance to race – O, Phytophthora infestans TGC report, 21: 30 76 Peterson D G., Lapitan, N L V., and Stack S M., 1999 Localization of single and low copy sequences on tomato synaptone – mal complex spreads using fluorescence in situ hybridization (FISH) Genetics, vol 152, no 1, pp 427 – 439 77 Pham X T., 2002 Breeding potatoes for late blight resistance in Vietnam Proceedings of the global initiative on late blight conference, pp 154 International Potato Center: Lima, Peru 78 Philippe Moreau, Philippe Thoquet, Jocelyne Olivier, Henri Laterrot, and Nigel Grimsley, 1998 Genetic mapping of Ph – 2, a single locus controlling partial resistant to Phytopthora infestans in Tomato Molecular Plant – Microbe Interact, 11: 259 – 269 79 Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., and Rafalski A., 1996 The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis Molecular Breeding, 2: 225 – 238 80 Prince J P., Pochard E., and Tanksley S D., 1993 Construction of a molecular linkage map of pepper and a comparison of synteny with tomato Genome, vol 36, no 3, pp 404 – 417 81 QIU Yi – peng1,2, LI Hai – tao2, ZHANG Zi – jun2 and ZOU Qing – dao2., 2009 RAPD marker of the resistant gene Ph – for tomato late blight China National Knowledge Infrastructure 82 Raposo R., Wilks D W., and Fry W E., 1993 Evaluation of potato late blight forecasts modified to include weather forecasts: A simulation analysis Phytopathology, 83(1): 103 – 108 83 Rick C M., 1982 The potential of exotic germplasm for tomato improvement In Plant improvement and somatic cell genetics Edited by I.K 99 Vasil, W.R Scowcroft, and K.J Freys Academic Press, New York, pp: – 28 84 Rossetto M., 2001 Sourcing of SSR markers from related plant species Centre for plant conservation genetics, Southern Cross University, Australia Chapter14 85 Rubin E., and Cohen Y., 2004a Oospores associated with tomato seed may lead to seedborne transmission of Phytophthora infestans Phytoparasitica, 32: 237 – 245 86 Rubin E., Baider A., and Cohen Y., 2001 Phytophthora infestans produces oospores in fruits and seeds of tomato Phytopathology, 91:1074 – 1080 87 Sayed H., Kayyal H., Ramsey L., Ceccarelli S., and Baum M., 2002 Segregation distortion in doubled haploid lines of barley (Hordeum vulgare L.) detected by simple sequence repeat markers Euphytica, 225: 265 – 272 88 Scot Nelson, 2008 Late blight of Tomato (Phytopthora infestans) Plant Disease, 45: – 10 89 Sherman J D., and Stack S M., 1995 Two – dimensional spreads of synaptonemal complexes from solanaceous plants – VI: high – resolution recombination nodule map for tomato (Lycopersicon esculentum) Genetics, vol 141, no 2, pp 683 – 708 90 Shibata D., 2005 Genome sequencing and functional genomics approaches in tomato Journal of General Plant Pathology, vol 71, no 1, pp – 91 Smulders M J M., Bredemeijer G., Rus – Kortekaas W., Arens P., Vosman B., 1997 Use of short microsatellite from database sequences to generate polymorphisms among Lycopersicon estulentum Cultivars and acessions of oher Lycopersicon species Theoretical and Applied Genetics, 97: 264 – 272 92 Stevens M A., and Rick C M., 1986 “Genetics and breeding,” in The Tomato Crop: A Scientific Basis for Improvement, J G Atherton and J Rudich, Eds., pp 35–109, Chapman and Hall, New York, NY, USA 93 Stuber C W., 1994 Enhancement of grain yield in maize hybrids using marker – facilitated introgression of QTLs in Analysis of molecular marker 100 data American Society for Horticultural Science/Crop Science Society of America, Corvallis, OR, pp 44 – 46 94 Suliman – Pollatschek S., Kashkush K., Shats H., Lavi U., 2002 Generation and mapping of AFLPs, SSRs, And SNPs in Lycopersicon estulentum Cellular Molecular Biology Letters, 7: 583 – 597 95 Tanksley S D., Ganal M W., Prince J P., 1992 High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes Genetics, vol 132, no 4, pp 1141 – 1160 96 Tanksley S D., Young N D., Paterson A H., and Bonierbale M., 1989 RFLP mapping in plant breeding: New tools for an old science Biotechnology, 7: 257 – 264 97 Tigchelaar E C., 1986 “Tomato breeding,” in Breeding for Vegetable Crops M J Bassett, Ed., AVI, Westport, Conn, USA, pp 135–171 98 Umaerus V., Umaerus M., 1994 Inheritance of resistance to late blight Potato genetics, G R E Mackay, CAB international, Wallingford Oxon OX10 8E, England, UK, pp: 365 – 401 99 Van der Hoeven R., Ronning C., Giovannoni J., Martin G., and Tanksley S D., 2002 Deductions about the number, organization, and evolution of genes in the tomato genome based on analysis of a large expressed sequence tag collection and selective genomic sequencing The Plant Cell, vol 14, no 7, pp 1441 – 1456 100 Van der Plank J E., 1986 Disease Resistance in Plants Academic Press, New York 101 Vleeshouwers V G., Van Dooijeweert W., Govers F., Kamoun S., and Colon L T., 2000 The hypersensitive response is associated with host and nonhost resistance to Phytophthora infestans Planta, 210: 853 – 864 102 Wang Y., Tang X., Cheng Z., Mueller L A., Giovannoni J., and Tanksley S D., 2006 Euchromatin and pericentromeric heterochromatin: comparative composition in the tomato genome Genetics, vol 172, no 4, pp 2529 – 2540 101 103 Weeden N., Timmerman G., and Lu J., 1994 Identifying and mapping genes of economic significance Euphytica, 73: 191 – 198 104 Winter P., and Kahl G., 1995 Molecular marker technologies for plant improvement World Journal of Microbiology and Biotechnology, 11: 438 – 448 105 Xu Y., Zhu L., Xiao J., Huang N., and McCouch S R., 1997 Chromosomal regions associated with segregation distortion of molecular markers in F2 , backcross, doubled haploid, and recombinant inbred populations in rice (Oryza sativa L.) Mol Gen Genet, 253: 535 – 545 106 Yang G P., Saghai – Maroof M A., Xu C G., Zhang Q., and Biyashev R M., 1994 Comparative analysis of microsatellite DNA polymorphisms in landraces and cultivars in rice Molecular and General Genetics, 245: 187– 194 107 Young N D., 1994 Constructing a plant genetic linkage map with DNA markers, pp 39 – 57, Tn: T.K.V Ronald and L Phillips (Eds.), DNA – based markers in plants Kluwer, Dordrec – ht/Boston/London 108 ZHU Hai – shan, WU Tao and ZHANG Zhen – xian, 2006 Inheritance analysis and identification of SSR markers linked to late blight resistant gene in Tomato Agricultural Sciences in China, 5(7): 517 – 521 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 109 www.accelrys.com/products/gcg 110 www.bio.davidson.edu 111 www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/microsatellite.html 112 www.cals.ncsu.edu/plantpath/people/faculty/ristaino/projects/projects.html 113 www.diggingri.wordpress.com/2009/08/ 114 www.en.wikipedia.org/wiki/Microsatellite#Introduction 115 www.faostat.fao.org 116 www.frodo.wi.mit.edu/primer3/ 117 www.hort.cornell.edu/department/Facilities/lihrec/vegpath/photos/lateblight_ tomato.htm 102 118 www.icg.rdg.ac.uk/public_html/ssr-helpfile.htm 119 www.nass.usda.gov:8080/QuickStats/index2.jsp 120 www.ncbi.nlm.nih.gov 121 www.php.wur.nl/UK/Publications/Phytophthora/ 122 www.php.wur.nl/UK/Research/Phytophthora/ 123 www.sgn.cornell.edu/solanaceae - project 124 www.solgenomics.net/ 125 www.tradewindsfruit.com 126 http://www.universe-review.ca 103 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Kết sàng lọc tính đa hình primer SSR112, SSR559, SSR333, SSR110 Sản phẩm PCR primer SSR112 Sản phẩm PCR primer SSR559 104 Sản phẩm PCR primer SSR333 Sản phẩm PCR primer SSR110 105 PHỤ LỤC Dụng cụ thiết bị thí nghiệm ­ Chén sứ chày giã (Đức) ­ Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ) ­ Cân phân tích số (Ohaus – Mỹ) ­ Máy hút tủ cấy vô trùng (Anh Quốc) ­ Pipet loại (Nichiryo – Nhật) ­ Găng tay ­ Đầu tuýp loại (Đức) ­ Máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức) ­ Tủ cấy vô trùng ­ Máy PCR (Biorad – Thụy Điển) ­ Máy điện di (Cosmo Bio Co – Nhật) ­ Máy chụp ảnh DNA (Biorad – Mỹ) ­ Lò viba (Electrolux – Thụy Điển) ­ Máy định ôn (Memmert – Đức) ­ Tủ lạnh (Sanyo – Nhật) ­ Máy chụp ảnh kỹ thuật số (Sony – Nhật) Hóa chất thí nghiệm Các hố chất dùng ly trích DNA ­ Nitơ lỏng ­ Dung dịch EB (extraction buffer)  2% w/v CTAB  1,4M NaCl  100 mM Tris – HCl pH 8.0  20 mM EDTA  2% PVP  0,1% v/v β – mercaptoethanol ­ TE buffer, bao gồm 10 mM Tris – HCl (pH 8.0) and mM EDTA (pH 8.0) ­ Dung dịch phenol/hloroform/isoamylalcohol (PCI) tỉ lệ 25 : 24 : 106 ­ Dung dịch isopropanol lạnh ­ Sodium acetate ­ Ethanol 70% 100% ­ RNase Các hóa chất dùng phản ứng PCR ­ 5X PCR buffer (do công ty Promega cung cấp) ­ 25 mM MgCl2 (do công ty Promega cung cấp) ­ 10 mM dNTPs (do công ty Promega Biorad cung cấp) ­ Top Taq DNA polymerase (do công ty Promega cung cấp) ­ DNA mẫu (ly trích từ cà chua) ­ H2O cất lần, siêu lọc, hấp khử trùng, chiếu UV ­ SSR Primer (do cơng ty Invitrogen cung cấp) Các hóa chất dùng điện di ­ Agarose ­ Dung dịch TAE 0,5X ­ Ladder 100 bp ­ Loading dye ­ Dung dịch nhuộm ethidium bromide 107 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG ********************** THƠNG TIN CÁ NHÂN Họ tên: Lê Trần Phúc Khoa Ngày, tháng, năm sinh: 27/09/1985 Nơi sinh: Ninh Thuận Điện thoại: 0938247085 Địa liên lạc: Phước An – Phước Vinh – Ninh Phước – Ninh Thuận QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 2003 – 2007: Sinh viên trường Đại học Nông Lâm – Tp Hồ Chí Minh Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Hệ đào tạo: Chính quy 2008 – 2010: Học viên cao học, trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG Tp HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số học viên: 03108133 ... TRẦN PHÚC KHOA ii XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI (LATE BLIGHT) TRÊN CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum Mill. ) TÓM TẮT Bệnh sương mai (Late blight) nấm Phytophthora... tiễn trên, đề tài ? ?Xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai (Late blight) cà chua (Lycopersicon esculentum Mill. )? ?? cần thiết có ý nghĩa chọn, tạo giống cà chua kháng bệnh. .. tuyển): 2008 1- TÊN ĐỀ TÀI: Xác định thị phân tử SSR liên kết với gene kháng bệnh sương mai (Late blight) cà chua (Lycopersicon esculentum Mill. ) 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN - Nghiên cứu tính kháng bệnh