Phân lập và nhận dạng một số Flavonoit

Phân lập và nhận dạng một số Flavonoit.

187Tạp chí Hóa học, T. 42 (2), Tr. 187 - 190, 2004 Phân lập và nhận dạng một số flavonoit từ cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) có ở Việt nam Đến Tòa soạn 15-7-2003 Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hong Ngọc, Chu Đình Kính Viện Hóa học, Viện Khoa học v& Công nghệ Việt Nam Summary Croton tonkinensis Gagnep. is an indigenous plant using in the folk medicine of Vietnam. For the first time two flavonoid-C-glucosides have been isolated from the aerial part of this plant. By the means of IR, FAB-MS, 1H- and 13C-NMR spectra, they were identified as vitexin and isovitexin. I - Đặt vấn đề Y học dân gian Việt Nam dùng cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) để chữa một số bệnh [1]. Những nghiên cứu thực nghiệm tr/ớc đây cho biết, hoạt chất chủ yếu của lá cây Khổ sâm thuộc lớp flavonoit v8ancaloit, h8m l/ợng t/ơng ứng của chúng l82,78% v8 0,32%, trong đó flavonoit có tính kháng khuẩn mạnh, còn ancaloit có tác dụng rõ rệt với ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc [2]. Từ lá v8 thân cây Khổ sâm chúng tôi đLphân lập v8 nhận dạng một số th8nh phần hóa học thuộc lớp chất steroit [3], triterpenoit [4], ancaloit [5] v8 diterpenoit [6]. B8i báo n8y tiếp tục trình b8y kết quả phân lập v8 nhận dạng các flavonoit của lá cây C. tonkinensis.II - Phần thực nghiệm 1. Dụng cụ thiết bị, nghiên cứu Đo điểm nóng chảy trên kính hiển vi Boởtius. Đo phổ FT-IR trên máy IMPACT-401 ở dạng viên nén. Phổ 1H- v813C-NMR ghi trên máy Brucker-500 ADVACE chuẩn nội TMS, dung môi DMSO-d6. Sắc ký lớp mỏng: silicagel GF254 (Art.5554). Hệ dung môi triển khai: cloroform - etanol - H2O (8 : 2 : 1). Hiện m8u: đèn tử ngoại 254 nm, H2SO45% hơ nóng 1000C. Tính giá trị Rfì 100.Sắc ký cột nhồi silicagel, hệ dung môi rửa giải CHCl3- MeOH có tỷ lệ 0 - 100%. 2. Nguyên liệu Lá cây Khổ sâm thu tháng 9 năm 2000 tại Tây Thiên, Tam Đảo. Dùng 650 g lá đL sấy khô, nghiền nhỏ ngâm kiệt với metanol v8 xử lý t/ơng tự nh/ [3]. Cặn butanol hòa tan bằng dung dịch HCl 1%, lọc bỏ cặn. N/ớc lọc đem chiết kiệt bằng etylaxetat, l8m khô dịch chiết bằng Na2SO4khan, để qua đêm, lọc v8 cất loại dung môi để khô thu 6,95 g v8 tách trên cột silicagel. 188a. Vitexin Rửa giải cột với hệ dung môi CHCl3- MeOH (9 : 1) thu 0,362 g chất bột vô định hình m8uv8ng rơm, Rf = 82, nóng chảy ở 259 - 2600C. Hiệu xuất 0,056% theo nguyên liệu. Phổ FTIR (KBr) max (cm-1): 3383 (rộng, mạnh OH), 3247, 2910, 1653, 1570, 1505, 1363, 1296, 1170, 1093. Phổ FAB-MS (NBA) m/z: 433 [M + H] +,455 [M + Na]+.FAB-MS (NBA + KCl): 471[ M + K] +.Phổ 1H- v813C-NMR (xem bảng). b. Isovitexin Tiếp tục rửa giải cột bằng CHCl3- MeOH tỷ lệ (9 : 1) thu 0,815 g chất rắn vô định hình m8uv8ng nhạt, chảy rữa ngo8i không khí, Rf = 72, nóng chảy ở 158 - 1600C. Hiệu xuất 0,028% theo nguyên liệu. Bảng 1: Độ chuyển dịch hóa học 1H-, 13C-NMR các flavonoit-C-glucosit Vitexin Isovitexin Vị trí cac- bon C(độ bội) H(JHz) HMBC C(độ bội) H(JHz) HMBC Apigenin Apigenin 2 163,85 s H-3, H-2'163,61s H-3, H-2'3 102,349 d 6,778 s H-3'102,834 d 6.779 s H-3'4 181,99 s H-3, 5-OH 182,007 s H-3, H-8 5 160,290 s 13,16 s (OH) H-6 160,697 s H-1'', 5-OH 6 98,038 d 6,27 s H-3, 5-OH 108,897 s H-8, H-1'', 5-OH 7 162,451 s 10,80 s (OH) H-6, H-1'' 163,348 s H-6, H-1'' 8 104,514 s H-6, H-1'' 93,725 d 6.526 s H-3, H-8 9 155,899 s H-1'' 156,295 s H-6 10 103,952 s H-3, H-6 103,468 s H-8, H-1'', 5-OH 1'121,517 s H-3, H-3'121,149 s H-3, H-3'2'128,860 d 8,02 d (8,13) H-6'128,495 d 7,929 d (8,7) H-6'3'115,700 d 6,89 d (8,15) H-5'116,063 d 6,933 d (8,7) H-5'4'161,030 s 10,30 s (OH) H-2', H-3'161,242 s 10,30 s (OH) H-2', H-3'5'115,700 d 6,89 d (8,15) H-3'116,063 d 6,933 d (8,7) H-3'6'128,860 d 8,02 d (8,13) H-2'128,495 d 7,929 d (8,7) H-2'8-C-glucopyranosit 6-C-glucopyranosit 1'' 73,27 d 4,69 d (9.5) 73,124 d 4,6 d (9,82) 2'' 70,740 d 3,84 dd (8.6) 70,650 d 4,04 dd (9,82, 9,8) 3'' 78,57 d 3,34 78,988 d 3,25 dd (9,82, 9,82) 4'' 70,40 d 3,54 70,304 d 4,10 5'' 81,74 d 3,25 81,576 d 3,21 6'' 61,97 t 3,53 t (5,2), 3,76 d (7.3) 61,525 t 3,57 t (5,2), 3,68 (7,3) 189Phổ FT-IR (KBr) max (cm-1): 3388 (mạnh, rộng OH), 2923, 1662, 1628, 1494, 1367, 1252, 1085. Phổ FAB-MS (NBA) m/z: 433 [M + H] +,455[M + Na]+, 471[ M+K]+Phổ 1H- v813C-NMR (xem bảng). c. Kaempferol Tiếp tục rửa giải cột với tỷ lệ 5 ữ 1 thu cặn vô định hình m8u v8ng nhạt, ghi EI-MS cho M+Các chất Rf 82 v8 Rf 72 không bị thủy phân trong 1 giờ bằng HCl 2N trên bếp cách thủy. iII - Kết quả v thảo luận Tr/ơng Văn Nh/ v8 cộng sự [2] lần đầu tiên xác định tác dụng kháng khuẩn của flavonoit ở lá cây C. tonkinensis v8 h8m l/ợng flavonoit to8n phần l8 2,78%. Dùng sắc ký giấy phát hiện thấy 6 th8nh phần khác nhau v8 đL phân lập đ/ợc 2 flavonoit chính có Rfkhác nhau, chúng đều có hấp thụ tử ngoại ở vùng 273 nm v8 330 nm đặc tr/ng cho các flavon, ngo8i ra không có thông tin n8o khác về các tính chất hóa lý của hai chất n8y. Trong b8i thông báo ngắn gần đây, Phan Minh Giang v8 cộng sự [7] nghiên cứu dịch chiết metanol của lá cây C. tonkinensis bằng ph/ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), với đầu dò DAD đL phát hiện thấy 3 flavonoit chủ yếu. Một trong 3 chất n8y đL đ/ợc phân lập v8 nhận dạng l8 tilirosit, đó l8 kaempferol- 3-O--D-(6"-O-coumaroyl)-glucopyranosit. Khi theo dõi sự biến động hoạt tính của các dịch chiết từ những bộ phận khác nhau ở cây C. tonkinensis theo mùa trong năm, chúng tôi quan sát thấy các dịch chiết etylaxetat hầu nh/ không có hoạt tính đối với vi sinh vật kiểm định v8 độc tố tế b8o. Những dịch chiết n8y đều cho phản ứng d/ơng tính với thuốc thử đặc tr/ng của nhóm flavonoit (m8u v8ng rơm với hơi amoniac, m8u hồng với bột manhê trong môi tr/ờng axit HCl) đặc biệt rất rõ ở lá v8 c8nh lấy v8o mùa thu, còn lấy v8o mùa xuân chỉ quan sát thấy nh/l8 dạng vết. Bằng ph/ơng pháp kết tủa phân đoạn, kết hợp phân tách trên sắc ký cột silicagel chúng tôi đL phân lập đ/ợc hai th8nh phần chính v8một th8nh phần phụ đều có m8u v8ng rơm. Dựa v8o các phổ UV trong metanol, FT-IR, EI-MS v8 mẫu đối chứng, th8nh phần phụ đ/ợc nhận dạng l8 kaempferol. Các phổ hồng ngoại của hai th8nh phần chính t/ơng tự nhau, đều cho dải hấp thụ mạnh ở vùng 3388 - 3248 cm-1, đó l8 dấu hiệu của các nhóm hidroxyl có liên kết cầu hidro nội phân tử, trong khi đó các nhóm cacbonyl (1662 - 1653 cm-1) xuất hiện ở tần số thấp với c/ờng độ trung bình cũng nh/ hấp thụ yếu ở vùng 2800 -3000 cm-1 (CH, CH2, CH3) cho thấy cả hai chất n8y thuộc nhóm flavon. Các phổ hấp thụ tử ngoại trong metanol của chúng cũng đều cho các cực đại quanh vùng 270 nm v8 330 nm đặc tr/ng cho nhóm chất flavon [8]. Cả hai flavonoit nói trên không bị thủy phân trong dung dịch HCl 2N ở 1000C v8 các tính chất phổ UV, IR, của chúng không thay đổi đL chỉ ra đó l8 những flavon-C-glucosit. Trong phổ FAB-MS của hai chất n8y đều quan sát thấy các ion phân tử "giả" có m/z 433 (M + H)+, 456 (M + Na)+, 471 (M + K)+, vậy khối l/ợng phân tử của chúng đều l8 432 amu. Các phổ 13C-NMR v8 kỹ thuật DEPT của chúng cho biết, phân tử của mỗi chất đều có 21 nguyên tử cacbon, gồm: một nhóm CH2, 11 nhóm CH, 9 nhóm cacbon bậc 4 v8 ho8n to8n t/ơng tự nhau. Các dữ liệu phổ MS v813C-NMR đL chứng tỏ các flavon-C-glucosit n8y có công thức nguyên phải l8 C21H21O10 v8 phù hợp với apigenin-C-glucosid [8]. Phổ 1H-NMR của mỗi chất đều chỉ ra sự có mặt của 6 proton thơm, 3 nhóm hidroxy phenolic, 1 proton "anome" ở vùng tr/ờng cao (4,59 - 4,69 ppm). Các tín hiệu còn lại nằm trong vùng 3,21 - 4,10 ppm xen phủ lẫn nhau khá phức tạp, hợp bởi 10 proton của gốc đ/ờng hexopyranosa. Trong [8] đL chỉ ra tín hiệu proton "anome" l8 một doublet ở vùng tr/ờng cao (4,7 - 4,5 ppm) với hằng số t/ơng tác 9 - 10 Hz l8 dấu hiệu đặc tr/ng t/ơng ứng với -8-C--D-glucopyranosit v8 -6-C--D-glucopyranosit. Nh/ vậy, một trong 2 flavonoit-C-glucosit sẽ phải l8 apigenin-8-C--D-glucopyranosit hay Vitexin, chất còn lại sẽ l8 apigenin-6-C--D-glucopyranosit hay isovitexin. Việc phân tích các dữ liệu phổ 1H- v813C-NMR, HMQC, HMBC, ghi trong bảng cho phép chỉ ra cấu trúc của vitexin v8 isovitexin. 190IV - Kết luận 1. Lần đầu tiên phân lập đ/ợc kaempferol v8 2 chất flavonoit-C-glucosit từ lá cây Croton tonkinensis. 2. Dựa v8o các đặc tr/ng hóa học v8 các phổ FT-IR, FAB-MS, 1H- v813C-NMR đL nhận ra chúng l8 4',5,7-trihidroxy-flavon-8-C--D-glucopyranosit (vitexin) v8 4',5,7-trihidroxy-flavon-6-C--D-glucopyranosit (isovitexin). Công trình đDợc ho&n th&nh với sự trợ giúp kinh phí của Hội đồng Khoa học tự nhiên.Ti liệu tham khảo 1. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc v8 vị thuốc Việt Nam (in lần thứ 8), Nh8 xuất bản Y học, H8 Nội, Tr. 907 - 908 (1999). 2. Bế Thị Thuấn, Tr/ơng Văn Nh/. Tạp chí D/ợc học, T. 31, số 5, Tr. 11 - 12 (1991). 3. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Ho8ng Ngọc, Chu Đình Kính. Tuyển tập công trình khoa học Hội nghị khoa học về Công nghệ hóa hữu cơ to8n quốc lần thứ hai, Hội Hóa họcViệt Nam, Phân hội Hóa Hữu cơ, H8 Nội, Tr. 297 - 300 (2001). 4. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Ho8ng Ngọc. Tạp chí D/ợc học, T. 42, số 12, Tr. 8 - 9 (2002). 5. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Ho8ng Ngọc, Trần Quang H/ng, Chu Đình Kính. Tạp chí Phân tích lý, hóa, sinh (nhận đăng 2004). 6. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Ho8ng Ngọc, Tạp chí Hóa học, T. 41, số 2, Tr. 104 - 109. (2003). 7. Phan Minh Giang, Jung Joony Lee, Phan Tong Son. Tạp chí Hóa học, T. 41, số 1, Tr. 1 (2003). 8. J. B. Harborn. The Flavonoids - Advance in research in 1986, C & H, London - New York, P. 466 - 470 (1994). 9. Charman & Hall/ CRC From DNP on CD-ROM, Version 11.11982-1983. 10. Phạm Ho8ng Ngọc, Phạm Thị Hồng Minh, Trần Vân Hiền, Phạm Mạnh Hùng. Tuyển tập báo cáo Hội nghị Hóa học to8n quốc lần thứ 3, H8 Nội, tập 1, Tr. 103 - 105 (1998). . 187Tạp chí Hóa học, T. 42 (2), Tr. 187 - 190, 2004 Phân lập và nhận dạng một số flavonoit từ cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.). (HPLC), với đầu dò DAD đL phát hiện thấy 3 flavonoit chủ yếu. Một trong 3 chất n8y đL đ/ợc phân lập v8 nhận dạng l8 tilirosit, đó l8 kaempferol- 3-O--D-(6"-O-coumaroyl)-glucopyranosit.