Đang tải... (xem toàn văn)
- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mà ngƣời ta đã tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau khá xa về mặt di truyền bằng[r]
(1)BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TRƯỜNG CAO ĐẲNG NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BẮC BỘ
………****………
GIÁO TRÌNH
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT
(2)Chƣơng KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1 Giới thiệu chung
Công nghệ tế bào thực vật công nghệ quan trọng cơng nghệ sinh học, tảng để nghiên cứu áp dụng công nghệ khác lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp Hiện nay, từ thành tựu công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy hạt phấn ứng dụng nhiều vào lĩnh vực trồng trọt, nhƣ:
- Nhân nhanh vô tính giống q: từ mẫu ni cấy ngƣời ta tạo hàng triệu nhƣ đủ thời gian cấy chuyển Tuy nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc tuỳ giống, cấy chuyển nhiều lần tạo nhiều biến dị Ví dụ, nhà khoa học kết luận từ chồi dứa đƣa vào ni cấy ống nghiệm nhân hàng triệu dứa giống; từ chồi chuối đƣa vào ni cấy nhân 2.000 chuối giống, qua số có tỷ lệ biến dị cao
- Cải lƣơng giống trồng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristerm): để phục tráng giống quý nhiễm virus ngƣời ta ni cấy đỉnh sinh trƣởng để nhân nhanh Qua số lần nuôi cấy theo kiểu tạo đƣợc hoàn toàn bệnh từ nhiễm virus
- Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn nuôi cấy tế bào hạt phấn: Ngƣời ta ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn hạt phấn để tạo đơn bội từ bao phấn hạt phấn, sau lƣỡng bội hố tạo thành dịng đồng hợp tử Kĩ thuật thành công nhiều họ cà
- Khắc phục lai xa cách thụ phấn ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi: Nhờ nuôi cấy ống nghiệm khắc phục tính bất hợp giao tử trƣớc sau thụ tinh lai khác xa mặt di truyền
- Lai vơ tính cịn gọi dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mà ngƣời ta tạo thành lai từ giống khác xa mặt di truyền cách dùng enzim để hoà tan màng tế bào cho tế bào trần (không cịn màng) vào ni cấy chung mơi trƣờng nhân tạo chúng phát triển thành khối mô sẹo (callus), từ chuyển khối callus sang mơi trƣờng phân hố chức tế bào để ni cấy thành lai
Sơ lược lịch sử phát triển
(3)xƣớng học thuyết sinh học gọi Học thuyết tế bào: + Mọi thể sống đƣợc cấu tạo nhiều tế bào
+ Tế bào đơn vị cấu trúc chức thể sống, hình thức nhỏ sống
+ Tế bào đƣợc tạo từ tế bào tồn trƣớc
Năm 1875, Oscar Hertwig chứng minh quan sát kính hiển vi thụ thai hợp nhân tinh trùng nhân trứng Sau đó, Hermann P., Schneider F.A Butschli O mô tả xác q trình phân chia tế bào Năm 1883, Wilhelm Roux lần lý giải phân bào giảm nhiễm quan sinh dục Từ tế bào thực vật ni cấy in vitro tái sinh thành thể sống hoàn chỉnh Khả tế bào thực vật đƣợc gọi tính tồn Năm 1902, Haberlandt lần thí nghiệm nuôi cấy mô mầm nhƣng không thành công Năm 1934, Kogl lần xác định đƣợc vai trò IAA, hoocmon thực vật thuộc nhóm auxin có khả kích thích tăng trƣởng phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) cà rốt thuốc lá, mơ sẹo có khả sinh trƣởng liên tục Năm 1941, Overbeek cs sử dụng nƣớc dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Datura Năm 1955, Miller cs phát minh cấu trúc sinh tổng hợp kinetin - cytokinin đóng vai trị quan trọng phân bào phân hố chồi mô nuôi cấy Đến năm 1957, Skoog Miller khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ chất auxin: cytokinin môi trƣờng phát sinh quan (rễ chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ nhỏ, mơ có xu hƣớng tạo chồi Ngƣợc lại nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn lớn, mơ có xu hƣớng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin cytokinin thích hợp kích thích phân hố chồi rễ, tạo hoàn chỉnh
(4)Năm 1960, Cocking lần sử dụng enzym phân giải thành tế bào tạo số lƣợng lớn tế bào trần Kỹ thuật sau đƣợc hồn thiện để tách ni tế bào trần nhiều trồng khác Năm 1971, Takebe cs tái sinh đƣợc từ tế bào trần mô thịt (mesophill cell) thuốc Năm 1972, Carlson cs lần thực lai tế bào sơma lồi, tạo đƣợc từ dung hợp tế bào trần loài thuốc Nicotiana glauca N langsdorfii Năm 1978, Melchers cs tạo đƣợc lai soma "Cà chua Thuốc lá" lai xa tế bào trần Đến nay, việc tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào trần từ lai tế bào trần thành công nhiều loài thực vật
Năm 1964, Guha Maheshwari lần thành công tạo đƣợc đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà Datura Kỹ thuật sau đƣợc nhiều tác giả phát triển ứng dụng rộng rãi tạo dòng đơn bội (1x), dòng nhị bội kép (2x), cố định ƣu lai (nuôi cấy bao phấn hạt phấn dòng lai F1 để tạo giống mang tính trạng ƣu lai)
Năm 1959, Tulecke Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy mơ lớn (134 lít) ni cấy chìm Năm 1977, Noguchi cs ni cấy tế bào thuốc bioreactor dung tích lớn 20,000 lít Năm 1978, Tabata cs nuôi tế bào thuốc quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Họ chọn lọc đƣợc dòng tế bào cho sản lƣợng sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao Năm 1985, Flores Filner lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ Hyoscyamus muticus Những rễ sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine tự nhiên Hiện nay, công nghệ ni cấy tế bào mơ (ví dụ, mơ rễ nhân sâm) bioreactor dung tích lớn đƣợc thƣơng mại hố mức cơng nghiệp để sản xuất sinh dƣợc
Năm 1981, sở quan sát biến dị xảy phổ biến nuôi cấy mô tế bào với phổ biến dị tần số biến dị cao, Larkin Scowcroft đƣa thuật ngữ "biến dị dòng soma" (Somaclonal Variation) để thay đổi di truyền tính trạng xảy nuôi cấy mô tế bào in vitro Từ dòng tế bào biến dị di truyền ổn định nhân nhanh, tạo dịng giống đột biến có suất, hàm lƣợng hoạt chất hữu ích cao, kháng số điều kiện bất lợi nhƣ bệnh, mặn, hạn,…
1.2 Học thuyết tế bào
(5)Schleiden (nhà thực vật học) 1839, Theodor Schwann (nhà động vật học) thức xây dựng học thuyết tế bào Schleiden Schwann khẳng định rằng: Mỗi thể động thực vật bao gồm thể tồn hoàn toàn độc lập, riêng rẽ tách biệt, tế bào Có thể nói Schleiden Schwann hai ông tổ học thuyết tế bào Tuy nhiên, hai ông tác giả phát biểu nguyên tắc đó, mà diễn đạt nguyên tắc rõ ràng hiển nhiên tới mức đƣợc phổ biến rộng rãi cuối đƣợc đa số nhà sinh học thời thừa nhận 1.2.1 Tính tồn tế bào (cell totipotency)
Haberlandt (1902) ngƣời đề xƣớng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính tồn tế bào Theo ơng tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh.Nhƣ tế bào riêng rẽ thể đa bào chứa đầy đủ tồn lƣợng thơng tin di truyền cần thiết sinh vật gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể sinh vật hoàn chỉnh Hơn 50 năm sau, nhà thực nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt đƣợc thành tựu chứng minh cho khả tồn phát triển độc lập tế bào Tính tồn tế bào thực vật đƣợc bƣớc chứng minh Nổi bật cơng trình: Miller Skoog (1953) tạo đƣợc rễ từ mảnh mô cắt từ thân thuốc lá, Reinert Steward (1958) tạo đƣợc phôi cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy dung dịch, Cocking (1960) tách đƣợc tế bào trần Takebe (1971) tái sinh đƣợc hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần thuốc Kỹ thuật tạo dòng (cloning) tế bào đơn đƣợc phân lập điều kiện in vitro chứng minh thực tế tế bào soma, dƣới điều kiện thích hợp, phân hóa để phát triển thành thể thực vật hoàn chỉnh Sự phát triển thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) kết hợp phân chia phân hóa tế bào Để biểu tính tồn thế, tế bào phân hóa trải qua giai đoạn phản phân hóa (dedifferentiation) sau giai đoạn tái phân hóa (redifferentiation) Hiện tƣợng tế bào trƣởng thành trở lại trạng thái phân sinh tạo mô callus không phân hóa (undifferentiation) đƣợc gọi phản phân hóa, khả để tế bào phản phân hóa tạo thành hoàn chỉnh (whole plant) quan thực vật đƣợc gọi tái phân hóa Ở động vật, phân hóa khơng thể đảo ngƣợc trở lại Nhƣ vậy, phân hóa tế bào kết phát triển thể bậc cao, thƣờng đƣợc gọi cytodifferentiation
1.2.3 Thể bội gen
(6)Hai gen nằm vị trí định nhiễm sắc thể tƣơng đồng gọi allen Tuy tham gia định tính trạng nhƣng allen qui định đặc điểm riêng Ví dụ màu hoa, allen mang thơng tin di truyền cho hoa màu đỏ , allen cho hoa màu trắng.Trƣờng hợp ta có cá thể dị hợp tử tính trạng màu hoa, allen mang thơng tin di truyền cho màu đỏ ta có cá thể đồng hợp tử Đối với cá thể dị hợp tử, allen allen trội, allen lại allen lặn Allen trội định tính trạng Có trƣờng hợp trội hồn tồn trội khơng hồn tồn Trội khơng hồn tồn tổ hợp allen cho tính trạng trung gian
Thể bội danh từ số nhiễm sắc thể có tế bào, mơ, cá thể thực vật với qui định chung tế bào sinh sản có nhiễm sắc thể đƣợc gọi thể đơn bội Hợp tử, sản phẩm dung hợp giao tử đơn bội, nhị bội với số nhiễm sắc thể 2n Tất tế bào soma hình thành phân chia hợp tử nhị bội Trên thực tế tìm thấy lúc nhiều mức bội thể khác mô khác thể thực vật.(4n, 8n) Đólà tƣợng đa bội hóa nội giảm phân Khoảng nửa thực vật bật cao mức đa bội thể Số nhiễm sắc thể loài X ( số đơn bội nhỏ dãy đa bội), cá thể có X nhiễm sắc thể đƣợc gọi thể bội để phân biệt với thể đơn bội
Ví dụ : lúa mì có 2n=42 Trên thực tế thể lục bội 6X, số nhiễm sắc thể loài X=7 Thể đơn bội lúa có n=3X=21 nhiễm sắc thể 1.2.4 Thể bào tử thể giao tử
Thể bào tử gồm có hợp tử tất tế bào sản sinh từ hợp tử kể hạt phấn túi phấn noãn Thể giao tử gồm có hạt phấn nảy mầm tất tế bào sản sinh ra, bao gồm giao tử Khi giao tử khác giống dung hợp, thể bào tử 2n đƣợc tái lập Ở thực vật bậc cao, thể giao tử thƣờng không tế bào tế bào giao tử
Ở thực vật bậc cao, thể giao tử ( trƣờng hợp đặc biệt, phát triển thành bào tử đơn bội) chứa n nhiễm sắc thể Thể bào tử đơn bội hoa nhƣng bào tử hình thành khơng có sức sống Tạo thể bào tử đơn bội đơn bội kép mục đích ni cấy túi phấn hạt phấn
1.2.5 Sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính
(7)thể khác kiểu nhƣ tảo lam Một số khác có hẳn loại tế bào sinh sản riêng nhƣng mà hồn tồn khơng có tính chất giới tính mà từ thể mẹ tạo mà thơi Đó tƣợng sinh sản vơ tính bào tử Bào tử thể đơn bào mơi trƣờng bất lợi chúng tự rút nƣớc khỏi tế bào, trở thành dạng tiềm sinh đợi thời để sống lại Ở sinh vật đa bào túi đựng tế bào gọi bào tử vơ tính Đến mùa sinh sản chúng phát tán tế bào môi trƣờng xung quanh Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử tạo thể Ở thực vật khác, tồn hai kiểu sinh sản vơ tính hữu tính Sinh sản vơ tính từ phần thể mẹ tách tạo thể
Sinh sản hữu tính phải có tham gia yếu tố quy định giới tính, bao gồm đực Các yếu tố thể hay khác thể, chất yếu tố nhiễm sắc thể giới tính quy định Sinh sản hữu tính có nhiều kiểu Kiểu sơ khai tiếp hợp, tƣợng hai tế bào đực, trao đổi nhân cho Sau sinh sản hữu tính bào tử nhƣ rêu, dƣơng xỉ, Lên tới lớp thụ tinh với tham gia giao tử đực cái, loại giao tử nằm tế bào khác
1.3 Cấu trúc tế bào thực vật
(8)các hydrolyse, catalase photphatase Phần bào tan muốn đề cập đến lipid chung quanh tất cấu trúc nhân màng tế bào Lục lạp (chloroplast) vị trí quang hợp tế bào thực vật, chứa chlorophyll sắc tố lục phản ứng với ánh sáng để sản xuất carbohydrate Nhân (nuclear) trung tâm điều khiển tế bào chứa DNA để phiên mã dịch mã thành protein Các protein tổng hợp đƣợc xếp đóng gói túi máy Golgi Nội sinh chất (endoplasmic reticulum) mạng lƣới ống nhỏ nối liền phần khác tế bào Ribosome đƣợc tập trung bề mặt mạng lƣới nội sinh chất tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp protein Ty thể (mitochondrion) chứa vật liệu di truyền nhiều enzyme quan trọng trao đổi chất tế bào
Hình 1.1 Cấu trúc tế bào thực vật
1.4 Môi trường nuôi cấy
Mặc dù nhu cầu dinh dƣỡng loại mô nuôi cấy khác nhƣng môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật đặc trƣng chứa thành phần sau:
- Các nguyên tố đa lượng Bao gồm loại muối nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium sulfur Đây sáu nguyên tố cần thiết cho sinh trƣởng thực vật bậc cao
(9)- Các phụ gia hữu cơ. Một lƣợng nhỏ loại vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), amino acid (thƣờng cho phép bỏ qua nhƣng số trƣờng hợp đặc biệt dùng), phụ gia hữu không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nƣớc dừa…)
- Các chất kích thích sinh trưởng thực vật. Thành phần phụ gia quan trọng định kết nuôi cấy chất điều hòa sinh trƣởng Các auxin (IAA dạng tƣơng tự đƣợc tổng hợp nhân tạo nhƣ 2,4-D , NAA , IBA , …), cytokinin (zeatin, 2i-P dạng tƣơng tự đƣợc tổng hợp nhân tạo nhƣ kinetin, BA …) nhóm chất kích thích sinh trƣởng phát sinh hình thái chủ yếu nuôi cấy mô quan thực vật
- Nguồn carbon. Thƣờng sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon đƣợc thực vật cố định từ khí quang hợp Trong đa số thí nghiệm ni cấy, tế bào thực vật khả quang hợp Glucose thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng cho hiệu tƣơng đƣơng sucrose, fructose cho hiệu
(10)Bảng 1.1 Thành phần môi trƣờng Murashige Skoog (1962)
CÂU HỎI ÔN TẬP
1 Tóm tắt sơ lƣợc lịch sử phát triển cơng nghệ sinh học nói chung cơng nghệ tế bào thực vật nói riêng
2 Trình bày tính tồn tế bào (cell totipotency)
3 So sánh hình thức sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính thực vật Mơ tả cấu trúc tế bào thực vật
(11)Chương THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY PHÔI IN VITRO
2.1.Phơi soma
Đƣợc hình thành khơng thơng qua q trình tạo mơ sẹo đƣợc gọi phơi vơ tính, tế bào phơi vơ tính đƣợc tạo trực tiếp nhân sinh khối hệ thống ni cấy thích hợp Những tế bào phơi vơ tính có khả tái sinh thành hoàn chỉnh đƣợc dùng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo với lớp bao alginate Phôi vô tính đƣợc xem nhƣ kỹ thuật mang lại nhiều hiệu cao nhân giống trồng
2.1.1 Sự phát sinh phôi soma
Những tế bào phôi hợp tử biểu đƣợc gen cần thiết cho chƣơng trình phát triển phơi Giai đoạn trƣớc hình thành tế bào phôi soma đƣợc gọi tế bào tiền phôi Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi phát sinh tế bào phơi trực tiếp
Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích sinh trƣởng, nhiều tế bào cần Auxin để tiến hành phân bào trƣớc phát sinh tế bào phơi Có nhiều tế bào hình thành phơi từ mô sẹo, trƣờng hợp phát sinh phôi soma đƣợc tiến hành gián tiếp
Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) tế bào phát sinh phôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, nhƣng thực chất trình tiếp nối nhau, kết thúc phát triển hệ thống tế bào phôi (EC- Embryogenic cell)
Những tế bào mơ có quan hệ với sinh sản nhƣ hạt phấn, chồi mầm có khả hệ thống tế bào phôi dễ dàng tế bào mơ trƣởng thành Khi mơ có chứa tế bào phơi, kích thích phân chia tế bào giai đoạn cần thiết để trì tình trạng phơi hình thành tế bào phơi soma
Tế bào sinh phơi hệ thống tế bào bình thƣờng đƣợc ni cấy mơi trƣờng có auxin khơng có cytokinin Lƣợng cytokinin có tế bào cao thƣờng phát sinh phôi thấp Khi tế bào phôi đƣợc thu nhận, có mặt auxin gây tổn hại đến pt bt phôi Những nhân tố khác ah đến pt phôi nhƣ tỉ lệ đạm amonium nitrate môi trƣờng pH thấp Hay lặp lặp lại chu kì phát sinh phơi bị phá vỡ giảm hay bỏ hẳn auxin khỏi môi trƣờng
(12)là đƣờng phát sinh phơi khơng qua q trình tạo mô sẹo IDEC đƣờng thong qua trình tạo mơ sẹo
Có bƣớc dẫn đến hệ thống phôi:
Sự biệt hố tế bào có khả phát sinh phôi Sự phát triển tế bào phơi hệ thống Nhƣ có hai mơi trƣờng cần thiết cho nuôi cấy phôi: Môi trƣờng cần cho phát sinh tế bào phôi
Môi trƣờng cần cho phát triển tế bào thành tế bào có khả phát sinh phôi
Bƣớc cần có mặt auxin bƣớc phải giảm thấp hay khơng có mặt auxin Có hai yếu tố quan trọng phát sinh phôi: Auxin nitrogen
Phát sinh phôi soma kiểu mẫu tính tồn thế, khảo sát tồn tiến trình biệt hố tế bào nhƣ chế thể tính tồn tế bào thực vật
2.1.2 Thiết lập hệ thống phát sinh phôi đồng hiệu suất cao
Một hệ thống thích hợp đƣợc thiết lập cho mục đích nghiên cứu qua việc dùng tế bào dung dịch huyền phù cà rốt Những cụm tế bào phôi đƣợc chọn lọc sau lọc qua lƣới để loại bỏ cụm tế bào to đƣợc ly tâm dung dịch Ficoll đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng auxin có zeatin (10-7M) Phát sinh phơi
đồng xảy từ cụm tế bào có tần suất khoảng 90% phát sinh phôi Hệ thống cho thấy thích hợp để nghiên cứu tiến trình phát sinh phơi từ cụm tế bào có khả phát sinh phôi, đƣợc gọi cụm tế bào giai đoạn Tuy nhiên từ cụm tế bào biệt hố tạo phơi mơi trƣờng có auxin khơng có chất khác, phát sinh phơi ghi nhận đƣợc thơng qua xác định cụm tế bào có khả phát sinh phơi giai đoạn Nhƣ tiến trình hình thành cụm tế bào giai đoạn từ tế bào đơn quan trọng để phân tích tiến trình phát sinh phôi Một hệ thống đƣợc yêu cầu có tần suất phát sinh phơi cao từ tế bào đơn
(13)đoạn đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng khơng có auxin cho thấy khả thể tính tồn thế, ngƣợc lại; tế bào giai đoạn đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có auxin đƣợc cấy chuyển sang mơi trƣờng khơng có auxin biệt hóa hình thành phơi với tần suất cao, thể đƣợc tính tồn
2.2 Tính bất hợp giao tử trước sau thụ tinh
2.2.1 Tính bất hợp giao tử trước thụ tinh
- Thụ phấn (pollination): Là tiếp nhận hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để thực thụ tinh hoa Ở thực vật hạt kín có hai phƣơng thức thụ phấn thụ phấn chéo tự thụ phấn
- Thụ tinh (fertilization): Ở thực vật, thụ tinh kết hợp hai giao tử đực (tinh trùng noãn) thành hợp tử (phôi, bào tử hạt) đặc trƣng sinh sản hữu tính, sinh sản lƣỡng tính Ở thực vật hạt kín có phƣơng thức thụ tinh kép Trong tự nhiên trình thụ phấn thực vật thƣờng xảy theo trình tự sau: hạt phấn chín rơi lên núm nhụy, nảy mầm tạo ống phấn Ống phấn xuyên dọc theo nhụy tiếp cận tới noãn Lúc hai tinh tử đơn bội (1n) hạt phấn vào tới noãn thực trình thụ tinh kép: Một tinh tử kết hợp với tế bào noãn đơn bội tạo thành hợp tử nhị bội (2n) sau phát triển thành phơi, tinh tử cịn lại kết hợp với tế bào nội nhũ nhị bội tạo hợp bào nội nhũ tam bội (3n) để nuôi phôi
Nếu hạt phấn lạ (khác loài) rơi lên núm nhụy nhụy tạo chất ức chế phát triển ống phấn làm biến dạng ống phấn ngăn cản thụ tinh Đó tính bất hợp giao tử trƣớc thụ tinh
2.2.2 Tính bất hợp giao tử sau thụ tinh
Trong số trƣờng hợp khác, hạt phấn loài lạ rơi lên núm nhụy, ống phấn mọc bình thƣờng trình thụ tinh xảy ra, nhƣng hạt không phát triển đƣợc Nguyên nhân chủ yếu nội nhũ phơi hình thành chế ức chế phát triển phôi Đây trƣờng hợp hay gặp tiến hành lai xa (lai khác loài khác chi)
2.3 Thụ phấn in vitro
Tính bất hợp giao tử khắc phục kỹ thuật thụ phấn ống nghiệm Điều kiện phải ni cấy thành cơng bầu hay nỗn phân lập chủ động điều khiển trình nảy mầm hạt phấn môi trƣờng nuôi cấy vô trùng
(14)các lồi thực vật khơng thể lai phƣơng pháp gây giống trồng truyền thống
Trong tự nhiên, lai khác chi (intergeneric) lai khác lồi (interspecific) khó thành cơng có hàng rào gây trở ngại cho sinh trƣởng ống phấn núm nhụy vòi nhụy Trong trƣờng hợp nhƣ vòi nhụy phần đƣợc tách hạt phấn đƣợc đặt bề mặt vết cắt bầu chuyển qua lỗ thành vòi nhụy đến bầu Kỹ thuật đƣợc gọi thụ phấn bên bầu (intraovarian pollination) đƣợc ứng dụng thành công nhiều loài nhƣ Papaver somniferum, Eschscholtzia californica, Argemone mexicana A ochroleuca Một hƣớng khác nhằm vƣợt qua hàng rào để ống phấn sinh trƣởng thụ phấn trực tiếp noãn in vitro (in vitro ovular pollination) noãn đƣợc tách giá noãn (placenta) gọi thụ phấn giá noãn in vitro (in vitro placental pollination) Thụ phấn giá noãn đƣợc ứng dụng thành cơng để vƣợt qua tính tự bất hợp (self-in
compatibility) Petunia axillaris Các kỹ thuật khác đƣợc phát triển nhằm loại bỏ hàng rào giai đoạn tiền hợp tử để thụ tinh, bao gồm: thụ phấn nụ (bud pollination), thụ phấn gốc (stub pollination), xử lý nhiệt vòi nhụy, chiếu xạ thụ phấn tổ hợp Phát triển hạt thông qua thụ phấn in vitro nỗn trần đƣợc mơ tả nhƣ “thụ tinh ống nghiệm” (test-tube fertilisation), trình tạo hạt nhờ thụ phấn núm nhụy nhụy hoa hồn chỉnh ni cấy in vitro đƣợc xem nhƣ “thụ phấn in vitro” (in vitro pollination) Ở hai trình này, thụ tinh trứng xuất bên noãn giao tử đƣợc phân phối nhờ ống phấn Ngƣợc lại, tƣợng “thụ tinh ống nghiệm” hệ thống động vật đòi hỏi dung hợp in vitro trứng tách rời nhờ tinh tử bơi tự (free floating sperms) gọi giao tử đực Thực tế, giao tử đực thực vật không bơi tự mà đƣợc phân phối nhờ ống phấn Thuật ngữ chung “thụ phấn in vitro” đƣợc dùng cho thụ phấn noãn (ovular pollination-gắn hạt phấn vào noãn tách rời), thụ phấn bầu (ovarian pollination-gắn hạt phấn vào bầu tách rời), thụ phấn giá noãn (placental pollination-gắn hạt phấn vào nỗn đính giá nỗn) thụ phấn núm nhụy (stigmatic pollination-gắn hạt phấn vào núm nhụy) dƣới điều kiện in vitro
Thụ phấn ống nghiệm nghĩa thực trình tạo hợp tử không phụ thuộc vào thể mẹ Công việc bao gồm bƣớc sau:
- Kích thích hạt phấn nảy mầm - Kích thích sinh trƣởng ống phấn - Ni nỗn thụ tinh nỗn - Ni hợp tử thành hạt
(15)tƣợng thuộc họ thuốc phiện (Papaveraceae), họ cẩm chƣớng (Caryophyllaceae) họ cà (Solanaceae) Ở họ bầu chứa nhiều noãn nên tƣơng đối dễ ni cấy Ở họ Hịa thảo (Poaceae) bầu có nỗn khó ni cấy, đồng thời hạt phấn khó kích thích nảy mầm Tuy nhiên, sau gần mƣời năm tập trung nghiên cứu ngƣời ta thu đƣợc số kết đối tƣợng hòa thảo; Sladkas Havel (1976) bƣớc đầu nghiên cứu ngô (Zea mays); Nitzsche Hennig (1976) nuôi thành công bầu Lobium thụ phấn với Festuca; Glunewald (1976) thụ phấn invitro thành cơng nỗn đại mạch hạt phấn mạch đen (Hordeum) lúa mì (Triticum)
2.3.1 Phương pháp thụ phấn in vitro
2.3.1.1 Nguyên liệu
Hình 2.1 Cấu tạo hoa, bầu phơi
Các bầu (ovaries) có nhiều nỗn (ovules) nguyên liệu thực nghiệm tốt Ở loài thuộc họ Solanaceae (Nicotiana tabcum, N alata, N rustica, Petunia hybrida), họ Papaveraceae (Papaver somniferum, Eschscholtzia californica, Argemone mexicana) họ Caryophyllaceae (Melandrium album, M rubrum, Agrostemma githago, Dianthus caryophyllus), giá noãn đƣợc bao phủ hàng trăm noãn Do có số lƣợng lớn nỗn khơng bị tổn thƣơng phân lập giá nỗn, nên góp phần vào thành công thụ phấn in vitro chúng phát triển hạt Một nguyên liệu thay khác hạt phấn (pollen), cần phải tạo sinh trƣởng tốt ống phấn nuôi cấy, nảy mầm hạt phấn in vitro gặp khó khăn số họ nhƣng khắc phục cách ngâm nỗn (ví dụ: Brassica oleracea) ngày trƣớc thụ phấn CaCl2 1% nhân tố thích hợp cho sinh trƣởng ống phấn
(16)năng sống sót nỗn thụ tinh bên túi phơi Sự xâm nhập hoàn toàn ống phấn vào lỗ nỗn quan sát đƣợc kính hiển vi
2.3.1.2 Khử trùng nguyên liệu
Các nụ hoa sử dụng cho nuôi cấy trƣớc bao phấn giai đoạn nứt Các nhụy hoa (pistils) sau loại bỏ đài tràng hoa, bầu riêng rẽ, đƣợc khử trùng sơ cách rửa nhanh với EtOH 70%, khử trùng bề mặt tác nhân thích hợp, cuối rửa nƣớc cất vơ trùng Bầu sau đƣợc bóc vỏ cẩn thận dao mổ, forcep, kim để lộ phần noãn gắn vào giá noãn Giá nỗn hồn tồn, phần có mang noãn, đƣợc dùng thụ phấn giá noãn Để thực thụ phấn núm nhụy in vitro, nhụy đƣợc tách rời khử trùng cẩn thận bề mặt dung dịch khử trùng sau thấm khơ núm nhụy
Hình 2.2 Qui trình ni cấy bao phấn lúa
Phân lập hạt phấn điều kiện vô trùng, bao phấn đƣợc loại bỏ khỏi nụ hoa hoa mở đƣợc giữ đĩa petri có giấy lọc vơ trùng nứt ra, hạt phấn sau đƣợc đặt nỗn ni cấy, giá nỗn núm nhụy tùy thuộc vào chất thí nghiệm Nói chung, hạt phấn đƣợc đặt trực tiếp lên phận nhụy nuôi cấy tốt dàn trải mơi trƣờng chung quanh nỗn
2.3.1.3 Ni cấy nỗn bầu
(17)bằng giấy lọc sau đó, nỗn khô đƣợc phủ hạt phấn Các hạt phát triển từ nỗn có phơi hình cầu phơi già dễ dàng phân biệt, số kết đạt đƣợc Gynandrophát sinhis gynandra, Impatiens balsamina, Nicotiana tabacum Allium cepa Tuy nhiên, noãn sau thụ phấn in vitro mang hợp tử đơn bào (single-celled zygote) cần điều kiện sinh trƣởng phức tạp Kỹ thuật cho noãn tự thụ phấn thụ phấn chéo giống Trong phát triển giai đoạn phát sinh phơi noãn tự thụ phấn thƣờng đƣợc giữ giá noãn tạo thành hạt, ngƣợc lại noãn thụ phấn chéo cần giá noãn từ 6-8 ngày ni cấy Sau đó, chúng đƣợc chuyển tới mơi trƣờng ni khơng có giá nỗn
- Bầu Kỹ thuật nuôi cấy bầu đƣợc phát triển Nitsch (1951), ông nuôi thành công bầu tách từ hoa thụ phấn in vitro để phát triển thành chín (Cucumis Lycopersicum) Các mang hạt nảy mầm đƣợc nhƣng chúng có kích thƣớc nhỏ phát triển điều kiện tự nhiên Các tác giả khác ni cấy thành cơng nỗn tách rời từ số loài (Linaria macroccana, Tropaeolum majus, Iberis amara, Hyoscyamus niger) mơi trƣờng chứa muối khống sucrose
Bổ sung vitamin B vào môi trƣờng giúp đạt kích thƣớc bình thƣờng hạt nảy mầm đƣợc Các môi trƣờng nuôi cấy ngày giàu dinh dƣỡng bổ sung IAA nƣớc dừa, chí cho có kích thƣớc lớn hình thành điều kiện in vivo (Anethum graveolens)
(18)Hình 2.3 Qui trình nhân nhanh giống rừng nuôi cấy phôi từ hạt 2.3.2 Các nhân tố ảnh hưởng hình thành hạt sau thụ phấn in vitro
2.3.2.1 Trạng thái sinh lý mẫu vật
Trạng thái sinh lý nhụy thời điểm tách rời noãn ảnh hƣởng đến hình thành hạt sau thụ phấn in vitro Bề mặt noãn núm nhụy (trong thụ phấn núm nhụy) ẩm ƣớt ảnh hƣởng xấu đến nảy mầm hạt phấn phát triển ống phấn hình thành hạt Sự nảy mầm hạt phấn núm nhụy sinh trƣởng ống phấn dọc theo vịi nhụy có ảnh hƣởng đến tổng hợp protein, nhân tố đơi ức chế hồn tồn ống phấn bầu Do đó, cần phải xác định phận nhụy tồn hàng rào ngăn cản Để cải thiện khả thụ phấn in vitro, mức độ bất hợp phải đƣợc giảm xuống cách tách phận tổng hợp protein ức chế thụ phấn trực tiếp phần lại nhụy dƣới điều kiện thí nghiệm
Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hƣởng đến hình thành hạt sau thụ phấn in vitro Các noãn đƣợc tách sau nở hoa từ 1-2 ngày cho khả hình thành hạt cao tách nỗn vào ngày hoa Ở ngơ bông, thụ phấn in vitro sau xuất râu tơ từ 3-4 ngày cho kết tạo hạt tốt
(19)Maheshwari (1958) nuôi cấy thành cơng nỗn mơi trƣờng dinh dƣỡng bao gồm muối khoáng theo Nitsch, vitamin theo White , 5% sucrose Noãn Papaver rhoeas P somniferum đƣợc tách ngày sau thụ phấn (DAP- days after pollination) thu đƣợc hợp tử tiền phơi có hai tế bào (two-celled proembryo) chứa vài nhân nội nhũ (endosperm nuclei) Sinh trƣởng phôi giai đoạn đầu thấp nhƣng sau giai đoạn hình cầu sinh trƣởng nhanh đạt kích thƣớc 0,93 mm so với 0,65 mm phôi in vivo Bổ sung kinetin CH cần thiết để kích thích sinh trƣởng ban đầu phơi Một số nỗn hoa lan (orchids) đƣợc phân lập từ bầu thụ phấn sinh trƣởng tốt dung dịch đơn giản có sucrose 10%, nhƣng nỗn Zephyranthes (mang hợp tử nhân nội nhũ sơ cấp) cần bổ sung nƣớc dừa casamino acid vào môi trƣờng Nitsch Ở Trifolium repens, noãn (1-2 DAP) phát triển thành hạt trƣởng thành môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung dịch chiết loại non nhƣ dƣa chuột dƣa hấu
Trong nuôi cấy in vitro noãn đƣợc thụ phấn hầu hết lồi mơi trƣờng Nitsch có cải biến đƣợc sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, môi trƣờng Steward Hsu (S-H) thích hợp cho ni cấy thể lai loài khác loài sau thụ tinh nỗn non Mơi trƣờng ni cấy chứa IAA 10 µg/L kinetin 0,1 µg/L làm tăng số lƣợng hạt đƣợc tạo thành từ noãn Nồng độ cao kinetin thƣờng gây ức chế
Nguồn nitrogen (hỗn hợp amino acid hồn chỉnh) khơng ảnh hƣởng đến tần số thụ tinh bầu ngô đƣợc thụ phấn in vitro, nhƣng cần thiết cho sinh trƣởng phát triển tối thích hạt
Áp lực tthẩm thấu môi trƣờng ảnh hƣởng đến phát triển nỗn tách rời, nỗn chứa phơi hình cầu phát triển thành hạt trƣởng thành môi trƣờng chứa sucrose từ 4-10%, nhƣng noãn non đƣợc thụ tinh có hợp tử vài nhân nội nhũ, noãn vừa thụ tinh cần 6% 8% sucrose
2.3.2.3 Điều kiện nuôi cấy
(20)Bảng 2.1 Môi trƣờng Nitsch-sử dụng phổ biến ni cấy nỗn thụ phấn in vitro
2.3.2.4 Kiểu gen
Phản ứng bầu in vitro mối liên quan với hình thành hạt tùy thuộc vào loài Hạt phấn lồi họ cải khó nảy mầm ni cấy ngƣời ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp cách nhúng noãn Brassica oleracea dung dịch CaCl2 1%, sau gieo chúng lớp gelatin 10% mỏng (10 µm) thụ phấn với hạt phấn Lớp gelatin mỏng đƣợc bảo quản đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp Sau 24 ni, nỗn đƣợc thụ tinh chuyển lên mơi trƣờng Nitsch có agar tạo hạt
2.3.3 Ứng dụng thụ phấn in vitro
Đƣợc ứng dụng lĩnh vực: vƣợt qua tự bất hợp (self-in compability), vƣợt qua bất hợp lai (cross-inuôi cấyompability) giao tử sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis)
Các loài Petunia axillaris P hybrida tự bất hợp Hạt phấn nảy mầm tốt nhụy đƣợc tự thụ phấn nhƣng tồn hàng rào ngăn cản bầu cản trở phát triển ống phấn, làm cho ống phấn khơng thể thụ tinh với nỗn Các hàng rào taxon đƣợc vƣợt qua thụ phấn in vitro hình thành hạt xuất bình thƣờng Ở lồi P axillaris tính bất hợp vƣợt qua nhờ thụ phấn nụ hoa in vivo (in vivo bud pollination)