Đang tải... (xem toàn văn)
• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983... Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq polymerase, là mộ[r]
(1)CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014)
(2)CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
1 Chức ứng dụng enzyme giới hạn
2 Giới thiệu vector nhân dòng kỹ thuật nhân dòng gen
3 Các phương pháp lai phân tử
4 Phương pháp PCR, ứng dụng
5 Kỹ thuật xác định trình tự DNA
6 Kỹ thuật tạo thư viện genome cDNA
2
(3)PCR
Polymerase Chain Reaction
(4)Sự phát minh kỹ thuật PCR
• Kỹ thuật PCR hay cịn gọi phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase Kary Mullis phát minh vào năm 1983
• Hai năm sau (1985), phát minh thức cơng bố tạp chí khoa học quốc tế
• Với cơng trình này, Kary Mullis tặng giải thưởng Nobel hóa học năm 1993
“Sự phát minh kỹ thuật xứng đáng được coi bước ngoặt hay một kỹ thuật
mang tính cách mạng thúc đẩy phát triển
của Công nghệ sinh học đại” (J Watson)
(5)Kỹ thuật PCR phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn đoạn DNA
5 Khái niệm
(6)• Kỹ thuật PCR dựa xúc tác
enzyme DNA polymerase để nhân
một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ hai mạch đơn đoạn DNA
Kỹ thuật phát minh nhờ phát ra Taq polymerase, DNA polymerase từ vi
khuẩn Thermus aquaticus sống suối nước
nóng
(7)(8)• DNA khn: mang trình tự cần nhân lên
• mồi tổng hợp oligonucleotide (mồi xi mồi ngược)
• dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• Polymerase chịu nhiệt
• Mg2+: cofactor của enzyme
• Dung dịch đệm: ổn định pH lực ion dung dịch phản ứng cho phù hợp với hoạt động enzyme
(9)Có giai đoạn phản ứng PCR
chúng được lặp lại từ 20-40 lần Việc tự
động hóa nhờ Thermo cycler, thiết bị có khả tăng giảm nhiệt độ ống phản ứng thời gian ngắn
1. Biến tính (denaturation): hai sợi chuỗi xoắn kép
được duỗi xoắn tách rnhờ nhiệt cao (94-95oC)
2. Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng
giảm xuống (55-50oC) để mồi gắn vào sợi DNA
tương ứng theo nguyên tắc bổ sung base
3 Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA
được thực nhờ enzyme DNA polymerase (65-75oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ
sung với sợi khuôn từ đầu 3’ –
(10)Chu kỳ phản ứng PCR gồm bước lặp lặp lại nhiều lần Nhờ vậy, vài ta thu hàng triệu copy đoạn DNA đó, đủ cho mục đích thí nghiệm khác
10 Chu kỳ phản ứng PCR
Hỗn hợp phản ứng PCR GĐ GĐ GĐ
Bắt đầu chu kỳ
(2) Nhắc nhắc lại n chu kỳ
Thời gian (phót)
N h iƯt ® é (oC )
Chu kỳ nhiệt:
Bước 1: 94o C, 30 giây
Bước 2: 94o C, 15 giây
Bước 3: 55o C, 30 giây
Bước 4: 72o C, 1.5 phút
Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 35 lần
Bước 6: 72o C, 10
Bước 7: 4o C f- bảo quản