Nghiên cứu chiết xuất một số hợp phần từ lá đu đủ caricapapayal và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn chất chiết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ***** ĐỖ SƠN TÙNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT SỐ HỢP PHẦN TỪ LÁ ĐU ĐỦ CARICA PAPAYA L VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CHẤT CHIẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên Hà Nội, 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: .1 Mục đích yêu cầu: Mục đích nghiên cứu: Yêu cầu: ………………………………………………………………………… CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu chung đu đủ I.1.1 Nguồn gốc phân bố [26]…………………………………………………… I.1.2 Phân loại:……………………………………………………………………… I.1.3 Tình hình diện tích trồng sản xuất đủ đủ……………………… I.1.4 Đặc tính thực vật giống đu đủ trồng Việt Nam [12]………………… I.1.5 Thành phần hóa học tính chất dược lý đủ đủ………………… I 1.5.1 Thành phần hóa học đủ đủ [6][23]……………………………… I.1.5.2 Một số dược tính đủ đủ [6]………………………………… I.2 Giới thiệu chung hợp chất: flavonoid alkaloid 10 I.2.1 Tổng quan flavonoid [2][3][13]…………………………………………… 10 I.2.1.1 Khái niệm:…………………………………………………………… .10 I.2.1.2 Phân bố:………………………………………………………………… 10 I.2.1.3 Phân loại:………………………………………………………………… 11 I 2.1.4 Tính chất flavonoid……………………………………………………11 I.2.2 Tổng quan alkaloid [9][13][19] 13 I.2.2.1 Khái niệm:………………………………………………………………… 13 I.2.2.2 Phân bố:………………………………………………………………… 13 I.2.2.3 Phân loại:………………………………………………………………… 13 I.2.2.4 Tính chất alkaloid…………………………………………………… 14 I.3 Tình hình nghiên cứu chống ung thư đu đủ 16 I.3.1 Các nghiên cứu giới………………………………………………… 16 I.3.2 Các nghiên cứu nước…………………………………………………… 17 I.4 Các phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật[1][28] 17 I.4.1 Phương pháp ngâm dầm dung môi………………………………… … 19 I.4.2 Phương pháp ngâm kiệt đơn giản…………………………………………… 20 I.4.3 Phương pháp ngâm kiệt phân đoạn…………………………………………… 21 I.4.4 Phương pháp chiết xuất Soxholet:…………………………………………… 22 I.4.5 Phương pháp chiết xuất hỗ trợ từ Siêu Âm 22 I.4.6 Phương pháp chiết xuất hỗ trợ từ vi sóng…………………………………… 23 I.5 Phương pháp chiết phân đoạn dung môi có độ phân cực tăng dần 24 I.6 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống ung thư hợp chất 25 I.6.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào [14][15]……………… 25 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 II.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 26 II.1.1 Nguyên liệu………………………………………………………………… 26 II.1.2 Hóa chất…………………………………………………………………… 26 II.1.3 Thiết bị……………………………………………………………………… 27 II.2 Phương pháp nghiên cứu 27 II.2.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm………………………………………… 27 II.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình triết xuất…………………… 27 II.2.2.1 Khảo sát trạng thái chiết xuất hợp phần từ đu đủ phương pháp chiết ngâm dầm……………………………………………………………… 27 II.2.2.2 Khảo sát tỷ lệ ngun liệu/dung mơi chiết xuất thích hợp……………….… 29 II.2.2.3 Khảo sát thời gian chiết xuất thích hợp…………………………….……… 29 II.2.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất thích hợp………………………………… 30 II.2.3 Phân đoạn chất chiết dung môi phân cực………… ………………… 31 II.2.4 Khảo sát hoạt tính chống ung thư phân đoạn chất chiết…………… 32 II.2.4.1 Vật liệu…………………………………………………………………… 32 II.2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro………………………………… 32 II.2.4.3 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)………… 33 II.2.5 Định tính flavonoid alkaloid phân đoạn chất chiết………………… 35 II.2.5.1 Định tính flavonoid:………………………………………………….… 36 II.2.5.2 Định tính alkaloid……………………………………………………… 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 III.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 40 III 1.1 Khảo sát trạng thái chiết xuất dịch chiết tổng số từ đu đủ phương pháp chiết ngâm dầm 40 III.1.2 Kết khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết xuất thích hợp .41 III.1.3 Kết khảo sát thời gian chiết xuất thích hợp 43 III.1.4 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất thích hợp 44 III Kết phân đoạn chất chiết dung môi phân cực 45 III.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ưng thư phân đoạn chiết 47 III.3.1 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mơ)……………………………………………………………………… 47 III.3.2 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư LU-1 (ung thư phổi)…………………………………………………………………………… 48 III.6.3 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư Hep – G2 ( ung thư gan)…………………………………………………………………… … 49 III.4 Kết thử định tính flavonoid alkanoid phân đoạn 49 III.4.1 Định tính flavonoid………………………………………………………… 49 III.7.2 Định tính alkaloid………………………………………………………… 52 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: Từ xa xưa đu đủ (có tên khoa học Carica papaya L.) sử dụng số thuốc dân gian nước ta để chữa số bệnh ho, tiếng, nước sắc đu đủ dùng gột vết máu vải, rửa vết thương…Trong thời gian gần đây, số thuốc sử dụng nước chiết từ đu đủ để hỗ trợ điều trị ung thư nhiều người áp dụng Tuy nhiên, thuốc hoàn toàn dựa kinh nghiệm truyền cho mà chưa có nghiên cứu, kiểm tra hướng dẫn cụ thể thành phần hợp phần có đu đủ quy trình, liều lượng dùng, chế tác động việc hỗ trợ điều trị ung thư từ nước chiết đu đủ Ngày nay, khoa học cơng nghệ ngày phát triển số nước tiên tiến giới như: Nhật Bản, Mỹ, Úc… có nhiều nghiên cứu, thí nghiệm có cơng bố kết hoạt tính chống ung thư từ nước chiết đu đủ kết thực phịng thí nghiệm mà chưa có quy trình thử nghiệm người Chính thế, việc sử dụng nước chiết từ đu đủ việc hỗ trợ điều trị ung thư thể người câu hỏi mà chưa có câu trả lời Theo thống kê Tổ chức nghiên cứu ung thư giới (International Agency for Research on Cancer, IARC) tồn giới hàng năm ước tính có khoảng 11 triệu người mắc bệnh ung thư [30] Hiện nay, nước ta tỷ lệ người dân bị ung thư ngày tăng lên theo năm, nguyên nhân gây ung thư đa dạng như: ôi nhiễm môi trường, lối sống không lành mạnh… Theo số liệu thống kê Hiệp hội Ung thư Việt Nam, năm nước có thêm khoảng 150 000 ca mắc bệnh 75000 ca tử vong ung thư Nếu cộng thêm với số bệnh nhân mắc tính đến thời điểm tại, nước có khoảng 240 000 – 250 000 bệnh nhân bị ung thư điều trị [25] Tại bệnh viện K năm số lượng bệnh nhân ung thư vào viện tăng 10 – 20 % so với năm trước Trước thực trạng việc tìm loại thuốc, Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết phương pháp điều trị ung thư cần thiết cấp bách Hiện nay, có số phương pháp điều trị ung thư song chi phí điều trị cịn cao, số loại thuốc điều trị ung thư phải nhập ngoại Theo xu hướng nay, nhà nghiên cứu hướng tới việc chiết xuất hợp phần có nguồn gốc từ tự nhiên mà hợp phần có hoạt tính chống ung thư chiết xuất từ thảo dược để giảm bớt chi phí điều trị cho bệnh nhân ung thư Trong đó, nước ta đu đủ trồng lâu diện tích ngày mở rộng giá trị kinh tế ngày cao đu đủ mang lại Cây đu đủ dễ trồng, dễ nhân giống, sớm, sản lượng cao, chu kỳ kinh tế ngắn, thích nghi tốt với điều kiện khí hậu vùng miền Diện tích trồng đu đủ nước ước khoảng 10 000 – 17 000 với sản lượng khoảng 200 – 350 ngàn [12] Đây thực nguồn nguyên liệu phong phú để thu nhận, chiết xuất hợp chất từ đu đủ khảo sát hoạt tính gây độc tế bào hợp chất hồn tồn thực Điều có ý nghĩa khoa tính thực tiễn cao, góp phần vào nghiên cứu khả chống ung thư từ đu đủ làm tăng giá trị kinh tế cho đu đủ việc thu hái Từ lý trên, lựa chọn thực đề tài “Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đu đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết” Mục đích yêu cầu: Mục đích nghiên cứu: Đưa phương pháp chiết xuất, điều kiện chiết xuất, tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết từ đưa điều kiện chiết xuất thích hợp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Từ mục đích việc đưa điều kiện chiết xuất luận khoa học cho việc sử dụng nước chiết từ đu đủ việc hỗ trợ điều trị ung thư có khả làm sở tiền đề cho hướng nghiên cứu đu đủ Yêu cầu: - Lựa chọn phương pháp chiết xuất, xác định điều kiện chiết xuất tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất hợp phần có đu đủ - Khảo sát khả gây độc tế bào ung thư số dịng tế bào ung thư - Định tính số nhóm chất phân đoạn chất chiết (định tính nhóm chất flavonoid alkaloid) Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu chung đu đủ I.1.1 Nguồn gốc phân bố [26] Cây đu đủ có tên khoa học: Carica papaya L Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliolipsida Bộ: Brassicales Họ: Caricaceae Chi: Carica Lồi: Carica papaya L Hình 1: Hình đu đủ Cây đu đủ nguồn gốc từ Trung Mỹ bờ biển nước Panama Colombia nhà báo Oviedo người Tây Ban Nha mô tả vào năm 1526 Cây đu đủ giống lớn, với thân thẳng đứng không phân nhánh với chiều cao từ – m Lá to mọc so le tập trung có kích thước lớn với đường kính từ 50 – 17 cm, hình chân vịt, xẻ sâu với thùy Hoa giống hoa sứ Plumeria nhỏ mọc nách Quả hình bầu dục thon dài có đường kính từ – 15 cm, dài 20 – 40 cm, trọng lượng từ 0,5 – kg Hiện nay, đu đủ trồng chủ yếu nước vùng nhiệt đới vùng nhiệt đới ẩm châu Á phạm vị 32o Bắc 32o Nam, nơi có nhiệt độ bình qn năm khơng thấp 15oC Tuy nhiên, với tiến công tác chọn tạo giống tạo ta số giống tương đối chịu lạnh Trên giới, nước trồng nhiểu đu đủ là: Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Philipin (Châu Á); Tazania, Uganda (Châu Phi); Brazil , Mỹ (Châu Mỹ); Úc, Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Newzealand (Châu Đại Dương) Ở Việt Nam, đu đủ trồng hầu hết miền Bắc miền Nam, chúng trồng nhiều tỉnh đồng Hà Tây, Hà Nam, Hưng Yên, Bình Dương, Tiền Giang [12] I.1.2 Phân loại: Hiện giới giống đu đủ phân biệt theo loại sau [19]: - Candamarcencis Hook (hill papaya) Có tự nhiên dãy núi Columbia Ecuador, cao 2,5 – 3,0m màu vàng nhỏ - Carica Quercifolia Benth and Hook Trồng phía Nam Mỹ cao 1,5 – 2m nhỏ có màu vàng, chiều dài 2,5 – 5,0 cm - Carica microcarpa, Carica monoica, Carica cauliflora… Trên giới trồng chủ yếu giống lai có nguồn gốc để tạo giống cho suất cao, phẩm chất tốt, trồng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, bệnh tật…Cây đu đủ du nhập vào Việt Nam từ lâu trồng phổ biến nước I.1.3 Tình hình diện tích trồng sản xuất đu đủ Cây đu đủ nhóm trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Theo báo cáo Carmo Sousa Jr (2003) diện tích trồng đu đủ tăng 151% (16 012 triệu vào năm 1990 lên đến 40 202 triệu vào năm 2000) [20] Năm 2004 tồn giới thu triệu diện tích trồng lên đến 389 990 triệu (FAO 2004) Trong đó, trang trại phía nam Mỹ chiếm đến 47%, Châu Á chiếm 30% 20% Nam Phi Brazil đứng đầu giới chế biến đu đủ ngày phát triển Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết tương ứng 5,61% Theo lý thuyết thời gian chiết dài khả thu lượng cao chiết lớn điều hiểu dung mơi chiết có thời gian thẩm thấu vào nguyên liệu nhiều làm tăng bề mặt tiếp xúc nguyên liệu với dung môi Từ nhận xét chọn thời gian chiết xuất thích hợp 48 để tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất III.1.4 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất thích hợp Theo lý thuyết chiết xuất, nhiệt độ cao khả chiết xuất tốt Tuy nhiên, quy luật phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác tương hỗ yếu tố dung môi chiết xuất, đặc tính chất cần chiết xuất… Chính vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát khả chiết xuất hợp chất tự nhiên từ đu đủ khoảng nhiệt độ khác để đưa nhiệt độ thích hợp cho q trình chiết xuất Nhóm tiến hành thí nghiệm khoảng nhiệt độ 30oC, 35oC, 40oC, 45oC không tiến hành khảo sát nhiệt độ cao 45oC nhiệt độ cao dễ làm cho hợp chất hoạt tính Các thí nghiệm tiến hành trình bày phần II.2.6 Kết thu trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất Yếu tố ảnh hưởng Lượng cao chiết thu (% theo trọng lượng nguyên liệu khô) Nhiệt độ Kết trung bình 30oC 5,61 ± 0,03 35oC 6,31 ± 0,02 40oC 7,29 ± 0,11 45oC 7,41 ± 0,04 (± Độ lệch chuẩn) Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 44 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Từ bảng kết 3.4 ảnh hưởng nhiệt độ đến lượng cao chiết thu được: nhận thấy nhiệt độ tỷ lệ thuận với lượng cao chiết thu Ở nhiệt độ khảo sát 30oC khối lượng cao chiết (% theo trọng lượng nguyên liệu khô) tương ứng 5,61% thấp nhất, khối lượng cao chiết tăng dần tăng nhiệt độ lên 35oC tương ứng 6,31%, 40oC tương ứng 7,29% Tuy nhiên, tăng đến nhiệt độ 45oC khối lượng cao chiết có tăng không nhiều so với nhiệt độ 40oC Điều giải thích tăng nhiệt độ lên cao khoảng 45oC lúc dung mơi bắt đầu bay phần, đồng thời hợp chất mà tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao đến 45oC dẫn đến hoạt tính hợp chất tự nhiên có cao chiết Chính thế, để hạn chế hoạt tính hợp chất tránh tốn dung môi bay dung mơi q trình chiết nhiệt độ cao chúng tơi lựa chọn nhiệt độ 40oC để chiết xuất hợp chất tự nhiên từ đu đủ Nhân xét Sau trình khảo sát yếu tổ ảnh hưởng đến trình chiết xuất chúng tơi thấy điều kiện chiết chiết xuất thích hợp là: - Dung môi chiết xuất: Methanol 80% - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/6 - Thời gian chiết xuất: 48 - Nhiệt độ chiết xuất: 40oC III Kết phân đoạn chất chiết dung môi phân cực Tiến hành chiết xuất điều kiện tối ưu tìm thí nghiệm sau: - Nguyên liệu ban đầu: 200g Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 45 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết - Dung môi chiết xuất: Methanol 80% - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/6 - Thời gian chiết xuất: 48 - Nhiệt độ chiết xuất: 40oC Sau chiết xuất điều kiện thích hợp ta thu lượng cao chiết mang cạn dung mơi Sau cặn chiết hòa tan 100 ml nước cất tiến hành phân đoạn (chiết phân bố) dung mơi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự là: n – hexan, diclorometan, etyl – axetat, n – butanol phân đoạn thu tiến hành cô quay chân không cho dạng cao chiết, bảo quản tủ lạnh để tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính gây độc tế bào định tính số nhóm chất có phân đoạn Kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết chiết phân đoạn hợp chất Tổng cao chiết điều kiện tối ưu (% theo trọng lượng nguyên liệu khô) 7,63 (tương ứng 15.26g) Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn N – hexan Diclorometan Etyl – axetat N – butanol 2,15 ( 4,3g) 1,2 (2,4g) 0,45(0,9g) 1,38(2,76g) Tiến hành chiết xuất điều kiện thích hợp ta thu cặn chiết 7,63% so với trọng lượng nguyên liệu khô ban đầu Tiếp theo tiến hành chiết phân đoạn thu khối lượng cặn chiết là: n – hexan tương ứng 2,15% , diclorometan tương ứng 1,2% , etyl – axetat tương ứng Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 46 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết 0,45%, n – butanol tương ứng 1,38% Sau thu cặn chiết ta tiến hành thử gây độc tế bào phân đoạn chất chiết III.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chiết Trong khuôn khổ luận văn chúng tơi lựa chọn dịng tế bào ung thư để khảo sát khả gây độc tế bào phân đoạn chiết là: tế bào ung thư KB (ung thư biểu mơ) dịng tế bào có sức kháng mạnh Tiếp theo dòng tế bào ung thư LU – (ung thư phổi) có sức kháng trung bình cuối dòng tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư gan) dịng tế bào có sức kháng yếu Phương pháp tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư trình bày phần II.2.8 III.6.1 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mơ) Tiến hành xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mơ) Kết thu trình bày bảng 3.6: Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 47 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Bảng 3.6 Kết xác định thử hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư KB % ức chế tế bào Nồng độ (µg/ml) ELLIPTICINE n-hexan diclorometan Etyl-axetat n-butanol (đối chứng dương) 100 20 0,8 IC50 (µg/ml) 48,58 100,59 48,02 41,72 106,40 (10 µg/ml) 11,02 40,38 28,12 13,20 69,44 (2 µg/ml) – 3,81 23,12 19,97 – 4,51 29,89 (0,4 µg/ml) – 5,41 8,49 13,75 – 5,88 2,33 (0,08 µg/ml) >100 28,75 > 100 > 100 0,88 Kết cho thấy mẫu diclorometan có hoạt tính dịng tế bào ung thư KB với IC50 = 28,75 µg/ml Các mẫu cịn lại khơng thể hoạt tính Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm Các kết xác với r2 ≥ 0,99 III.6.2 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư LU – (ung thư phổi) Tiến hành xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư LU – (ung thư phổi) Kết thu trình bày bảng 3.7: Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 48 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Bảng 3.7 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư LU – Nồng độ % ức chế tế bào ELLIPTICINE (µg/ml) n-hexan diclorometan Etyl-axetat n-butanol (đối chứng dương) 100 57,28 102,78 56,19 41,51 99,50 (10 µg/ml) 30,43 61,61 15,37 15,18 79,95 (2 µg/ml) 13,06 12,09 – 4,52 9,93 28,68 (0,4 µg/ml) 0,8 11,18 – 0,20 – 1,40 6,66 17,54 (0,08 µg/ml) IC50 > 100 18,44 > 100 > 100 0,86 20 (µg/ml) Kết cho thấy mẫu Diclorometan có hoạt tính dịng tế bào ung thư LU – (ung thư phổi) với IC50 = 18,44 µg/ml Các mẫu cịn lại khơng thể hoạt tính Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm Các kết xác với r2 ≥ 0,99 III.6.3 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư Hep – G2 ( ung thư gan) Tiến hành xác định hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư gan) Kết cho thấy mẫu n – hexan diclorometan có hoạt tính dịng tế bào ung thư Hep- G2 ( ung thư gan) với IC50 = 18,04 µg/ml n – hexan IC50 = 19,11 µg/ml diclorometan Các mẫu cịn lại khơng thể hoạt tính Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 49 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm Các kết xác với r2 ≥ 0,99 Nhân xét chung: Thực phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho phân đoạn chiết dòng tế bào ung thư là: tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô), tế bào ung thư LU – (ung thư phổi), tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư gan) Theo phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào chất thử có IC50 < 20 µg/ml (với chất chiết thơ, với phân đoạn hóa học) IC50 ≤ µg/ml (với hoạt chất tinh khiết) xem có hoạt tính gây độc tế bào có khả ức chế phát triển diệt tế bào ung thư Ta thấy rằng, phân đoạn chiết dung môi diclorometan thể hoạt tính dịng tế bào ung thư với IC50 tương ứng là: dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mơ) với IC50 = 28,75 µg/ml, tế bào ung thư LU – (ung thư phổi) với IC50 = 18,44 µg/ml, dịng tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư gan) với IC50 = 19,11 µg/ml Riêng phân đoạn chiết dung môi n- hexan biểu hoạt tính dịng tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư gan) với IC50 = 18,04 µg/ml Các phân đoạn cịn lại khơng thể hoạt tính Ta suy luận hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào có mặt chủ yếu phân đoạn diclrometan III.4 Kết thử định tính flavonoid alkanoid phân đoạn Trong khuôn khổ luận văn lựa chọn nhóm hợp chất flavonoid alkaloid để tiến hành định tính nhóm chất Lý lựa chọn nhóm chất theo số tài liệu đu đủ có chưa nhóm hợp chất flavonoid alkaloid Ngồi nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh nhóm nghiên cứu kiểm nghiệm xem nhóm hợp chất có phân đoạn chất chiết Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 50 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết III.4.1 Định tính flavonoid + Phản ứng với H2SO4 đặc: - Cho vào ống nghiệm thứ ml mẫu thử làm chuẩn so sánh - Cho vào ống nghiệm khác ml mẫu thử thêm từ từ giọt H2SO4 đặc, thấy dung dịch lúc đầu có màu vàng nhạt chuyển sang màu cam đậm phản ứng dương tính + Phản ứng với FeCl3 5%: - Cho vào ống nghiệm thứ ml mẫu thử làm chuẩn so sánh - Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc xuất màu xanh đen phản ứng dương tính Kết thử định tính hợp chất flavonoid trình bày bảng 3.9 Bảng3.9 Kết định tính flavonoid Tên phân đoạn Kết định tính Phản ứng H2SO4 Phản ứng với FeCl3 5% N – hexan - - Diclorometan - - Etyl – axetat + + N – butanol - ((+): dương tính, ( - ) ân tính) Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 51 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Phản ứng H2SO4 Phản ứng với FeCl3 5% Hình 4: Định tính flavonoid Nhận xét: Sau tiến hành định tính phân đoạn chiết, chúng tơi thấy flavonoid có phân đoạn etyl – axetat Các phép thử phân đoạn etyl – axetat với H2SO4 FeCl3 5% cho kết dương tính III.4.2 Định tính alkaloid + Phản ứng với thuốc thử Mayer: - Cho 2ml mẫu thử vào ống nghiệm dùng làm ống chuẩn - Cho 2ml mẫu thử vào ống nghiệm khác, nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào thấy xuất kết tủa màu vàng nhạt phản ứng dương tính + Thuốc thử Wagner: - Cho 2ml mẫu thử vào ống nghiệm làm mẫu chuẩn - Cho 2ml mẫu thử vào ống nghiệm khác, sau nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào thấy xuất tủa vàng nâu phản ứng dương tính Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 52 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Kết định tính alkaloid thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết định tính alkaloid Tên phân đoạn Kết định tính Thuốc thử Wagner Thuốc thử Mayer N – hexan - - Diclorometan + + Etyl – axetat - - N – butanol - ((+): dương tính, ( - ) ân tính) Phản ứng với thuốc thử Wagner Phản ứng với thuốc thử Mayer Hình 5: Định tính alkaloid Nhận xét: Sau tiến hành định tính phân đoạn chiết, chúng tơi thấy alkaloid có phân đoạn diclorometan Các phép thử phân đoạn diclorometan với thuốc thử Wagner Mayer cho kết dương tính Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 53 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, chúng tơi có kết luận sau: Về lựa chọn điều kiện cho phương pháp chiết xuất ngâm dầm chúng tơi thấy rắng Chiết xuất điều kiện ngâm dầm động cho kết cao chiết hợp chất tự nhiên cao so với chiết xuất ngâm dầm tĩnh Bằng phương pháp tối ưu hóa cổ điểm xác định thơng số thích hợp cho q trình chiết xuất hợp chất tổng số từ đu đủ khô sau: - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/6 (g/ml) - Thời gian chiết: 48 - Nhiệt độ chiết: 40 oC Chiết phân đoạn cao chiết hợp chất tự nhiên từ đu đủ tiến hành khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết dòng tế bào tế bào ung thư: KB (ung thư biểu mô), tế bào ung thư LU –1 (ung thư phổi), dòng tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư gan) Kết thử nghiệm cho thấy phân đoạn chiết dung mơi Diclrometan có hoạt tính dòng tế bào ung thư Riêng dòng tế bào Hep – G2 (ung thư gan) phân đoạn chiết dung mơi n – hexan có hoạt tính Kết phân tích định tính cho thấy: hợp chất flavonoid có phân đoạn etyl – axetat, hợp chất alkaloid có phân đoạn diclrodimetan Kiến nghị Nghiên cứu thêm mốt số phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên từ đu đủ chiết Soxhlet, chiết hỗ trợ siêu âm, chiết hỗ trợ từ vi sóng Cần tối ưu thêm số thông số kỹ thuật khác để tìm yếu tố thích hợp cho q trình chiết xuất Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 54 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Đề nghị triển khai nghiên cứu tiếp về: Khảo sát số tính chất chống oxy hóa, khả kháng khuẩn phân đoạn chất chiết Đã biết nhóm alkaloid flavonoid có mặt phân đoạn ta tiến hành tinh alkaloid, flavonoid Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 55 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Bin- Các Q trình thiết bị cơng nghệ hóa chất thực phẩm – NXB Khoa học kỹ thuật Lê Văn Đặng 2005, Chuyên đề số hợp chất tự nhiên, NXB Đại học Quốc gia thành phố HCM Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thị Thư – Hóa sinh học- NXB Đại học sư phạm 2004 Nguyễn Thành Hối, Võ Thanh Hoàng, Dương Minh – Kỹ thuật trồng đu đủ - NXB Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh- 2000 Phạm Quốc Kinh – Các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Nhà XB Giáo Dục 2011 Đỗ Tất Lợi – Những thuốc vị thuốc Việt Nam- NXB Y Học 2004 Phạm Kim Mãn cộng (2001) Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế u dùng điều trị ung thư Tạp chí dược liệu, (2+3), pp 58-62 Đỗ Đình Rãng (chủ biên), Đặng Đình Bạch, Nguyễn Thị Thanh Phong – Hóa học hữu – Tập I,II,III - NXB Giáo dục Nguyễn Ngọc Sương – Alkaloid – Đại học khoa học tự nhiên TP HCM 10 Đỗ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu xác định khả phòng chống ung thư chất hóa học số thuốc Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học 11.Đặng Thị Thu tác giả – Cơ sở Cơng nghệ sinh học tập – Cơng nghệ hóa sinh Nhà XB Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội 2009 12 Trần Thế Tục, TS Đoàn Thế Lư – Cây đu đủ kỹ thuật trồng – NXB Lao Động Xã Hội Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 56 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết 13 Đỗ Hoa Viên – Bài giảng hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ thực vật (2013) Trường đại học Bách khoa Hà Nội Tiếng Anh 14 A Monks, D Scudiero, P Skehan, R Shoemake, K Paull, D Vistica, C Hose, J Langley, P Cronise, H Campbell, J Mayo, M Boyd (1991): Feasibility of a highflux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines; Journal of National Cancer Institute No.11, Vol 83, [757-766] 15 D A Scudiero, R H Shoemaker, K D Paull, A Monks, S Tierney, T H Nofziger, M J Currens, D Seniff, M R Boyd (1988): Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines; Cancer Research No.48, [4827-4833] 16 Edward A Evans, Fredy H Ballen, and Jonathan H Crane - An Overview of US Papaya Production, Trade, and Consumption 17 Jaime A Teixira da Silva Zinia Rashid Duong Tan Nhut- Papaya (Carica papaya L) Biology and Biotechonology – Tree and Forestry Science and Biotechonology 2007 18 Oduola, T1*, Adeniyi F A A.2, Ogunyemi E O.3, Bello, I S.4, Idowu T O5 and Subair, H.G6 - Toxicity studies on an unripe Carica papaya aqueous extract: biochemical and haematological effects in wistar albino rats - Journal of Medicinal Plants Research Vol (1) pp 001-004, August 2007 19 Papaya – Oxford & IBH Publishing co PVT LTD 20 Papaya (Carica papaya L) Biology and Biotechonology 21 Robert A Disilvestro Flavoinoid and Antioxidants CRC Press, 2011 Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 57 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết 22 Noriko Otsuki, Nam H Dang, Emi Kumagai, Akira Kondo, Satoshi Iwata, Chikao Morimoto “Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects.” Journal of Ethnopharmacology, Volume 127, Issue 3, 17 February 2010, Pages 760-767 23 Ngozi Awa Imaga*, George O Gbenle, Veronica I Okochi, Sunday Adenekan, Tomi Duro-Emmanuel, Bola Oyeniyi, Patience N Dokai, Mojisola Oyenuga, Alero Otumara and Felix C Ekeh - Phytochemical and antioxidant nutrient constituents of Carica papaya and Parquetina nigrescens extracts- Scientific Research and Essays Vol 5(16), pp 2201-2205, 18 August, 2010 24 The Biology of Carica papaya L (papaya, papaw, paw paw) Version , February 2008 – Department of health and Ageing office of the Gene technology Regulator 25 Technical Bulletin - Caspase –Glo 3/7 Assay – Instructions for use of products G8090, G8091, G8092 and G8093 Tài liệu từ mạng truyền thông 26.http://laodong.com.vn/Y-te/Ung-thu-dang-tang-nhanh-o-Viet-Nam/99991.bld (LĐCT) - Số - Chủ nhật 20/01/2013 07:43 27 http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=CAPA23 28 http://www.duoclieu.org/2012/07/chiet-xuat-phan-lap-cac-chat-tu-duoc-lieu.html 29 http://vi.wikipedia.org/wiki/Caspase 30 http://www.anninhthudo.vn/San-phamUng-dung/La-du-du-chong-ungthu/368747.antd 30 http://benhvienhyvongmoi.vn/chi-tiet-tin/l-24/t-78 Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 58 ... cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết - Tỷ lệ dung môi chiết/ dung dịch: 1/1 Sau phân đoạn chất chiết ta thu phân đoạn. .. 16 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Theo Đỗ Thị Thảo cặn chiết methanol đu đủ có tác dụng gây độc tế bào. .. 2012 29 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết 100g Tiến hành chiết xuất thời gian chiết xuất khác thay đổi từ 24