Kết quả bước đầu so sánh genome giữa các loài sinh vật với nhau đã cho thấy có ba đặc điểm nổi bật: 1 các gen phân bố trong genome không theo qui luật, 2 kích thước của genome thay đổi k[r]
(1)Chương CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC I Nucleic acid phospho (RNA) Deoxyribonucleic acid mm Hình 1.1 Chuỗi xoắn kép DNA Trang Lop12.net (2) 20 100 300 1.3) nh 100 phân 100 300 Trong nhân tế bào, các sợi vừa kể trên kết hợp chặt chẽ với nhiều protein khác và với các RNA tạo thành nhiễm sắc chất, mức độ tổ chức cao DNA Hình 1.2 Cấu trúc các nucleotide điển hình Hình 1.3 Cấu trúc nucleosome và nhiễm sắc thể Phân tử DNA cuộn lại trên nhiễm sắc thể làm cho chiều dài ngắn lại 50.000 lần Trang Lop12.net (3) : - Ví - CEN) TEL) - - 5S RNA - Ribonucleic acid : - NA-protein : (mRNA) Trang Lop12.net (4) : E coli 1,2 kb (tRNA) : 2.3 RNA ribosome (rRNA) protein E coli 5S Người ta thấy ribosome ty thể, đó có tổng hợp số protein ty thể E coli 2.3.1 Ribosome prokaryote Trang Lop12.net (5) Tế bào nghiên cứu ribosome nhiều là E coli Ribosome (70S) E coli gồm hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ (30S) và tiểu đơn vị lớn (50S) Căn vào hệ số lắng, người ta phân biệt ba loại rRNA: 23S rRNA, 16S rRNA và 5S rRNA - Tiểu đơn vị 30S chứa: phân tử 16S rRNA (có 1540 nu) và 21 ribosomal protein khác - Tiểu đơn vị 50S chứa: phân tử 5S rRNA (có 120 nu), phân tử 23S rRNA (có 2900 nu) và 34 ribosomal protein Hai tiểu đơn vị nhỏ và lớn kết hợp với tạo rãnh chỗ tiếp giáp chúng mRNA qua 2.3.2 Ribosome eukaryote Ribosome eukaryote (80S) lớn ribosome prokaryote bao gồm hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ (40S) và tiểu đơn vị lớn (60S) - Tiểu đơn vị 40S chứa: phân tử 18S rRNA (có 1900 nu) và 33 ribosomal protein - Tiểu đơn vị 60S chứa: phân tử rRNA (5S; 5,8S và 28S) và 49 ribosomal protein : i pyrophosphate E coli u II Protein : -a-amino acid (NH2 a- a Trang Lop12.net (6) Những amino acid trung tính có nhóm amine và nhóm carboxyl Những protein chứa nhiều amino acid trung tính - - isoleucine - : , alanine, valine, Bao Bao - (-S-S-) - Bao Bao - Iminoacid Proline - Bao , tyrosine 2O no acid (Hình 1.4): - ) T Trang Lop12.net (7) Hình 1.4 Các mức độ tổ chức phân tử protein chuỗi polypeptide - - acid - Trang Lop12.net (8) - .L Bảng 1.2 Các chức sinh học protein và số ví dụ Các nhóm chức Enzyme Protein điều khiển Protein vận chuyển Protein dự trữ Ví dụ Ribonuclease Trypsin Phosphofructokinase Alcohol dehydrogenase Catalase Malic enzyme Insulin Somatotropin Thyrotropin Lac repressor NF1 (nuclear factor 1) Catabolite activator protein (CAP) AP1 Hemoglobin Serum albumin Glucose transporter Ovalbumin Casein Zein Phaseolin Ferritin Trang Lop12.net (9) Protein vận động và co rút Protein cấu trúc Protein cấu trúc tạm thời (scaffold protein) Protein bảo vệ Protein lạ/ngoại lai (exotic protein) Actin Myosin Tubulin Dynelin Kinesin -Keratin Collagen Elastin Fibroin Proteoglycans Grb Crk Shc Stat IRS-1 Immunoglobulins Thrombin Fibrinogen Antifreeze proteins Snake and bee venom proteins Diphtheria toxin Ricin Monellin Resilin Glue proteins 1016 ) (rep O2 Trang Lop12.net (10) 1.5) Hình 1.5 Hai kiểu vận chuyển (a): vận chuyển bên các tế bào mô (b): vận chuyển vào khỏi tế bào hemoglobin ) Trang 10 Lop12.net (11) 2.7 Protein : (g-glutamyl-cysteinyl)n-glycine Protei 109 0oC 2.8 Protein lạ/ngoại lai III Lipid Trang 11 Lop12.net (12) Hình 1.6 Sơ đồ biểu diễn kháng thể và kháng nguyên a: kháng thể gồm chuỗi polypeptide b: kháng thể kết hợp với kháng nguyên c: kết hợp kháng nguyên và kháng thể 1.7) 1.3 Hình 1.7 Sơ đồ biểu diễn đoạn cắt màng sinh học IV Polysaccharide Trang 12 Lop12.net (13) DNA t Trang 13 Lop12.net (14) Chương CẤU TRÚC GENOME Genome (hệ gen, gen) là thuật ngữ dùng với các nghĩa khác sau: - Nguyên liệu di truyền thể: 1) nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn (hoặc loại nhiễm sắc thể loại có mặt, ví dụ: các nhiễm sắc thể lớn bé Vibrio cholerae), 2) DNA RNA virion, 3) nhiễm sắc thể cùng với plasmid kết hợp (ví dụ: nhiễm sắc thể và hai plasmid nhỏ vi khuẩn Buchnera) - Tất các gen (khác nhau) tế bào virion - Bộ nhiễm sắc thể đơn bội genome đơn bội tế bào Chuỗi genome hoàn chỉnh (nghĩa là trình tự hoàn chỉnh các nucleotide genome) đã công bố cho số loài vi khuẩn Các trình tự khác đã công bố, ví dụ genome cây cúc dại (Arabidopsis thaliana) và genome người Genome chứa toàn thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho thể hoạt động Ở các sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% genome nằm nhân tế bào và phần còn lại nằm số quan tử ty thể và lạp thể Đa số genome vi khuẩn và phần genome chứa các quan tử thường có kích thước nhỏ và dạng vòng khép kín Ngược lại, phần genome nhân thường lớn và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng Dự án genome là dự án xác định cấu trúc di truyền chính xác genome thể sống, nghĩa là trình tự DNA tất các gen nó Dự án genome số sinh vật mô hình (model organisms) đã hoàn thành sau: - Các genome vi khuẩn Các trình tự hoàn chỉnh genome Escherichia coli đã xác định theo phương thức tổ hợp/tập hợp (consortium) các phòng thí nghiệm Năm 1995, hai trình tự genome hoàn chỉnh vi khuẩn Haemophilus influenzae và Mycoplasma genitalium hoàn thành Loài M genitalium có genome đơn giản (khoảng 580.067 base), nó dựa vào vật chủ để vận hành nhiều máy trao đổi chất mình Loài H influenzae là vi khuẩn đặc trưng hơn, và có genome khoảng 1.830.121 base với 1.749 gen - Chuỗi genome hoàn chỉnh nấm men Saccharomyces cerevisiae đã hoàn chỉnh năm 1996, nhờ consortium các phòng thí nghiệm Genome chúng dài 12.146.000 base - Các dự án genome động vật như: chuột, cừu, lợn, giun tròn (Caenorhabditis elegans), ruồi giấm (Drosophila melanogaster)…, thực vật như: lúa nước, lúa mì, ngô, táo, cúc dại…, mà bật số đó là dự án genome người đã thực Ngày 12 2001 genome người đã công bố với khoảng 30.000 gen, ít nhiều so với dự kiến trước đây (hàng trăm ngàn gen), và gấp hai lần giun tròn ruồi giấm Người ta đã xác định hệ gen người giống 98% so với tinh tinh và có đến 99% là giống các dân tộc, các cá thể Do đó, vấn đề hình thành và phát triển nhân cách, số thông minh phải chủ yếu trên sở xã hội và rèn luyện người để phát triển tiềm sinh học thân Trình tự genome sinh vật mô hình có ý nghĩa nghiên cứu chuyên ngành khoa học đó là genome học (genomics) Dựa vào đây, các nhà sinh học phân tử có thể phân tích cấu trúc, hoạt động và chức các gen, làm sáng tỏ vai trò DNA lặp lại, DNA không chứa mã di truyền, DNA nằm các gen Điều đặc biệt có ý nghĩa là so sánh các genome với nhau, có thể hiểu hoạt Trang 14 Lop12.net (15) động genome các thể sống, mối quan hệ chúng, đa dạng sinh học và mức độ tiến hóa Kết bước đầu so sánh genome các loài sinh vật với đã cho thấy có ba đặc điểm bật: 1) các gen phân bố genome không theo qui luật, 2) kích thước genome thay đổi không tỷ lệ thuận (tương quan) với tính phức tạp loài, 3) số lượng nhiễm sắc thể khác loài gần I Thành phần và đặc điểm genome Genome chứa thông tin di truyền đặc trưng cho loài, chí cho cá thể loài Genome có thể bao gồm các phân tử DNA RNA Đối với sinh vật bậc cao, kích thước genome thay đổi từ 109 bp (động vật có vú) đến 1011 bp (thực vật) Khác với tế bào tiền nhân (prokaryote), các gen genome eukaryote thường tồn nhiều và thường bị gián đoạn các đoạn mã mù không mang thông tin di truyền (các intron) Vì vậy, vấn đề quan tâm là cần phải biết số lượng các gen khác có mặt genome số lượng các gen hoạt động loại mô, giai đoạn phát triển và tỷ lệ các gen so với kích thước genome Genome quan tử Hầu hết genome quan tử, không phải luôn luôn, có dạng phân tử DNA mạch vòng đơn chuỗi Genome quan tử mã hóa cho số, không phải tất cả, các protein tìm thấy quan tử Do có nhiều quan tử tế bào, cho nên có nhiều genome quan tử trên tế bào Mặc dù thân genome quan tử là Nhưng nó cấu tạo gồm chuỗi lặp lại1 liên quan với chuỗi không lặp lại2 nhân Về nguyên tắc, các gen quan tử phiên mã và dịch mã các quan tử 1.1 Genome ty thể DNA ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA) là genome độc lập, thường là mạch vòng, định vị ty thể - DNA ty thể tế bào động vật mã hóa đặc trưng cho 13 protein, rRNA và 22 tRNA - DNA ty thể nấm men S cerevisiae dài mtDNA tế bào động vật năm lần có mặt các đoạn intron dài Các genome ty thể có kích thước tổng số khác nhau, các tế bào động vật có kích thước genome nhỏ (khoảng 16,5 kb động vật có vú) (Hình 2.1) Có khoảng vài trăm ty thể trên tế bào Mỗi ty thể có nhiều DNA Số lượng tổng số DNA ty thể so với DNA nhân là nhỏ (<1%) Trong nấm men S cerevisiae, genome ty thể có kích thước khá lớn (khoảng 80 kb) và khác tùy thuộc vào chủng Có khoảng 22 ty thể trên tế bào, tương ứng khoảng genome trên quan tử Ở tế bào sinh trưởng, tỷ lệ mtDNA có thể cao (khoảng 18%) Kích thước genome ty thể các loài thực vật là khác nhau, tối thiểu khoảng 100 kb Kích thước lớn genome đã gây khó khăn cho việc phân lập nguyên vẹn DNA, đồ cắt hạn chế (restriction map) vài loài thực vật đã cho thấy genome ty thể thường là chuỗi đơn, cấu tạo mạch vòng Trong mạch vòng này có chuỗi tương đồng ngắn và tái tổ hợp chúng đã sinh các phân tử tiểu genome (subgenome) mạch vòng nhỏ hơn, cùng tồn với genome “chủ” (master genome) hoàn chỉnh, đã giải thích cho phức tạp các DNA ty thể thực vật Trang 15 Lop12.net (16) Hình 2.1 DNA ty thể người Bao gồm 22 gen tRNA, gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein Bảng 2.1 tóm tắt phân công các gen số genome ty thể Tổng số gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan với kích thước genome Ty thể động vật có vú sử dụng các genome 16 kb chúng để mã hóa cho 13 protein, đó ty thể nấm men S cerevisiae dùng các genome từ 60-80 kb mã hóa cho khoảng protein Thực vật với genome ty thể lớn nhiều mã hóa cho nhiều protein Các intron tìm thấy hầu hết các genome ty thể, lại không có các genome nhỏ động vật có vú Hai rRNA chính luôn mã hóa genome ty thể Số lượng các tRNA mã hóa genome ty thể dao động từ không đầy đủ (25-26 ty thể) Nhiều protein ribosome mã hóa genome ty thể thực vật và sinh vật nguyên sinh, có ít không có genome nấm và động vật Bảng 2.1 Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA 1.2 Genome lạp thể DNA lạp thể (chloroplast DNA-ctDNA) là DNA genome độc lập, thường là mạch vòng, tìm thấy lạp thể thực vật - Genome lạp thể khác kích thước, đủ lớn để mã hóa cho khoảng 50-100 protein rRNA và tRNA Trang 16 Lop12.net (17) - DNA lạp thể dài từ 120-190 kb Các genome lạp thể đã phân tích trình tự cho thấy có khoảng 87-183 gen Bảng 2.2 mô tả các chức mã hóa genome lạp thể cây trồng Bảng 2.2 Genome lạp thể các cây trồng mã hóa cho rRNA, 30 tRNA và khoảng 60 protein Nói chung, các đặc điểm genome lạp thể tương tự ty thể, ngoại trừ lạp thể mang nhiều gen Genome lạp thể mã hóa cho tất các loại rRNA và tRNA cần thiết tổng hợp protein, và cho khoảng 50 protein, bao gồm RNA polymerase và các protein ribosome Các intron lạp thể chia thành hai nhóm: 1) intron trên các gen tRNA thường (mặc dù không chắn) định vị vòng anticodon, giống các intron tìm thấy các gen tRNA nhân nấm men S cerevisiae; 2) intron các gen mã hóa protein tương tự với các intron các gen ty thể Vai trò lạp thể là thực quá trình quang hợp Do đó, nhiều gen nó mã hóa cho các protein các phức hợp định vị các màng thylakoid Một vài phức hợp protein lạp thể giống các phức hợp protein ty thể: có số tiểu đơn vị mã hóa genome quan tử và số khác mã hóa genome nhân Nhưng các phức hợp còn lại mã hóa hoàn toàn genome lạp thể Động học phản ứng lai DNA Bản chất chung eukaryotic genome phản ánh qua động học tái liên kết các DNA (DNA reassociation kinetics) bị biến tính Sự tái liên kết các chuỗi DNA bổ sung xảy nhờ bắt cặp base, ngược lại với quá trình biến tính (denaturation) mà nhờ đó chúng tách rời (Hình 2.2) để thực tái phiên mã Động học phản ứng tái liên kết phản ánh khác các chuỗi diện, vì phản ứng này có thể dùng để định lượng các gen và các sản phẩm RNA chúng Trang 17 Lop12.net (18) Bảng 2.3 mô tả phản ứng tái liên kết Sự hồi tính DNA (renaturation) phụ thuộc vào va chạm ngẫu nhiên các chuỗi bổ sung Phản ứng các DNA riêng biệt có thể mô tả các điều kiện cần thiết cho hoàn thành nửa (half-completion) Đây là tích số C0´t1/2 và gọi là C0t1/2 Giá trị này tỷ lệ nghịch với số tốc độ Do C0t1/2 là tích số nồng độ và thời gian yêu cầu cho nửa đường, nên giá trị C0t1/2 lớn dẫn đến phản ứng chậm Bảng 2.3 Một phản ứng tái liên kết DNA mô tả C0t1/2 Phản ứng lai phụ thuộc vào C0t Tốc độ phản ứng Tiến độ phản ứng Thông số tới hạn là C0t1/2 Phản ứng theo phương trình Lấy tích phân phương trình Khi phản ứng hoàn thành bậc hai tốc độ các giới hạn: thời điểm t=1/2 dC C 1 nồng độ ban đầu kC dt C kC t1 / DNA=C0 thời điểm t=0; C: nồng độ DNA sợi nồng độ trì sợi đơn=C C t1 / Vì đơn thời điểm t sau thời gian t k C K: số tốc độ tái liên kết C kC t Sự hồi tính DNA thường có dạng đường cong C0t, đường cong biểu diễn đồ thị phân số DNA tái liên kết (1-C/C0) theo log C0t Hình 2.3 trình bày đường cong C0t số genome đơn giản Các đường cong có dạng tương tự nhau, giá trị C0t1/2 đường là khác Các genome hình 2.3 đại diện cho các nguồn DNA khác (PolyU:PolyA, thực khuẩn thể MS2, thực khuẩn thể T4 và vi khuẩn E coli) C0t1/2 liên quan trực tiếp với lượng DNA genome Điều này phản ánh tình trạng genome trở nên phức tạp hơn, thì có thêm số vài chuỗi đặc biệt lượng DNA có trước Ví dụ: C0 DNA là 12 pg, thì nó chứa khoảng 3.000 trình tự genome vi khuẩn Trang 18 Lop12.net (19) Hình 2.3 C0t1/2 phụ thuộc vào độ phức tạp genome PolyU:PolyA, thực khuẩn thể MS2, thực khuẩn thể T4 và vi khuẩn E coli Kích thước genome Không phải tất các đoạn DNA genome tương ứng với các gen (mã hóa cho protein sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống tế bào) Từ năm 1970, các thí nghiệm gây bão hòa đột biến người ta đã có thể xác định số gen nằm trên đoạn nhiễm sắc thể Ngày nay, nhờ các kỹ thuật phân tích DNA và RNA đại (Southern blot, Northern blot, microarray ) các nhà khoa học có thể xác định số gen hoạt động tế bào Ví dụ: tế bào nấm men S cerevisiae (sinh vật eukaryote bậc thấp) có khoảng 4.000 gen hoạt động, còn tế bào động vật có vú khoảng 10.000-15.000 gen Như vậy, độ dài trung bình gen khoảng 10 kb thì tổng số chiều dài các gen hoạt động tế bào chiếm 1-2% genome Hay nói cách khác, phần nhỏ genome mang thông tin di truyền cần thiết cho hoạt động sống tế bào Vậy phần genome còn lại có vai trò gì, và tính phức tạp loài có liên quan gì với kích thước genome hay không? Để làm sáng tỏ vấn đề trên, chúng ta cần xem xét kích thước genome số loài gần bậc thang tiến hóa (có độ phức tạp loài tương tự nhau) genome loài xa (có tính phức tạp khác nhau) Chẳng hạn: - Genome người có kích thước khoảng 3,3´109 bp, đó genome loài lưỡng cư dài khoảng 3,1´109 bp thực vật có thể lên đến 1011 bp Như vậy, có phải là các loài lưỡng cư có tính phức tạp tương tự thể chúng ta? - Hay là cùng loại, chúng ta nhận thấy có mâu thuẫn kích thước genome? Ví dụ: ruồi nhà (Musca domestica) có genome khoảng 8,6´108 bp, lớn gấp sáu lần kích thước genome ruồi giấm khoảng 1,4´108bp Ngoài ra, các loài lưỡng cư kích thước genome chúng thay đổi khá lớn từ 10 9-1011 bp Vì cùng loại mà kích thước genome lại biến thiên nhiều vậy, có phải ruồi nhà có cấu tạo phức tạp nhiều so với ruồi giấm? Từ liệu trên, chúng ta có thể nhận định tính phức tạp loài không liên quan đến kích thước genome Tuy nhiên, vai trò phần genome còn lại (phần không mã hóa) đến chưa biết nhiều Tổng số gen biết số loài eukaryote Có 6.000 gen nấm men S cerevisiae, 18.500 gen giun tròn, 13.600 gen ruồi giấm, 25.000 gen Arabidopsis, và có khả 30.000 gen chuột và < 30.000 gen người Trang 19 Lop12.net (20) Như chúng ta đã biết, mối quan hệ kích thước genome và số lượng gen đã không còn Genome các sinh vật eukaryote đơn bào có cùng phạm vi kích thước với genome vi khuẩn lớn Các eukaryote bậc cao có nhiều gen hơn, số lượng không tương quan với kích thước genome Hình 2.4 cho thấy genome loài nấm men S cerevisiae dài 13.500 kb và loài nấm men S pombe là 12.500 kb, có khoảng 6.000 gen và 5.000 gen tương ứng Khung đọc mở trung bình khoảng 1,4 kb, vì khoảng 70% genome chiếm giữ các vùng mã hóa Sự khác chủ yếu chúng là 5% gen S cerevisiae có intron, so với 43% S pombe Genome giun tròn có khoảng 18.500 gen Mặc dù genome ruồi giấm lớn genome giun tròn, chúng lại có số gen ít Đến nay, chúng ta chưa hiểu ruồi giấm-một thể phức tạp nhiều-chỉ có 70% số gen so với giun tròn Điều này đã cho thấy không có mối quan hệ chính xác số gen và tính phức tạp quan Hình 2.4 Số lượng gen sinh vật eukaryote khác Thay đổi từ 6.00040.000 không tương quan với kích thước genome độ phức tạp thể Cây Arabidopsis có kích thước genome trung gian giun tròn và ruồi giấm, lại có số gen lớn hai (25.000) Điều này lần cho thấy không có quan hệ rõ ràng, và nhấn mạnh nét đặc biệt thực vật, là có thể có nhiều gen (do nhân đôi ông bà tổ tiên truyền lại) các tế bào động vật Đa số genome Arabidopsis tìm thấy các đoạn nhân đôi, gợi ý có nhân đôi xa xưa genome (tạo dạng tứ bội) Chỉ 35% các gen Arabidopsis diện các đơn Genome lúa lớn Arabidopsis khoảng lần, số gen lớn khoảng 50%, có khả khoảng 40.000 gen DNA lặp lại chiếm khoảng 42-45% genome Hơn 80% gen tìm thấy Arabidopsis diện lúa Trong số gen chung này, khoảng 8.000 có Arabidopsis và lúa không thấy genome động vật vi khuẩn nào (những gen đã phân tích trình tự) Có khả đây là tập hợp các gen mã hóa cho các chức đặc trưng thực vật, chẳng hạn quang hợp II Tính phức tạp genome Kết nghiên cứu động học các phản ứng lai tiến hành genomic DNA với cDNA (complementary DNA-DNA bổ sung), DNA với mRNA… cho thấy hầu hết các gen hoạt động nằm thành phần DNA không lặp lại Như vậy, thành phần này có ý nghĩa quan trọng việc đánh giá tính phức tạp genome Hay Trang 20 Lop12.net (21)