Giáo trình sinh học phân tử phần 2 hoàng trọng phấn

Các promoter ở prokaryote Các vùng khởi động promoter nói chung nằm kề trước gen và có chứa các đoạn trình tự đặc thù cho phép ARN polymerase nhận biết và bám chặt vào để khởi đầu phiê

73

Chương 5 PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ

Nói đến gen tức là nói đến ADN và các quan hệ của nó với ARN và protein trong sơ đồ Lý thuyết trung tâm của Sinh học phân tử; trong đó các sợi đơn của ADN được dùng làm khuôn cho tái bản (replication) Mặt khác, các gen có thể làm khuôn cho sự tổng hợp các ARN trong quá trình phiên mã (transcription) Đến lượt, các phân tử ARN này lại làm khuôn cho sự tổng hợp các chuỗi polypeptide mà từ đó tạo thành các protein, gọi là dịch mã (translation) Phiên mã và dịch mã là hai

giai đọan chính trong sự biểu hiện của các gen mã hóa protein

Trong chương này, chúng ta sẽ lần lượt tìm hiểu các vấn đề sau: (i) Quá trình phiên mã; (ii) Cấu trúc và chức năng của các loại ARN cơ bản trong tế bào; (iii) Quá trình dịch mã; và (iv) So sánh những điểm liên quan ở các tế bào prokaryote và eukaryote

1 Phiên mã (Transcription)

1.1 Đặc điểm chung của phiên mã ở prokaryote và eukaryote

Phiên mã (transcription) là quá trình tổng hợp các ARN khác nhau từ thông tin di truyền chứa

đựng trong ADN Trừ các gen mã hóa protein trong các operon ở vi khuẩn, nói chung, các ARN mới

được tổng hợp chỉ là các bản sao sơ cấp (primary transcript) gọi là các pre-ARN Các pre-ARN này

phải trải qua một quá trình sửa đổi để trở thành các ARN trưởng thành (mature) trước khi tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào

Hình 5.1 Cấu trúc chung của một gen hay đơn vị phiên mã

Quá trình phiên mã (Hình 5.2) có các đặc điểm chung sau đây:

(i) Diễn ra dưới tác dụng của các enzyme ARN polymerase

(ii) Vùng ADN chứa gen được mở xoắn cục bộ, và chỉ một mạch đơn gọi là mạch có nghĩa (sense) được dùng làm khuôn (template) cho tổng hợp ARN

(iii) Phản ứng tổng hợp ARN diễn ra theo nguyên tắc bổ sung và được kéo dài theo chiều

5'→3', ngược với chiều của mạch khuôn như sau:

Mạch khuôn: 3'-A-T-G-C-5' Mạch ARN: 5'-U-A-C-G-3'

(iv) Nguyên liệu là 4 loại ribonucleoside triphosphate: ATP, UTP, GTP, CTP

(v) Sản phẩm của phiên mã là các ARN mạch đơn

(vi) Sự khởi đầu và kết thúc phiên mã phụ thuộc vào các tín hiệu điều hoà là các trình tự ADN đặc thù nằm trước và sau gen được phiên mã

(vii) Quá trình phiên mã có thể chia làm ba bước: Mở đầu là sự tương tác giữa ARN polymerase với vùng promoter nhằm xác định mạch khuôn của gen và tổng hợp vài nucleotide; Kéo dài là giai đọan sinh trưởng tiếp tục của chuỗi ARN dọc theo mạch khuôn cho đến cuối gen; và Kết thúc phiên mã đặc trưng bằng sự giải phóng mạch ARN và ARN polymerase ra khỏi khuôn ADN

Hình 5.2 Sự tổng hợp ARN trên mạch khuôn của gen (ADN) dưới tác dụng của ARN polymerase

1.2 Phiên mã ở prokaryote

1.2.1 ARN polymerase ở prokaryote

Ở các prokaryote, đại diện là E coli, ARN polymerase hoàn chỉnh (holoenzyme) là một

protein có nhiều tiểu đơn vị, gồm hai phần chính là yếu tố sigma (σ) và lõi enzyme Yếu tố sigma

(sigma factor) giúp cho ARN polymerase nhận biết và bám chặt vào promoter để có thể bắt đầu

phiên mã tại vị trí chính xác, và lõi enzyme (polymerase core) đóng vai trò chính trong tổng hợp mạch ARN Tất cả các lớp ARN ở E coli đều được phiên mã bởi chỉ một ARN polymerase

Sau đây là một số đặc tính hoạt động của ARN polymerase của E coli (Bảng 5.1; Hình 5.3):

Bảng 5.1 Các thành phần cấu trúc của ARN polymerase prokaryote

dùng để kết hợp holoenzyme ARN polymerase

β 1 hình thành liên kết phosphodiester

σ 1 nhận biết promoter và khởi đầu phiên mã

α 2ββ'σ ↔ αααα2ββ' + σσσσ

Holoenzyme = Lõi enzyme + Yếu tố sigma

(i) Khi bám vào promoter, ARN polymerase gây tháo xoắn ít nhất 10 bp, nhưng có lẽ là khoảng

17 bp ở vùng lân cận điểm bắt dầu phiên mã

(ii) Búp phiên mã lan tỏa cùng với ARN polymerase làm lộ ra mạch khuôn vì vậy nó có thể

được phiên mã Thực tế, ARN polymerase của E coli mở rộng ít nhất từ vị trí -44 đến +3 trong

phức hợp mở của promoter

75

Hình 5.3 Mô hình chức năng của vùng đầu cuối C (C-terminal domain = CTD) của tiểu đơn vị α

ARN polymerase (a) Trong lõi promoter, α CTD không được sử dụng, nhưng (b) trong

một promoter có yếu tố UP, thì α CTD tiếp xúc với yếu tố UP Lưu ý hai tiểu đơn vị α được mô tả: một cái nằm khuất sau cái kia

(iii) Tiểu đơn vị α của ARN polymerase có một vùng chức năng đầu C (C-terminal domain = CTD) uốn gập một cách độc lập sao cho có thể nhận biết và bám vào yếu tố điều hòa ngược dòng của promoter gọi là UP Điều này cho phép sự tương tác chặt giữa polymerase và promoter

(iv) Tiểu đơn vị α dùng để kết hợp holoenzyme ARN polymerase Và điều này gây ra sự kết hợp các gốc chức năng ở vùng đầu mút N của α (α-NTD; N-terminal domain) Các điểm tiếp xúc giữa α-NTD và các tiểu đơn vị β và β' nằm trên các phía đối diện của dimer α-NTD so với các vùng đầu cuối C của dimer (v) Tiểu đơn vị β lõi bám vào các nucleotide tại vị trí hoạt động của ARN polymerase nơi mà các liên kết phosphodiester được hình thành Yếu tố σ cũng gần kề vị trí bám nucleotide, ít nhất trong pha khởi đầu

1.3 Các promoter ở prokaryote

Các vùng khởi động (promoter) nói chung nằm kề trước gen và có chứa các đoạn trình tự đặc

thù cho phép ARN polymerase nhận biết và bám chặt vào để khởi đầu phiên mã tại vị trí chính xác trên mạch khuôn của gen Các promoter của các operon ở vi khuẩn nói chung có cấu trúc khá tương

đồng Đoạn trình tự quan trọng nhất của promoter được gọi là hộp TATA (TATA box) hay hộp Pribnow (Pribnow box) Đó là trình tự TATAAT nằm ở vị trí “-10'' (Hình 5.4) Ngoài ra, trong các promoter vi khuẩn còn có trình tự TTGACA ở gần vị trí ''-30'', gọi là đoạn nhận biết (recognition

sequence) Đối với các gen mã hóa protein eukaryote, nằm phía trước điểm bắt đầu phiên mã chừng

75 nucleotide có trình tự GGCCAAATCT, thường được gọi là hộp CCAAT (CCAAT box) - đọc là

“hộp cat”; nó đóng vai trò điều hòa tốc độ phiên mã (Hình 5.4)

* Lưu ý: Tất cả các trình tự tín hiệu đều được quy ước trên mạch đối khuôn của gen, vì chúng

có trình tự giống với ARN được tổng hợp (chỉ khác là bazơ T trong gen được thay bởi U trong ARN) Các ký hiệu dấu '−' và '+' chỉ các vị trí trước và sau vị trí bắt đầu phiên mã, còn gọi là các yếu tố

ngược dòng (upstream) và xuôi dòng (downstream)

Hình 5.4 Mô hình cấu trúc vùng khởi động (promoter) của E coli

1.4 Các giai đoạn của quá trình phiên mã ở E coli

- Giai đoạn bám và khởi đầu: Trước tiên, enzyme ARN polymerase hoàn chỉnh (holoenzyme)

nhận biết và bám chặt vào promoter sẽ tháo xoắn một vùng có kích thước khoảng 12-17 cặp bazơ Tổng hợp ARN thường được khởi đầu bằng nucleotide đầu tiên là ATP hoặc GTP Sau khi holoenzyme ARN polymerase tổng hợp được một vài nucleotide, nhân tố sigma tách ra để đi vào

một chu kỳ phiên mã khác, gọi là chu kỳ sigma (sigma cycle) (Hình 5.5)

- Giai đoạn kéo dài: Enzyme lõi tiến hành kéo dài chuỗi ARN theo chiều 5'→3' dọc theo

mạch khuôn có chiều ngược lại ARN polymerase lõi tiến đến đâu thì ADN được mở xoắn và phiên

mã đến đấy; và vùng ADN đã được phiên mã đóng xoắn trở lại

Hình 5.5 ARN polymerase bám promoter (trái) và các giai đoạn khởi đầu phiên mã ở E coli.

- Giai đoạn kết thúc: Khi quá trình phiên mã tổng hợp xong hai đoạn kết thúc giàu GC và AT

nằm đằng sau gen thì tại vùng đuôi mạch ARN hình thành cấu trúc ''kẹp tóc'' làm dừng sự phiên mã

của lõi ARN polymerase Việc kết thúc một số bản sao ARNcần tới yếu tố rho (ρ) có bản chất protein, khiến cho mạch ARN vừa được tổng hợp và enzyme lõi được giải phóng ra khỏi ADN khuôn (Hình 5.6 và 5.7)

Hình 5.6 Mô hình cấu trúc vùng kết thúc phiên mã (terminator) của prokaryote

77

Hình 5.7 Phiên mã ở E coli, với sự hình thành cấu trúc “kẹp tóc” và tham gia của yếu tố Rho ở

giai đoạn kết thúc phiên mã Lưu ý, ở vi khuẩn sự dịch mã mARN được bắt đầu trong khi phiên

mã đang còn tiếp diễn

1.5 Phiên mã và sửa đổi ARN sau phiên mã ở eukaryote

1.5.1 Các ARN polymerase ở eukaryote

Ở các eukaryote, có ba loại ARN polymerase I, II và III với sự phân bố và chức năng chuyên

hóa khác nhau đối với bộ gen trong nhân, như sau: ARN polymerase I ở trong hạch nhân (nucleolus) phiên mã phức hợp gen rARN cho sản phẩm gồm các rARN 18S, 28S và 5,8S; ARN polymerase II

có trong dịch nhân (nucleoplasm) phiên mã các gen mã hóa protein cho sản phẩm là các hARN -

tiền chất của các mARN và cả gen cho các kiểu snARN; ARN polymerase III có trong dịch nhân

phiên mã các gen tARN, rARN 5S, và cả snARN U6 Ngoài ra, ARN polymerase ở ty thể chịu trách nhiệm tổng hợp tất cả các ARN của ty thể (Bảng 5.2)

Bảng 5.2 Các ARN polymerase ở eukaryote

ARN polymerase I hạch nhân các rARN 18S, 28S và 5,8S

ARN polymerase II dịch nhân các mARN, snARN

(và snARN U1, U2, U3, U4, U5) ARN polymerase III dịch nhân các tARN, ARN 5S,

( và snARN U6, ARN 7S hay 7SL) ARN polymerase ty thể ty thể tất cả các ARN của ty thể

1.5.2 Các promoter ở eukaryote

Các vùng khởi động (promoter) nói chung nằm kề trước gen và có chứa các đoạn trình tự đặc

thù cho phép ARN polymerase nhận biết và bám chặt vào để khởi đầu phiên mã tại vị trí chính xác trên mạch khuôn của gen Vấn đề này tương đối phức tạp ở các eukaryote, vì vậy ở đây ta chỉ xét các promoter của các gen mã hóa protein mà không đề cập các loại promoter của các gen mã hóa các ARN khác

Các promoter của các gen mã hóa protein eukaryote và của operon vi khuẩn nói chung có cấu

trúc khá tương đồng nhau Nếu như hộp TATA ở vi khuẩn, có trình tự TATAAT nằm ở vị trí “-10'' thì

đối với các gen mã hóa protein của eukaryote, đó là trình tự TATAAA nằm gần vị trí “-30” (Hình 5.8)

và nó đặc trưng riêng cho các ARN polymerase II

Hình 5.8 Cấu trúc vùng khởi động (promoter) của eukaryote

Nói chung, các vùng này được bảo tồn cao và đặc thù cho từng loại ARN polymerase nhất định,

được gọi là các trình tự điều hòa (consensus sequences) Các đột biến thay thế bazơ tại các hộp

TATA, nghĩa là làm cho nó bớt giống với trình tự được bảo tồn (ví dụ, TATAAT → TGTAAT) do đó

sẽ làm yếu khả năng phiên mã của promoter (down mutation) Ngược lại, các đột biến làm cho các

trình tự promoter trở nên giống với các trình tự điều hòa (ví dụ, TATCTT→ TATAAT), sẽ làm mạnh

khả năng phiên mã của promoter (up mutation)

1.5.3 Sửa đổi sau phiên mã đối với sản phẩm của các gen phân đoạn

Để trở thành các phân tử mRNA trưởng thành có khả năng tham gia vào quá trình dịch mã trong

tế bào chất, tất cả các bản sao mARN (pre-mRNA) của các gen mã hóa protein ở tế bào eukaryote đều phải trải qua quá trình sửa đổi ARN sau phiên mã ở trong nhân (RNA processing) Sau đó các phân tử mARN đi ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã Hai sự kiện sửa đổi chính yếu đối với bản sao mARN, đó là:

– Gắn thêm chóp m7Gppp và đuôi poly(A); và

– Cắt bỏ các intron và nối các exon hay còn gọi là splicing

Các chóp 5' và đuôi poly(A) này có tác dụng bảo vệ mARN khỏi bị phân cắt bởi các enzyme trong tế bào chất (Hình 5.9) Về chi tiết, xem ở chương 6

Hình 5.9 Các bước tổng quát của quá trình phiên mã và sửa đổi sau phiên mã đối với bản sao

pre-79

2 Cấu trúc và chức năng của các ARN

Trên nguyên tắc, các ARN được cấu tạo từ các đơn phân là các ribonucleotide; các

ribonucleotide này nối kết với nhau bằng các liên kết 3',5'-phosphodiester tạo thành các chuỗi

polyribonucleotide - cấu trúc sơ cấp của các phân tử ARN (Chương 1) Đường pentose đặc trưng

của ARN là ribose, còn thành phần bazơ, ngoài bốn loại cơ bản adenine (A), uracil (U), guanine (G)

và cytosine (C), còn phát hiện khá nhiều dạng bazơ hiếm có mặt chủ yếu trong các tARN

Có ba loại phân tử ARN cơ bản tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của các tế bào,

đó là: ARN thông tin (messenger RNA = mRNA), ARN vận chuyển (transfer RNA = tRNA), và ARN ribosome (ribosomal RNA = rRNA)

Nói chung, các phân tử ARN có kích thước bé hơn các phân tử ADN ở bất kỳ sinh vật cụ thể nào Các phân tử ARN có thể là mạch đơn hoặc mạch kép, mạch thẳng hoặc mạch vòng nhưng phổ biến là dạng mạch đơn, thẳng (nhưng không thấy có các phân tử ARN mạch kép, vòng nào được mô tả) Loại ARN có hàm lượng cao nhất trong các tế bào là rARN

Ở Bảng 5.3 cho thấy hàm lượng tương đối (%) và kích thước (trọng lượng phân tử và số

nucleotide) của các phân tử ARN ở vi khuẩn E coli

Bảng 5.3 Các phân tử ARN ở E coli

Loại ARN Chức năng (%) TLPT Số nucleotide

mARN Mã hoá các protein 5 Biến thiên Biến thiên

rARN 5S Thành phần ribosome 80 3,6.101 120

16S Thành phần ribosome 0,55.103 1542 23S Thành phần ribosome 1,2.103 2904 Ngoài ba loại ARN chính (rARN, tARN và mARN) có mặt trong các tế bào prokaryote và

eukaryote, các tế bào eukaryote còn có các loại ARN khác, như: (i) ARN dị nhân, hnARN

(heterogenous nuclear RNA) với kích thước sai biệt rất lớn, chúng là tiền thân của các mARN

trưởng thành sau này; (ii) các ARN nhân kích thước bé, snARN (small nuclear RNA), với các loại

như U1 → U10 trong đó sáu loại đầu có vai trò quan trọng trong xử lý pre-mARN của các gen

phân đoạn; và (iii) ARN tế bào chất, scARN (small cytoplasmic RNA) 7SL cần cho tổng hợp các

protein chế tiết và bám vào màng; và một vài ARN khác nữa được giới thiệu ở Bảng 5.4

Bảng 5.4 Các lớp ARN chức năng chính và phụ trong các tế bào

1 Các lớp chính

mARN ARN được phiên mã từ các gen mã hoá protein, mang

thông tin cho dịch mã Một số bản sao tương tự mARN không được dịch mã, ví dụ XIST, H19 do cơ

chế in dấu bộ gen bố mẹ (parental imprinting)

hnARN

(heterogenous

mARN trước khi cắt-nối Đó là các bản sao chưa được sửa đổi của các gen eukaryote; sở dĩ gọi như

nuclear) vậy bởi vì tính đa dạng lớn về kích thước của nó so

với tARN và rARN

tARN Phân tử thích ứng thực hiện việc dịch mã tARN

cũng làm mồi cho tái bản ADN trong sự tái bản của các retrovirus

Các phân tử ARN trọng lượng phân tử thấp phát hiện được trong dịch nhân, là thành phần của các enzyme cắt bỏ các intron và các phản ứng xử lý (processing) khác; chúng chứa nhiều gốc uridine được sửa đổi

snoARN

(small nucleolar)

Các phân tử ARN trọng lượng phân tử thấp phát hiện được trong hạch nhân, có thể tham gia vào quá trình

xử lý rARN (ARN processing)

scARN (small

cytoplasmic)

Các phân tử ARN trọng lượng phân tử thấp phát hiện được trong tế bào chất với các chức năng khác nhau

Ví dụ ARN 7S thành phần của tiểu phần nhận biết tín

hiệu và pARN (prosomal), một ARN bé kết hợp với

khoảng 20 protein và được bọc gói với mARN trong

mRNP hay thể thông tin vốn có tác dụng điều hoà sự

biểu hiện của gen

ARN của telomerase

Một ARN nhân có chứa khuôn cho các đoạn lặp

telomere và là thành phần của enzyme telomerase

gARN

(guide RNA)

Một loại ARN được tổng hợp trong các roi động ở

Trypanosoma; nó cung cấp khuôn cho biên tập ARN

ARN antisense ARN ngược nghĩa bổ sung với mARN và có thể tạo

thành một mạch đôi với nó để kìm hãm việc tổng hợp protein Nó có trong nhiều hệ thống, nhưng rất phổ

biến ở vi khuẩn; và cũng gọi là ARN bổ sung gây nhiễu mARN

Ribozyme Các phân tử ARN mà có thể xúc tác cho các phản

ứng hoá học, các enzyme chứa ARN Thông thường

nó có hoạt tính tự xúc tác (các intron tự cắt), nhưng

một ribonuclease P là một chất xúc tác đích thực (ví

dụ xử lý tARN) Các ARN khác hoạt động hài hoà với

81

ADN ty thể

(i) Vùng dẫn đầu (5'UTR) không được dịch mã nhưng có cấu trúc cần thiết cho sự bám vào

của tiểu đơn vị ribosome bé (Hình 5.10)

(ii) Vùng mã hoá (coding region) nằm kề sau vùng 5'-UTR; nó mang thông tin cấu trúc của

một chuỗi polypeptide, nếu là mARN của eukaryote (monocistronic) hoặc mang thông tin của nhiều polypeptide khác nhau và cách nhau bởi các đoạn đệm không được dịch mã, nếu là mARN prokaryote (polycistronic)

(iii) Vùng kéo sau (3'-UTR) nằm ở đuôi mARN, không được dịch mã

2.1 ARN thông tin (mARN)

Các mARN là loại ARN quan trọng nhất được dùng làm khuôn trực tiếp cho quá trình tổng hợp polypeptide trong tế bào chất Nhìn chung, các mARN có cấu trúc mạch thẳng, với kích thước khác nhau và đều có ba phần chính như sau:

Hình 5.10 Cấu trúc chung của mARN

Hình 5.11 Cấu trúc của mARN prokaryote (a) và mARN eukaryote (b)

Ở Hình 5.11 cho thấy những điểm khác nhau trong cấu trúc của các mARN ở prokaryote và eukaryote, cho thấy cấu trúc “mũ” đặc trưng có mặt ở đầu 5' của tất cả các mARN trưởng thành ở eukaryote

Trong nhân các tế bào eukaryote có các ARN nhân kích thước lớn và sai khác nhau rất lớn gọi

là hnARN (heterogenous nuclear RNA) vốn là tiền thân của các mARN, các ARN nhân kích thước

bé snARN (small nuclear RNA) có mặt trong thành phần của các enzyme splicing, và các ARN tế bào chất kích thước bé scARN (small cytoplasmic RNA)

Trong các tế bào động vật có vú, một vài loại mARN thì hết sức phong phú, trong khi đó hầu như mức độ phức tạp của mARN (số lượng loại mARN khác nhau) được đại diện bởi các mARN hiếm Một điểm cần chú ý là sự biểu hiện của một gen tỷ lệ với độ phong phú của loại ARN tương

ứng (một gen biểu hiện càng mạnh khi số bản sao của nó trong tế bào càng lớn)

2.2 Các ARN vận chuyển (tARN)

Mỗi phân tử tARN có hai chức năng chính là mang axit amin đã được hoạt hoá và đi đến phức

hệ “ribosome-mARN” để tiến hành việc đọc dịch mã cho một codon cụ thể của mARN

Trong thành phần nucleotide của các tARN có khá nhiều bazơ chuẩn bị biến đổi thành các bazơ sửa đổi nhờ hoạt động xúc tác của các enzyme sau phiên mã Các bazơ này (còn gọi là các

bazơ hiếm) tập trung chủ yếu ở các vòng thân (stem loops) như: 5',6'-dihydrouridine (DHU),

inosine (I), ribothymidine (T), pseudouridine (Ψ) v.v (Hình 5.12)

Hình 5.12 Các bazơ hiếm có mặt trong ARN, chủ yếu là các tARN

Mỗi tế bào có chừng 45-50 phân tử tARN khác nhau Hầu hết các tARN có khoảng 75-80

nucleotide với cấu trúc bậc hai mở rộng do các tương tác cặp bazơ (A-U và G-C) ở một số đoạn của chúng (Hình 5.13) cũng như cấu trúc bậc ba Đây là kiểu cấu trúc “lá ba thùy” gọn nhẹ, vững

chắc phù hợp với các chức năng khác nhau của các tARN

Nói chung, các phân tử tARN thường rất giống nhau ở nhiều đoạn và khác nhau chủ yếu ở bộ

ba đối mã (anticodon) Lưu ý rằng, bazơ hiếm Inosine (I) có mặt ở vị trí 5' của anticodon trong một

số phân tử tARN có thể kết cặp linh hoạt với C, U hoặc A ở vị trí 3' của các codon trong mARN Mỗi tARN thường có 3-4 vòng trên thân (tính từ đầu 5') với chức năng khác nhau như sau (Hình 5.13):

(i) vòng I - DHU nhận biết aminoacyl-tARN synthetase;

(ii) vòng II - anticodon đọc mã trên mARN bằng sự kết cặp anticodon-codon (theo nguyên tắc

bổ nhưng có sự linh hoạt; chương 3);

(iii) vòng III - phụ (extra loop) có thể không có ở một số tARN;

(iv) vòng IV - TΨC nhận biết ribosome để đi vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl-tARN (vị trí

A)

Và cuối cùng, đoạn mạch thẳng -CCA ở đầu 3' là vị trí gắn vào của axit amin đã được hoạt

83

(b)

Hình 5.13 (a) Cấu trúc bậc hai (trái) và bậc ba của tARN-Ala (b) Một sơ đồ hóa khác về cấu trúc

của tARN (trái) và hoạt động dịch mã trên mARN theo nguyên tắc bổ sung – ngược chiều giữa anticodon và codon

2.3 ARN ribosome (rARN) và ribosome

Các rARN cùng với các protein đặc thù là những thành phần cấu trúc nên các ribosome là

“nhà máy” tổng hợp protein của tế bào

Ở vi khuẩn có 3 loại rARN có các hệ số lắng là 23S, 16S (Hình 5.14) và 5S, với số lượng nucleotide tương ứng là 2904, 1542 và 120 (Bảng 5.5) Ở tế bào eukaryote có 4 loại rARN với các

hệ số lắng là 28S, 18S, 5,8S và 5S (Hình 5.15) Riêng các tế bào thực vật còn có các rARN được

mã hoá bởi ADN lạp thể (chloroplast DNA = cpDNA)

Hình 5.14 Cấu trúc bậc hai của rARN 16S

Hình 5.15 Cấu trúc tổng quát các đơn vị phiên mã của pre-rARN ở các eukaryote Ba vùng

mã hóa (màu xanh) mã hóa các rARN 18S, 5.8S và 28S phát hiện được trong các ribosome của các eukaryote bậc cao hoặc một số loài tương đương với chúng Thứ tự các vùng mã hóa trong các bộ gen này luôn luôn theo chiều 5'→3' Sự thay đổi về độ dài các đoạn đệm được phiên mã (vàng nhạt) nói lên sự sai khác trong chiều dài của các đơn vị phiên mã (transcription unit) của pre-rARN ở các sinh vật khác nhau

Mỗi ribosome hoàn chỉnh có hai tiếu đơn vị bé và lớn Hai tiểu đơn vị này chỉ kết hợp với

nhau tạo ra một ribosome hoạt động khi quá trình dịch mã trên mARN thực sự bắt đầu Tiểu đơn vị

bé bám vào mARN trước tiên trong dịch mã Tiểu đơn vị lớn chứa hai vị trí: vị trí A là nơi bám vào của aminoacyl-tARN và vị trí P là chỗ dừng tạm của peptidyl-tARN Trong tiểu đơn vị lớn có chứa

peptidyl transferase Enzyme này có chức năng tách gốc peptidyl ra khỏi tARN của nó (ở vị trí P)

và nối với aminoacyl-tARN (ở vị trí A) bằng một liên kết peptide làm cho chuỗi polypeptide sinh trưởng dài ra theo chiều N→ C

Các hợp phần cấu tạo nên các ribosome của prokaryote và eukaryote được trình bày ở Bảng 5.5 và Hình 5.16

85

(c)

Hình 5.16 Cấu trúc ribosome của E coli (a) Ribosome 70S nhìn từ mặt bên với tiểu phần 30S

particle (màu vàng) và tiểu phần 50S (đỏ) đang dính với nhau (b) Ribosome 70S xoay một góc 90 độ so với hình (a) [Nguồn: J Lake (1976), J Mol Biol 105; p.155, fig.14] (c) Sơ

đồ các vị trí hoạt động của một ribosome

3 Dịch mã (Translation)

Dịch mã (translation) hay tổng hợp protein là một quá trình sinh học quan trọng diễn ra trong

tế bào chất, và phụ thuộc vào nhiều yếu tố; quan trọng nhất là các mARN, tARN và ribosome mARN mang thông tin quy định trình tự kết hợp các axit amin vào chuỗi polypeptide, mà việc dịch

mã mARN được thực hiện bởi các aminoacyl-tARN, còn ribosome đóng vai trò ổn định việc kết hợp giữa mARN với các tARN (Hình 5.18) Quá trình này được chia làm hai giai đoạn dưới đây

Bảng 5.5 Thành phần cấu tạo của ribosome ở Prokaryote và Eukaryote

rARN 16S (1.542 nt) 18S (1.874 nt) Protein 21 phân tử ~35 phân tử

3.1 Hoạt hoá axit amin

Quá trình này diễn ra trong bào tương tạo nguồn các tARN mang các axit amin sẵn sàng tham

gia dịch mã Mỗi axit amin được đính vào tARN thích hợp nhờ một enzyme aminoacyl-tARN synthetase đặc thù Trước tiên, enzyme này (E) xúc tác cho phản ứng ATP hoạt hoá axit amin, với

sự có mặt của Mg2+, tạo ra phức hợp [aminoacyl-AMP + E] (Hình 5.17)

R−CH(NH2)−COOH + ATP → E*[R−CH(NH2)−CO~AMP] + PP Tiếp theo, cũng dưới tác dụng của enzyme đó, phức hợp này kết hợp với tARN thích hợp

bằng liên kết đồng hoá trị để tạo ra aminoacyl-tARN

E*[R−CH(NH2)−CO~AMP] + tARN → R−CH(NH2)−CO~tARN + AMP

3.2 Cơ chế dịch mã (tổng hợp chuỗi polypeptide)

Bước 1: Mở đầu (initiation)

Quá trình dịch mã bắt đầu khi một tiểu đơn vị ribosome bé bám vào mARN tại vị trí của codon khởi đầu AUG Lúc này một phân tử tARN khởi đầu đặc thù mang methionine (ở vi khuẩn là formyl-Met; cấu trúc của Met và f-Met được giới thiệu dưới đây) đi vào và khớp anticodon của nó với codon mở đầu của mARN Kế đó, tiểu đơn vị ribosome lớn bám vào tiểu đơn vị bé tạo ra một ribosome hoạt động hoàn chỉnh Lúc này Met-tARN ở vị trí P và vị trí A để trống; một tARN thứ hai (aa2- tARN) đi vào vị trí A và khớp với codon thứ hai (Hình 5.20)

H 2 N-C-C-OH H

tRNA

H 2 N-C-C-O H

3’

Ho ạ t hoá amino acid và

g ắ n aa vào tRNA

Hình 5.17 Sự hoạt hoá axit amin và gắn axit amin đã hoạt hoá vào tARN

Hình 5.18 Một ribosome đang tham gia dịch mã trên mARN cùng với các tARN mang các axir

amin tương ứng

Ở E coli, bước này có sự tham gia của các yếu tố mở đầu (IF-1, IF-2 và IF-3), GTP và đặc

87

vào mARN, nhận biết codon mở đầu AUG để có thể bắt đầu quá trình dịch mã tại vị trí chính xác (Hình 5.19)

Hình 5.19 Mở đầu dịch mã ở tế bào E coli (trên) và trình tự Shine-Dalgarno ở vùng 5'UTR của E

coli và các phage của chúng

Bước 2: Kéo dài (elongation)

Quá trình kéo dài bắt đầu sau khi liên kết peptide đầu tiên được hình thành Phản ứng này

được xúc tác bởi enzyme peptidyl transferase, và kết quả là tạo ra một peptidyl-tARN ở vị trí A

(fMet-aa2-tARN) Sau đó, ribosome lập tức chuyển dịch sang một codon mới dọc theo mARN theo chiều 5'→3' Phản ứng này đẩy phân tử tARN tự do vốn ở vị trí P ra ngoài; lúc này peptidyl-tARN (fMet-aa2-tARN) nằm ở vị trí P và vị trí A lại để trống Một chu kỳ dịch mã mới lại bắt đầu, một aminoacyl-tARN thứ ba (aa3-tARN) đi vào và khớp anticdon của nó với codon đang để trống ở vị trí A, một liên kết peptid thứ hai được hình thành (fMet-aa2-aa3-tARN), và ribosome lại dịch chuyển sang codon kế tiếp Quá trình nói trên diễn ra một cách tuần tự dọc theo mARN theo chu kỳ ba bước nói trên, và làm cho chuỗi polypeptide dài dần ra cho đến dịch mã xong codon có nghĩa cuối cùng (Hình 5.21)

Bước 3: Kết thúc (termination)

Quá trình tổng hợp chuỗi polypeptide sẽ dừng lại khi một codon kết thúc được đưa đối diện

với vị trí A để trống, vốn được nhận biết bởi một protein kết thúc gọi là nhân tố giải phóng RF

(release factor) Sự có mặt của nó cùng với transferase cắt rời chuỗi polypeptide ra khỏi tARN cuối cùng và phóng thích hai tiểu đơn vị ribosome cũng như chuỗi polypeptide và tARN ra khỏi mARN (Hình 5.22)

Hình 5.20 Mở đầu dịch mã ở tế bào E coli Hình dưới phân biệt cấu tạo của N-formylmethionine

- axit amin Met đã được sửa đổi để chỉ chuyên làm nhiệm vụ mở đầu cho quá trình dịch mã ở

tế bào vi khuẩn (nó được nhận biết và mang bởi một loại tARN mở đầu gọi là tRNAifMet) với loại Methionine bình thường

Hình 5.21 Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi polypeptide

89

Hình 5.22 Quá trình kết thúc tổng hợp chuỗi polypeptide

4 Những điểm khác biệt trong phiên mã và dịch mã ở prokaryote và eukaryote

(1) Trên đây mới chỉ phân tích hoạt động của một ribosome trên mARN Thực ra, trên một

mARN có rất nhiều ribosome cùng hoạt động, gọi là polyribosome hay polysome, tạo ra nhiều

polypeptide giống nhau

Hình 5.23 Nhiều ribosome (polysome) nối đuôi nhau trượt qua mARN để tổng hợp hàng loạt

polypeptide trên một phân tử mARN

(2) Trên nguyên tắc, axit amin mở đầu sẽ được cắt bỏ khỏi chuỗi polypeptide (sau khi tổng hợp được vài axit amin như trong trường hợp các vi khuẩn) hoặc trước khi chuỗi được tổng hợp đầy

đủ (như ở trường hợp eukaryote) Tuy nhiên, ở các eukaryote không phải lúc nào axit amin mở đầu này cũng bị tách bỏ, mà trong một số protein nó vẫn được giữ lại

(3) Sau khi được tổng hợp, các chuỗi polypeptide sơ cấp này sẽ được sửa đổi và chuyển sang các bậc cấu trúc cao hơn theo cách đặc thù để trở thành các protein hoạt động chức năng

(4) Tham gia vào các bước mở đầu, kéo dài và kết thúc còn có các yếu tố protein, với tên gọi

tương ứng là các nhân tố mở đầu (IF: initiation factor), nhân tố kéo dài (EF: elongation factor; gồm EF-Tu và EF-G), và nhân tố giải phóng (release factor) với GTP và các ion Mg2+, K+ và NH+4 (5) Trong các tế bào prokaryote, do không có màng nhân và các mARN đa cistron vốn dĩ không phải qua sửa đổi sau phiên mã, cho nên các ribosome và các aminoacyl-tARN sẽ bám vào đầu 5' của mARN để bắt đầu quá trình dịch mã ngay trong khi ở đầu 3' của nó quá trình phiên mã đang còn tiếp diễn Ngược lại, ở các tế bào eukaryote vì có màng nhân phân cách và các pre-mARN còn phải trải qua các công đoạn sửa đổi phức tạp sau phiên mã (tất cả đều diễn ra trong nhân), còn dịch mã diễn ra sau đó ở trong tế bào chất Vì thế cho nên phiên mã và dịch mã rõ ràng là hai quá trình tách biệt nhau cả về cả không gian lẫn thời gian

TÓM TẮT

(1) Phiên mã và dịch mã là hai hai giai đọan chính trong sự biểu hiện của các gen mã hóa protein ở các tế bào Phiên mã là quá trình tổng hợp các ARN từ mạch khuôn của các gen cấu trúc, xảy ra dưới tác dụng của các ARN polymerase theo nguyên tắc bổ sung và ngược chiều với mạch khuôn của gen Còn quá trình tổng hợp protein diễn ra tại các ribosome trong tế bào chất trên khuôn của mARN, với sự tham gia của các tARN

(2) Trong khi sự phiên mã tất cả các gen trong bộ gen ở sinh vật nhân sơ chỉ do 1 loại ARN polymerase đảm nhận, thì ở các tế bào sinh vật nhân chuẩn có tới 3 loại ARN polymerase I, II và III chịu trách nhiệm tổng hợp các loại ARN khác nhau của tế bào Promoter là cơ chất tác động chính của các ARN polymerase, chúng có các trình tự bảo tồn cao độ - gọi là hộp TATA

(3) Trong mọi tế bào đều có ba loại phân tử ARN tham gia vào quá trình tổng hợp protein:

mARN, tARN và rARN Ở các tế bào nhân chuẩn còn có nhiều loại ARN khác nữa thực hiện các

chức năng khác nhau

(4) Tổng hợp protein là quá trình phức tạp có sự tham gia của nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là các mARN, tARN và ribosome cũng như các enzyme và nguồn năng lượng cần thiết Kết quả là tổng hợp ra các phân tử protein tham gia vào mọi hoạt động sống cơ sở của tế bào

CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP

81.Trong quá trình dịch mã, ribosome dịch chuyển trên mARN ngay sau khi khớp bổ sung giữa anticodon và codon

(a) Đúng (b) Sai

82.Về mặt tổ chức, mARN trưởng thành của prokaryote khác biệt một cách căn bản với mARN của eukaryote chủ yếu ở vùng nào?

A Vùng khởi động B Vùng mã hoá protein

C Vùng theo sau hay 3'-UTR D Vùng dẫn đầu hay 5'-UTR

83.Phiên mã là quá trình tổng hợp các ARN theo chiều _ dưới tác dụng của ARN polymerase hoạt động dọc theo mạch khuôn có chiều

A 5' đến 3'; 5' đến 3 B 5' đến 3'; 3' đến 5'

91

84 Phát biểu nào sau đây về các gen mã hoá các histone là không đúng?

A Đằng sau các gen không có trình tự AATAAA

B Các mARN trưởng thành không có đuôi poly(A)

C Các mARN của chúng không có chóp m7Gppp

D Không có quá trình cắt-nối (splicing) sau phiên mã

85.Sự đọc mã trên mARN diễn ra trung thực là do

A peptidyl transferase B đoạn -CCA (3’)

C aminoacyl~tARN synthetase D anticodon của tARN

86.Phân tích cấu trúc và tổ chức của một gen điển hình cho bộ gen các sinh vật nhân chuẩn và vẽ một sơ đồ minh họa

87.Một đoạn trình tự bazơ ở mạch đối khuôn của một gen mã hóa protein như sau:

5'-AACGTATTCAACTCA-3' Hãy cho biết: (a) Trình tự bazơ của ARNm và trình tự axit amin tương ứng (b) Đoạn polypeptid sẽ như thế nào nếu một đột biến đồng hoán xảy ra đối với nucleotid G trên mạch này?

88.Một đoạn trình tự của gen được cho như sau:

Hãy xác định trình tự nucleotide của gen và trình tự axit amin của protein

90.(a) Hàm lượng GC của ADN phage T3 là 53% Bạn sẽ kỳ vọng hàm lượng G+C của mARN T3

ra sao? (b) Nếu cho trước hàm lượng purin của ADN T3 và không biết mạch nào được sao mã, bạn có thể dự đoán hàm lượng purin của mARN T3? Tại sao, hoặc tại sao không?

91.Phân tích ngắn gọn vai trò của các yếu tố tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein ở tế bào chất

92.Anh (chị) hãy làm sáng tỏ nhận định sau: Khác với các tế bào tiền nhân, sự phiên mã và dịch mã

ở các tế bào nhân chuẩn là các quá trình gián đoạn, tách biệt nhau cả về không gian lẫn thời gian

93.Phân tích sự tương tác giữa ba thành phần chính là mARN, các aminoacyl~ARNt và ribosome

để làm nổi bật vai trò quan trọng của chúng trong cơ chế tổng hợp chuỗi polypeptit

94.Hãy chỉ ra những đặc điểm giống và khác nhau trong cấu trúc của các mARN trưởng thành của các tế bào prokaryote và eukaryote

95.Nêu những điểm chính trong sửa đổi sau phiên mã đối với sản phẩm phiên mã sơ cấp của các gen phân đoạn và vai trò của các intron

96.Phân tích sự phù hợp giữa cấu trúc và chức năng của các mARN

97.Phân tích sự phù hợp giữa cấu trúc và chức năng của các tARN

98.Có những loại rARN nào trong các tế bào prokaryote và eukaryote? Chúng đóng vai trò gì trong

Sợi 1 là sợi không làm khuôn Sợi 3 là ARN sinh ra Hãy đánh dấu các đầu 5’ và 3’ của ARN

và sợi không làm khuôn, và của sợi khuôn

93

Chương 6 ĐIỀU HOÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN

Trên thực tế, các gen không tồn tại riêng rẽ và hoạt động như những thực thể biệt lập với một cường độ ổn định Trái lại, giữa các gen trong bộ gen có sự kiểm soát lẫn nhau và phụ thuộc vào điều kiện môi trường Mỗi bộ gen tế bào là một hệ thống mở có khả năng tự điều chỉnh, đảm bảo sự hoạt động của các gen trong từng giai đoạn phát triển diễn ra hợp lý trước điều kiện cụ thể của môi trường Sự điều hoà hoạt động của các gen được biểu hiện ở nhiều mức độ theo những cơ chế đặc thù cho từng nhóm loài Đây là khía cạnh phức tạp nhất của sinh học phân tử Hiểu được các nguyên lý của điều hòa hoạt động gen là nắm được chìa khóa đi vào bí ẩn của sự tồn tại được cất giấu kỹ trong các bộ gen

Trong chương này, chúng ta lần lượt tìm hiểu các vấn đề sau: (i) Các nguyên lý chung trong sự điều hòa biểu hiện của gen ở các mức độ khác nhau của cả hai hệ thống, prokaryote và eukaryote, mà trọng tâm là điều hoà hoạt động gen của vi khuẩn ở mức phiên mã (ii) Mô hình operon là gì? Ở vi khuẩn có các hệ thống operon nào và cơ chế điều hòa hoạt động của chúng ra sao? (iii) Ở eukaryote

có các kiểu điều hòa cơ bản nào?

1 Đại cương về sự điều hòa biểu hiện của gen

Nói chung, sự điều hoà biểu hiện của gen ở các nhóm prokaryote và eukaryote diễn ra ở nhiều mức độ: phiên mã, sau phiên mã, dịch mã và sau dịch mã Tuy nhiên, hai nhóm này có trình độ tiến hóa khác nhau nên phương thức tổ chức và điều hòa hoạt động của các gen là rất khác nhau

Ở vi khuẩn, các gen liên quan với nhau về chức năng được xếp trong một tổ chức gọi là

operon; chúng được phiên mã chung trong một phân tử mARN đa cistron và được dịch mã thành

các protein trong khi phiên mã mà không phải trải qua quá trình sửa đổi sau phiên mã, ngoại trừ các gen mã hóa các tARN và rARN Sự điều hòa sau dịch mã ở vi khuẩn, như đã xét ở chương trước, chủ yếu xảy ra ở giai đoạn mở đầu quá trình dịch mã, do sự tương tác giữa trình tự Shine-Dalgarno

ở vùng 5'-UTR của mARN với trình tự tương ứng trong rARN 16S của tiểu đơn vị ribosome bé Trong khi đó ở sinh vật nhân chuẩn, hầu hết các gen là gen phân đoạn và không có tổ chức kiểu operon như ở sinh vật nhân sơ Các gen phiên mã riêng biệt tạo thành các bản sao đơn sơ cấp gọi là pre-mARN đơn cistron; nó cũng có các exon và intron y như trong gen Để có thể trỏ thành các phân tử mARN trưởng thành đi ra tế bào chất làm khuôn cho tổng hợp protein, các pre-mARN

này phải trải qua các quá trình sửa đổi ở trong nhân, bao gồm: Lắp chóp m7Gppp ở đầu 5' và gắn

đuôi poly(A) ở đầu 3', và sau đó là cắt bỏ các intron trong một quá trình gọi là splicing Ở nhiều gen

còn có quá trình cắt nối chọn lọc tạo ra nhiều phân tử mARN khác nhau và do đó tạo ra nhiều

protein hay peptide khác nhau từ sản phẩm pre-mARN của cùng một gen phân đoạn

Hình 6.1 Những điểm khác biệt nổi bật trong tổ chức và hoạt động của các gen mã hóa protein ở

prokaryote (A) và eukaryote (B)

2 Điều hoà biểu hiện gen ở prokaryote

2.1 Cấu trúc Operon

Phần lớn các gen trong bộ gen vi khuẩn được tổ chức thành các đơn vị hoạt động chức năng

đặc trưng, gọi là các operon Các gen cấu trúc trong một operon được điều hoà chung trong quá

trình chuyển hoá một hợp chất nhất định của tế bào Mô hình operon được F Jacob và J Monod

(1961) đưa ra lần đầu tiên là operon Lactose (lac operon; để cho tiện ta viết: operon Lac) vốn được

nghiên cứu kỹ nhất cho đến nay (Hình 6.2)

Tham gia vào điều hòa hoạt động của một operon gồm có bốn yếu tố thuộc hai thành phần

chính: (i) các locus cấu trúc (structural loci) và (ii) các locus điều hòa (regulatory loci); trong đó

nhóm sau bao gồm yếu tố vận hành, vùng khởi động và gen điều hòa

- Một nhóm các gen cấu trúc (structural genes) liên quan về mặt chức năng, xếp cạnh nhau, khi phiên mã sẽ tạo ra một phân tử mARN chung gọi là mARN đa cistron (polycistronic mRNA) Đối với operon Lac, đó là ba gen: lacZ, lacY và lacA; trong đó lacZ mã hoá β-galactosidase (thuỷ

phân lactose thành galactose và glucose), lacY xác định permease (vận chuyển lactose qua màng) và lacA mã hoá transacetylase

- Một yếu tố vận hành (operator = O): trình tự ADN nằm kế trước nhóm gen cấu trúc, là vị trí tương tác với chất ức chế Đối với operon-lac, đó là đoạn trình tự ADN dài 34 cặp bazơ cách gen Z

chừng 10 cặp bazơ về phía trước Nó chứa trình tự 24 cặp bazơ đối xứng xuôi ngược, giúp chất ức chế có thể nhận biết và bám vào bằng cách khuếch tán dọc theo ADN từ cả hai phía (Hình 6.2)

95

Hình 6.2 Mô hình operon lactose ở E coli (hình trên) và sự phân giải phân tử đường lactose thành

glucose và galactose bởi enzyme β-galactosidase

- Một vùng khởi động (promoter region = P): trình tự ADN nằm trước yếu tố vận hành và có

thể trùm lên một phần hoặc toàn bộ vùng này, là vị trí bám vào của ARN polymerase Đối với operon Lac, đó là đoạn ADN đặc thù vài chục cặp bazơ nằm trước yếu tố vận hành O và gối lên nó

7 cặp bazơ Điểm khởi đầu phiên mã là vị trí gần cuối của vùng khởi động P nằm trong đoạn vận hành O

- Một gen điều hoà hay còn gọi là gen ức chế (regulatory/ inhibitory gene = R/I): Gen này sinh ra loại protein điều hoà gọi là chất ức chế (repressor) điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc thông qua sự tương tác với yếu tố vận hành Đối với operon Lac, gen lacI nằm trước vùng khởi

động P, nó mã hoá một chất ức chế gồm bốn polypeptide giống nhau đều chứa 360 axit amin và tự

nó có ái lực với vùng O Mặc dù mỗi gen điều hòa có một vùng khởi động và không có yếu tố vận

hành riêng, đôi khi người ta vẫn coi chúng là operon điều hòa (có tính chất cơ định)

Tóm lại, operon là đơn vị điều hoà hoạt động gen của các prokaryote, đặc trưng bởi phức hợp liên kết giữa vùng khởi động cùng với yếu tố vận hành và nhóm gen cấu trúc do nó kiểm soát

- Ở vi khuẩn, mỗi một đột biến gen nếu như làm thay đổi một đặc tính sinh lý - sinh hóa (kiểu

hình) của tế bào được coi là tạo ra một nòi mới

- Kiểu gen của vi khuẩn là đơn bội Tuy nhiên, bộ gen các tế bào vi khuẩn cũng có thể ở trạng

thái lưỡng bội một phần; ấy là do ở vi khuẩn có các phương thức trao đổi di truyền thông qua các quá trình sau: tiếp hợp (conjugation), biến nạp (transformation) và tải nạp (transduction) Hình thức sinh sản này được gọi là sinh sản cận hữu tính (parasexual reproduction) chứ không phải hữu tính

2.2 Điều hoà hoạt động của Operon lactose (lac operon)

2.2.1 Điều hoà âm tính Operon lactose

Khi trong môi trường nuôi cấy E coli không có lactose (chất cảm ứng) thì operon không hoạt

động, nghĩa là các enzyme tham gia phân giải lactose không được sinh ra Nguyên nhân là do chất

ức chế bám chặt vào yếu tố vận hành gây ức chế sự phiên mã của các gen cấu trúc

Hình 6.3 Cơ chế điều hòa âm tính của operon Lac (a) Khi môi trường vắng mắt lactose, operon rơi

vào trạng thái bị ức chế (b) Khi môi trường có mắt lactose, operon được khử ức chế

Hình 6.4 Chất cảm ứng allolactose (liên kết β-1,6 glycoside) do lactose (liên kết β-1,4) biến đổi

thành dưới tác dụng của enzyme β-galactosidase

Ngược lại, nếu bổ sung lactose vào môi trường thì một thời gian sau vi khuẩn sẽ bắt đầu hấp thụ và phân giải nó, nghĩa là các enzyme liên quan đã được sinh ra Sự kiện này được lý giải như

sau: Chất cảm ứng (inducer) ở đây là allolactose (liên kết β-1,6 glycoside) – một dạng đồng phân của lactose (liên kết β-1,4) – tương tác với chất ức chế (repressor) và làm biến đổi hình dáng của

chất này Vì vậy chất ức chế mất ái lực và không thể bám vào yếu tố vận hành Lúc này các gen cấu trúc được phiên mã và tổng hợp các enzyme tương ứng giúp vi khuẩn hấp thụ và phân giải đường lactose như một nguồn năng lượng và carbon Lactose vì vậy là tác nhân gây cảm ứng (hoạt hóa) operon

2.2.2 Điều hoà dương tính Operon lactose

Hoạt động của operon-lac còn chịu sự kiểm soát của một protein điều hoà dương tính liên quan với sự có mặt của glucose

97

Hình 6.5 Điều hòa dương tính của operon Lac

Khi trong môi trường có mặt đồng thời cả lactose và glucose thì operon Lac tạm ngưng hoạt

động gọi là ức chế dị hoá tạm thời Khi glucose có mặt ở nồng độ cao thì hàm lượng AMP vòng

(cyclic AMP = cAMP) trong tế bào rất thấp; và ngược lại, khi không có glucose hoặc có không đáng kể thì hàm lượng cAMP tăng cao Vì vậy, cAMP được xem là chất chỉ thị của sự vắng mặt

glucose Ngoài ra còn phát hiện một loại protein điều hoà dương tính có tên là protein hoạt hoá dị hoá (catabolite activator protein = CAP) Protein CAP gồm hai tiểu đơn vị giống nhau gọi là homodimer; nó chỉ hoạt động khi môi trường nội bào có hàm lượng cAMP cao Lúc này cAMP kết

hợp với CAP tạo ra phức hợp CAP-cAMP hoạt động; phức hợp này có khả năng nhận biết và bám

vào một đoạn 16 cặp bazơ về phía trước của vùng khởi động, với các đoạn lặp đảo ngược, gọi là vị trí CAP Qua đó ARN polymerase được kích thích bám vào vị trí P và bắt đầu phiên mã ở mức cao Tóm lại, phức hợp CAP-cAMP kích thích phiên mã của operon Lac (lac operon) bằng việc

bám vào vị trí kích hoạt (activator site) nằm sát trước promoter và thúc đẩy ARN polymerase bám vào promoter

Hình 6.6 (a) CAP gồm hai monomer giống nhau, mỗi monomer nhận biết một trình tự ADN nhờ

vùng xoắn alpha; (b) Trình tự đối xứng của vị trí CAP được xem là các đoạn lặp đảo ngược; (c) Cấu trúc phân tử cAMP; (d) Kích thích tổng hợp enzyme β-galactosidase

bằng cAMP với kiểu dại và CAP dạng đột biến

Pastan và cs thí nghiệm trên các tế bào vi khuẩn sống tự do để tạo ra β-galactosidase khi có mặt cAMP với kiểu dại, hoặc một dạng chiết xuất từ các tế bào đột biến có CAP với ái lực giảm sút đối với cAMP Thể đột biến này tạo ra hàm lượng β-galactosidase ít hơn nhiều, điều đó làm ta

kỳ vọng nếu như phức hợp CAP-cAMP là quan trọng trong phiên mã operon Tuy nhiên, khi hàm lượng cAMP tăng cao quá hiển nhiên là nó gây nhiễu sự tổng hợp β-galactosidase ở tế bào kiểu dại Điều này không khiến ta ngạc nhiên vì cAMP có nhiểu tác dụng, và một số có thể ức chế gián

tiếp một số bước trong sự biểu hiện in vitro của gen lacZ (Emmer et al, 1970)

Hình 6.7 Vị trí bám của CAP và của ARN polymerase ở vùng khởi động của operon Lac (hình

trên) Cấu trúc của phức hợp CAP-cAMP bám vào ADN (hình trái, dưới) và giả thuyết về

sự kích hoạt phiên mã operon Lac bởi phức hợp hay dimer CAP-cAMP (Theo S Busby

và R.H Ebright 1994)

2.3 Điều hoà hoạt động của Operon tryptophan (trp operon)

Đại diện cho tất cả các operon của các loại axit amin và các vitamin là operon tryptophan (trp

operon) Để cho tiện ta viết: operon Trp

2.3.1 Cấu trúc của trp operon

Operon tryptophan của E coli có chứa năm gen cấu trúc (trpE, trpD, trpC, trpB và trpA) mã

hoá cho các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp axit amin tryptophan Ngoài ra, nó có một số đặc điểm khác như: trình tự operator nằm lọt trong promoter, còn gen điều hoà nằm cách xa

operon về phía trước, bình thường chất ức chế (trp repressor hay aporepressor) của operon tự nó

không bám được vùng vận hành O Operon Trp cũng chịu sự điều hoà âm tính như operon Lac;

nó chỉ hoạt động khi môi trường nội bào thiếu hụt tryptophan và không hoạt động khi dư thừa

tryptophan, sản phẩm cuối của con đường sinh tổng hợp Vì vậy operon Trp được gọi là operon

ức chế (repressible) hay operon đồng hoá

99

Hình 6.8 (a) Cấu trúc của operon tryptophan (b) Ký hiệu các vùng điều hòa của operon Trp (c)

Đại cương về trạng thái hoạt động và bất hoạt của operon

2.3.2 Cơ chế điều hoà âm tính của trp operon

Khi trong tế bào E coli dư thừa axit amin tryptophan (sản phẩm cuối cùng của con đường chuyển hoá) thì trp operon ngừng hoạt động và do đó các enzyme tổng hợp chúng không được tạo

ra Sự kiện này được giải thích như sau: Bình thường chất ức chế của operon này (trp repressor) tồn tại ở trạng thái bất hoạt, không có ái lực đối với yếu tố vận hành (trp operator) Nhưng khi các axit

amin này dư thừa sẽ kết hợp vào chất ức chế và tạo ra phức hợp có có ái lực với yếu tố vận hành

Tryptophan vì vậy được gọi là chất đồng ức chế (co-repressor) Phức hợp này bám vào yếu tố vận hành làm kìm hãm sự phiên mã của trp operon

Ngược lại, khi trong tế bào vắng mặt hay thiếu hụt axit amin này, vì chất ức chế vốn ở trạng thái bất hoạt không bám được vào yếu tố O, dẫn đến ARN polymerase bám promoter và tiến hành phiên mã các gen Kết quả là các enzyme tham gia tổng hợp tryptophan được sinh ra Một khi hàm lượng axit amin này được tổng hợp ở mức dư thừa sẽ tác động ngược trở lại, kìm hãm hoạt động của operon Trp

Hình 6.9 Operon tryptophan ở trạng thái bị hoạt động (a) và kìm hãm (b)

Tóm lại, nhờ có các cơ chế điều hòa hoạt động gen theo kiểu phản hồi như thế mà bộ gen vi khuẩn có thể hoạt động một cách nhịp nhàng hợp lý, từ đó vi khuẩn có thể thích nghi và phát triển trước các điều kiện môi trường không ngừng thay đổi

2.3.3 Sự kết thúc phiên mã sớm ở trp operon

Phiên mã dở (attenuation) là một cơ chế điều hoà gây ra sự kết thúc phiên mã sớm dưới

những điều kiện nhất định; bằng cách đó nó ngăn cản sự biểu hiện sản phẩm của mARN Sự phiên

mã dở tạo ra mARN uốn gập một cách điển hình thành các cấu trúc bậc hai xen kẻ, một trong số đó

là yếu tố kết thúc độc lập ρ (Rho-independent terminator)

Đối với operon tryptophan, đó là việc sử dụng dịch mã để điều khiển sự phiên mã Khi có mặt tryptophan trong môi trường nội bào, thậm chí ở nồng độ thấp, sẽ xảy ra sự dịch mã một phần ở đoạn dẫn dầu (leader) của mARN đang được tổng hợp Kết quả là làm dừng sự phiên mã trước khi

gen cấu trúc đầu tiên (trpE) của operon được phiên mã

Sự kết thúc phiên mã sớm ở operon tryptophan là kết quả của sự tương tác bổ sung nội phân

tử giữa các trình tự ADN bên trong vùng leader của bản sao ARN Hệ quả của sự kết thúc phiên mã sớm này tạo ra một mARN chứa 140 bazơ Tại vùng đầu mút 3' của nó xảy ra sự tự bổ sung ở đoạn giàu GC tạo thành một cấu trúc hình vòng trên thân ARN và gây ra sự kết thúc phiên mã sớm Vùng

này được gọi là đoạn phiên mã dở (trp attenuator) và ở phần đuôi của mARN này cũng có 8 bazơ

uridine Kiểu cấu trúc “kẹp tóc” này là tín hiệu kiểm soát kết thúc phiên mã ở prokaryote nói chung

Hình 6.10 (a) Cấu trúc đoạn dẫn đầu - TrpL của trp operon (b) Khi mức tryptophan cao, xảy ra sự

kết thúc phiên mã sớm tại trp attenuator với một cái đuôi 3' gồm 8 uridine (c) Khi mức tryptophan thấp, sự phiên mã tiếp diễn

Với kiểu cấu trúc đặc thù ở đoạn dẫn đầu của operon Trp làm cho nó có ý nghĩa quan trọng trong điều hoà phiên mã dở, ở chỗ: (i) tổng hợp một peptide dẫn đầu chứa 14 axit amin; (ii) trên mARN của đoạn peptide này chứa hai codon của Trp ở các vị trí 10 và 11; (iii) ở bốn vùng được đánh số 1–4 xảy ra sự tự bổ sung giữa các vùng 1 và 2, và giữa 3 và 4; ở một số trường hợp có thể

101

Do trong trình tự mã hóa của đoạn dẫn đầu trpL có hai codon Trp, nên sự dịch mã đoạn này tỏ

ra nhạy cảm với số lượng tARNtrp đưa vào Nếu môi trường cung cấp đầy đủ Trp, ribosome trượt qua các codon Trp để đi vào vùng 2 Và sự có mặt của ribosome ở vùng 2 ngăn cản vùng này kết cặp với vùng 3 Khi đó vùng 3 sẽ cặp với vùng 4 và tạo ra điểm kết thúc phiên mã sớm (xảy ra sau khi tổng hợp xong 8 uridine ở ngay sau vùng 4) Khi số lượng tARNTrp đưa vào không đầy đủ, sự dịch mã đoạn dẫn đầu dừng lại đột ngột ở các codon Trp của nó Điều này ngăn cản ribosome tiến

vào vùng 2, do đó vùng này sẽ cặp với vùng 3 gây cản trở việc tạo thành cấu trúc phiên mã dở (trp

attenuator) Kết quả là phân tử mARN đa cistron của operon Trp được tạo thành một cách đầy đủ

2.4 Điều hoà ở mức dịch mã

Hình 6.11 Sự tương tác giữa đoạn trình tự Shine-Dalgarno của mARN và trình tự tương ứng ở đầu

3' của rARN 16S trong tiểu đơn vị ribosome bé của vi khuẩn, qua đó ribosome bám vào vùng 5'UTR của mARN (M.W.King 1996)

Hiệu quả của sự khởi đầu dịch mã thường phụ thuộc vào trình tự giàu purine ở vùng 5'-UTR

Đó là 6-8 bazơ (thường gặp là AGGAGGU) nằm ngay trước codon khởi đầu AUG của mARN Đoạn này bám vào tiểu đơn vị ribosome bé trước khi bắt đầu dịch mã, đã được J Shine và L

Dalgarno xác định lần đầu tiên năm 1974 Vì vậy nó được gọi là trình tự Shine-Dalgarno (Hình

6.11) Các tác giả này cho rằng hầu như có sự bổ sung chính xác giữa đoạn trình tự này (ở đầu 5' của mARN) và vùng tương ứng ở đầu 3' của rARN 16S Điều đó phù hợp với hiện tượng cố định bước đầu phân tử mARN trên tiểu đơn vị 30S Thông thường, ở các mARN được dịch mã có hiệu quả nhất thì vùng bám vào ribosome thường nằm cách codon khởi đầu khoảng 8 nucleotide về phía trước Nếu như đột biến xảy ra ở vùng này thì có thể làm giảm đột ngột hiệu quả dịch mã trên mARN Tuy nhiên, chỉ riêng sự có mặt của trình tự Shine-Dalgarno phân bố chuẩn vẫn chưa đủ đảm bảo cho sự khởi đầu dịch mã Trên thực tế, có nhiều trình tự như thế bị che khuất bởi các cấu trúc “kẹp tóc”, vì vậy nó không thể tham gia tương tác với vùng tương ứng của rARN 16S

Các số liệu thu được cho thấy hiệu quả của việc sử dụng trình tự Shine-Dalgarno nhất định có thể “chế tác” các protein mà đến lượt chúng lại bám vào trình tự đó và ngăn cản nó Được nghiên

cứu chi tiết nhất là các protein của ribosome ở E coli Khi tốc độ tổng hợp các protein này vượt quá

mức sản sinh các rARN thì sẽ xảy ra sự tích luỹ các protein ribosome tự do Số protein dư thừa này được gọi là các protein “khoá”; chúng bám vào trình tự Shine-Dalgarno trong các mARN tương

ứng Nhờ vậy, tốc độ tổng hợp các protein ribosome được duy trì ở mức không vượt quá khả năng

sử dụng chúng để cấu thành các ribosome Có thể nói, sự điều hoà ở mức dịch mã là sự “cạnh tranh” giữa rARN và mARN của các protein ribosome, gây ra sự kết hợp với các protein “khoá” này Khi sự dịch mã mARN của các protein ribosome không thể tiếp diễn được nữa (do sự bám dính bởi các protein “khoá”) thì các mARN này sẽ bị thoái hoá nhanh hơn bình thường

3 Điều hoà biểu hiện gen ở eukaryote

3.1 Điều hoà biểu hiện gen ở eukaryote

Rõ ràng, với trình độ tiến hoá cao hơn và sự phân hoá vô cùng phong phú đa dạng của nhóm eukaryote, sự điều hòa biểu hiện gen ở các eukaryote phức tạp hơn rất nhiều so với các prokaryote; thậm chí ngay trong nhóm eukaryote các phương thức và chiến lược điều hoà cũng rất phong phú

và đa dạng

Cần lưu ý rằng, những ước tính gần đây cho thấy một tế bào người chứa khoảng 25.000 gen

mã hoá protein, trong đó: (i) Một số gen được biểu hiện trong tất cả các tế bào vào mọi lúc Các gen

này được gọi là gen nội trợ (housekeeping genes), chúng chịu trách nhiệm cho các chức năng

chuyển hoá thông thường phổ biến cho mọi tế bào (ví dụ, hô hấp); (ii) Một số được biểu hiện khi tế bào đi vào một con đường biệt hoá cụ thể; (iii) Một số được biểu hiện mọi lúc chỉ trong các tế bào

đã được biệt hoá theo một cách thức cụ thể; (iv) Một số chỉ được biểu hiện khi các điều kiện bên ngoài và trong tế bào thay đổi, ví dụ khi có một hormon đi đến có thể kích hoạt hoặc kìm hãm các gen nào đó trong tế bào

Vậy các gen ở eukaryote được điều hoà bằng cách nào? Có nhiều cách điều hoà được sử dụng

bởi các tế bào eukaryote, như: thay đổi tỷ lệ phiên mã của các gen Đây là chiến lược quan trọng

nhất và được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, các eukaryote còn có nhiều cách thức điều hoà phiên mã

khác, ví dụ: (i) Biến đổi tỷ lệ mà trong đó các bản sao ARN được xử lý ở trong nhân (xem sửa đổi ARN); (ii) Thay đổi độ ổn định của các phân tử mARN, nghĩa là tỷ lệ mà chúng bị suy thoái (ví dụ, nhiễu ARN); (iii) Biến đổi hiệu suất dịch mã của các ribosome

Đối với các gen phân đoạn của tế bào eukaryote, các đoạn không mã hoá protein sẽ được loại

bỏ khỏi mARN trước khi nó đi ra tế bào chất để làm khuôn cho dịch mã; cũng như các quá trình bổ sung chóp (cap) và đuôi poly(A) ở các đầu 5' và 3' của hầu hết các bản sao mARN sơ cấp

Những vấn đề quan trọng khác: vị trí khởi đầu phiên mã, promoter, yếu tố tăng cường (enhancer) và yếu tố gây bất hoạt (silencer) phiên mã Các gen nằm kề nhau (adjacent genes), kể cả các gen mã hoá các ARN và gen mã hoá protein, thường phân cách nhau bằng yếu tố cách ly

(insulator) Nhờ vậy chúng tránh được việc lấn sân và nhầm lẫn các promoter và enhancer hoặc silencer của nhau

3.2 Vùng khởi động (Promoter)

Trong nhân các tế bào eukaryote có ba kiểu vùng khởi động khác nhau được nhận biết bởi ba loại ARN polymerase khác nhau Sự thật là các polymerase I và II cùng nhận biết một loại promoter, còn polymerase III sử dụng hai lớp promoter hoàn toàn khác nhau

Hầu hết các promoter của eukaryote được nhận biết bởi ARN polymerase II đều có ít nhất một đặc điểm chung, đó là: một trình tự điều hoà nằm trước vị trí bắt đầu phiên mã ~30 cặp bazơ và

103

Hơn nữa, tự thân các ARN polymerase này không thể bám vào các promoter tương ứng của

chúng mà đòi hỏi phải có các nhân tố phiên mã (transcription factors) là những protein điều hoà tổng hợp mARN eukaryote Có hai lớp nhân tố như vậy: các nhân tố phiên mã chung (general transcription factors) và các nhân tố phiên mã đặc thù-gen (gene-specific transcription factors)

(a)

LCR

TE P

P TE

vïng ®iÒu hoµ locus (locus control region)

Hình 6.12 (a) Các yếu tố phiên mã (TE) và promoter đối với ARN polymerase II có thể định khu

theo nhiều kiểu khác nhau Ở đây chỉ cho thấy kiểu TE nằm xa gen về phía trước; các gen được biểu hiện phối hợp cùng nhau thì có thể chịu sự điều hoà của một yếu tố kiểm soát chung, gọi là

“vùng điều hoà locus” (LCR) cũng như các yếu tố đặc thù-gen (b) Các protein bám enhancer - ngoài vị trí bám ADN của chúng, còn có các vị trí bám vào các nhân tố phiên mã tụ họp ở promoter của gen nhờ đó có thể kích thích tăng tỷ lệ phiên mã

3.3 Các nhân tố phiên mã

3.3.1 Enhancer và Silencer

Các nhân tố phiên mã đặc thù-gen còn gọi là các yếu tố phiên mã (transcription elements =

TE) là các trình tự ADN điều hoà gen Các TE xác định hiệu suất phiên mã Chúng có thể phân bố

trước gen, sau gen hoặc bên trong gen (tại các intron chẳng hạn) và bao gồm các enhancer, silencer, các yếu tố đáp ứng (response element) và các yếu tố cách ly Nói chung các gen có thể có vố số yếu

tố phiên mã (Hình 6.12 và 6.13)

Các enhancer là các yếu tố trình tự ADN đặc thù có thể kích thích gia tăng tỷ lệ phiên mã

Khác với các promoter ở chỗ, chúng có thể hoạt động ở một khoảng cách xa cả ngàn cặp bazơ so với các gen mà chúng kiểm soát Nguyên do là ở chỗ: các protein bám enhancer - ngoài vị trí bám ADN của chúng, còn có các vị trí bám vào các nhân tố phiên mã (TF) tụ họp ở promoter của gen (Hình 6.13)

Các silencer cũng là các yếu tố ADN đặc thù có thể định khu và hoạt động ở tầm như các

enhancer Tuy nhiên, khi các nhân tố phiên mã bám vào chúng thì sự biểu hiện của gen do chúng kiểm soát bị kìm hãm

Các yếu tố đáp ứng là các trình tự đích cho các phân tử tín hiệu

Các yếu tố cách ly là những đoạn ADN (~42 cặp bazơ) định khu giữa các enhancer và

promoter hoặc giữa các silencer và promoter của các gen nằm sát nhau hoặc các cụm gen kề nhau Chức năng của chúng là ngăn cản một gen khỏi bị ảnh hưởng bởi sự hoạt hoá (hoặc ức chế) của các gen lân cận Ví dụ: enhancer cho promoter của gen xác định chuỗi delta của thể nhận gamma/delta

tế bào-T cho kháng nguyên (TCR) định khu gần promoter đối với chuỗi alpha của alpha/beta TCR (trên nhiễm sắc thể số 14 ở người) Một tế bào T phải chọn lựa giữa cái này hoặc cái kia Có một yếu tố cách ly giữa promoter của gen alpha và promoter của gen delta nhằm đảm bảo sự hoạt hoá của một gen không lan rộng sang gen khác

3.3.2 Các nhân tố phiên mã của ARN polymerase II

Promoter cơ bản có chứa trình tự gồm 7 bazơ (TATAAAA) gọi là hộp TATA Nó được bám

bởi một phức hợp lớn có chừng 50 protein khác nhau, bao gồm: (i) Nhân tố phiên mã IID (transcription factor IID = TFIID) là một phức hợp của protein bám TATA (TATA-binding protein

= TBP) với chức năng nhận biết và bám vào hộp TATA cùng với 14 nhân tố protein khác bám vào

TBP và bám vào nhau chứ không bám vào ADN (ii) Nhân tố phiên mã TFIIB bám cả ADN và

polymerase II

Nhìn chung, kiểu promoter cơ bản này thấy có trong tất cả các gen mã hoá protein; nhiều gen khác nhau và nhiều kiểu tế bào khác nhau cùng chia xẻ chung các nhân tố phiên mã; Pol II (một phức hợp của 12 protein khác nhau) bám vào promoter thông qua các nhân tố thuộc TFII ARN polymerase II được hỗ trợ bởi ít nhất 6 nhân tố phiên mã chung (TFIIA, B, D, E, F và H), cũng như bởi các nhân tố phiên mã đặc thù-gen mà hầu hết chúng bám vào các enhancer gắn với các gen nào

đó TFIID có chứa protein bám hộp TATA (TBP); protein này bám hộp TATA của promoter và làm trung tâm tổ chức cho việc hình thành phức hợp tiền khởi đầu

Hình 6.13 Bám vào promoter của các nhân tố phiên mã, ARN polymerase II, các TF chuyên hoá,

và hình thành phức hợp tiền khởi đầu

3.4 Sửa đổi ARN

Như đã đề cập, tất cả các ARN eukaryote đều phải trải qua quá trình sửa đổi sau phiên mã ở trong nhân (RNA processing) để tạo ra các ARN trưởng thành Sau đó các phân tử mARN đi ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã Hai sự kiện sửa đổi chính yếu, đó là:

– Gắn thêm chóp m7Gppp và đuôi poly(A); và

– Loại bỏ các intron và nối các exon hay còn gọi là splicing

3.4.1 Gắn thêm chóp m 7 Gppp và đuôi poly(A)

105

“đuôi” poly(A) ở đầu 3' của nó Đối với các gen mã hóa protein không thuộc kiểu phân đoạn như các gen histone chẳng hạn, quá trình hoàn thiện mARN dừng tại đây Nói chung, tất cả các mARN trưởng thành của eukaryote đều có chóp 5' (5'cap) và hầu hết các mARN đều chứa đuôi poly(A), ngoại trừ các mARN histone Chóp 5' và đuôi poly(A) có tác dụng bảo vệ mARN khỏi bị phân cắt bởi các enzyme ribonuclease (RNase) trong tế bào chất

Sự hình thành chóp 5': Quá trình này đòi hỏi nhiều bước, bước thứ nhất xảy ra ngay sau khi

khởi đầu phiên mã Nucleotide khởi đầu có một đầu 5'-triphosphate được thuỷ giải thành một đầu

monophosphate và pyrophosphate vô cơ (PPi) Sau đó enzyme guanylyltransferase chuyển một gốc G

cho đầu monophosphate bằng cách sử dụng GTP như là một cơ chất, làm giải phóng Pi Liên kết được

hình thành là một liên kết 5'-5' triphosphate Tiếp đó enzyme methyltransferase gắn nhóm methyl

(-CH3) vào vị trí 7 của guanosine ở đầu mút 5', tạo thành methyl-7-guanosine triphosphate (m7Gppp)

Sau đó, xảy ra sự methyl hoá ở hai nucleotide tại các vị trí 2' ribose Chóp 5' có chức năng bảo vệ đầu

5' của mARN (gia tăng tính ổn định mARN) và cần thiết cho khởi đầu tổng hợp protein

Sự hình thành đuôi poly(A): Ở đầu 3' của hầu hết các gen mã hóa protein eukaryote có chứa

trình tự AATAAA là tín hiệu cho việc gắn “đuôi” poly(A) vào đầu 3' của mARN Sự phiên mã

thường vẫn còn tiếp diễn sau khi đi qua vị trí polyadenyl hoá này Trình tự AAUAAA ở đầu 3' của mARN báo hiệu cho endonuclease nhận biết và cắt chuỗi ARN tại một điểm nằm sau nó ~10-30 bazơ Sau đó, enzyme poly(A)-polymerase sẽ lắp thêm vào đầu 3' của mARN một dãy adenine dài

khoảng 150-200 bazơ gọi là đuôi poly(A) Đuôi này có chức năng bảo vệ mARN khỏi bị suy thoái và trong nhiều trường hợp nó còn kích thích sự dịch mã

Hình 6.14 Các bước tổng quát của quá trình phiên mã và sửa đổi sau phiên mã đối với bản sao

pre-mARN của các gen phân đoạn: (1) Lắp chóp 5’-m7Gppp cùng lúc phiên mã; (2) Gắn đuôi poly(A); và (3) Splicing

3.4.2 Sự cắt-nối pre-mARN của các gen phân đọan

Việc lý giải cơ chế cắt-nối (splicing) trong quá trình xử lý bản sao pre-mARN dựa chủ yếu

trên hai sự kiện:

(2) Ở một số snARN chứa trong thành phần của enzyme splicing cũng có các trình tự

dinucleotide bổ sung với các trình tự chuẩn trong intron Các snARN (U1-U6) trong phức hợp

enzyme này, snRNP (small nuclear ribonucleoprotein), tương tác với các đầu mút của mỗi intron,

kéo chúng xích lại gần nhau tạo ra cấu trúc hình vòng, nhờ đó enzyme tiến hành cắt bỏ intron và nối các exon lại với nhau Ví dụ, gen ovalbumin gồm 7 intron xen kẽ giữa 8 exon có độ dài 7.700 cặp bazơ sau khi enzyme splicing cắt bỏ các intron và nối tất cả các exon thì mARN trưởng thành có trình tự mã hóa protein dài 1.872 bazơ

3.4.3 Cắt nối chọn lọc tạo ra các mARN khác nhau từ một gen

Một trong những trường hợp thú vị là việc cắt nối sau phiên mã theo các cách khác nhau (có tính chất biệt hoá và chọn lọc) dẫn tới tạo ra các mARN khác nhau (Hình 6.16 và 6.17) Ví dụ điển hình là gen phân đoạn mã hóa calcitonin và sản phẩm pre-mARN của nó (xem Hình 6.16)

107

Hình 6.16 Cùng một bản sao pre-mARN được tạo ra từ sự phiên mã gen calcitonin, qua quá trình

sửa đổi theo kiểu cắt nối chọn lọc đặc thù tạo ra hai mARN trưởng thành khác nhau: mARN của calcitonin được sinh ra chủ yếu bởi tuyến giáp và mARN cho sản phẩm họ hàng với calcitonin sinh ra chủ yếu ở tuyến dưới đồi thị

Quá trình xử lý ARN này xảy ra theo những con đường đặc thù, tuỳ theo tuyến giáp hay tuyến dưới đồi thị Kết quả là tạo ra hai mARN trưởng thành giống nhau ở đầu 5' và khác nhau ở đầu 3'

Cụ thể, con đường cắt-nối ở tuyến giáp dẫn tới hình thành mARN mà ở đầu 3' là trình tự mã hoá calcitonin, còn con đường đặc trưng cho tuyến dưới đồi thị dẫn đến hình thành mARN mà ở phía đầu 3' là trình tự mã hoá sản phẩm có liên quan họ hàng với calcitonin nhưng lượng calcitonin được tạo ra ở đây rất ít, và thay vào đó là protein có quan hệ họ hàng với calcitonin mà chức năng của nó còn chưa rõ

3.4.4 Vai trò của các intron

Vấn đề đặt ra là sự có mặt cuả các intron trong các gen phân đoạn như thế có ý nghĩa gì? Bởi

vì trong quá trình cắt nối pre-mARN có thể xảy ra dù là một sai sót nhỏ cũng đủ để tạo ra mARN có khung đọc mã bị thay đổi Được biết khoảng 90% bản sao mARN bị suy thoái và chỉ để lại ~10% mARN trưởng thành đi ra tế bào chất Theo hiểu biết hiện nay, các intron có thể có các vai trò sau: (i) các intron là các đoạn đệm tạo thuận lợi cho sự tái tổ hợp (giữa các exon) bên trong một gen;

(ii) các intron là các vùng đệm phân cách các vùng chức năng của gen (tức các exon) và của một số protein;

(iii) các intron là nơi phân bố một số yếu tố phiên mã (TE);

(iv) các intron là các vùng phân cách các exon cho phép quá trình cắt-nối chọn lọc

(alternative splicing) để tạo ra các mARN trưởng thành khác nhau và dịch mã thành các polypeptide khác nhau từ một gen Con đường sử dụng exon có chọn lọc này mang tính đặc thù cho từng loại gen của các tế bào thuộc các mô nhất định ở các eukaryote bậc cao

Hình 6.17 Các kiểu sử dụng exon trong cắt nối chọn lọc có thể sinh ra nhiều protein khác nhau từ

một gen

TÓM TẮT

(1) Các gen của mỗi bộ gen không tồn tại riêng rẽ và hoạt động như những thực thể độc lập

mà trái lại, giữa chúng có sự kiểm soát lẫn nhau cũng như phụ thuộc vào các yếu tố của môi trường Mỗi bộ gen của tế bào là một hệ thống mở có khả năng tự điều chỉnh, đảm bảo sự hoạt động của các gen diễn ra hợp lý trước điều kiện cụ thể của môi trường trong từng giai đoạn của quá trình phát triển cá thể

(2) Sự điều hoà hoạt động của các gen biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau như phiên mã, sau phiên mã, dịch mã và sau dịch mã và theo các phương thức và cơ chế đặc thù cho từng nhóm loài Đặc điểm chung nhất cho hoạt động của các gen trong các bộ gen khác nhau thể hiện chủ yếu ở sự điều hòa phiên mã, trong đó xảy ra sự tương tác giữa vùng khởi động (promoter) với ARN polymerase và với nhiều yếu tố khác

(3) Ở sinh vật nhân sơ, sự điều hoà hoạt động của các gen có liên quan đến các quá trình chuyển hóa của tế bào Các gen cấu trúc liên quan về chức năng được tổ chức và kiểm soát hoạt động chặt chẽ theo cụm gọi là operon Các yếu tố điều hòa một operon gồm có vùng vận hành, vùng khởi động và gen ức chế Mỗi tế bào vi khuẩn có các operon cảm ứng và operon ức chế với phương thức điều hòa chung là điều hòa âm tính, ngoài ra còn có các kiểu điều hòa dương tính, phiên mã dở tùy loại operon

109

hiện ở sự biến đổi cấu hình chất nhiễm sắc trước khi các gen có thể phiên mã Có nhiều yếu tố ADN

và protein tham gia điều hòa ở mức phiên mã Sự điều hòa sau phiên mã diễn ra trong nhân theo nhiều cơ chế khác nhau, như: gắn thêm chóp m7Gppp, lắp thêm đuôi poly(A), cắt nối có chọn lọc các exon để tạo ra nhiều kiểu ARN trưởng thành khác nhau từ một gen ở các mô khác nhau của sinh vật bậc cao

CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP

101. Thông thường, thứ tự sắp xếp từ trái sang phải của các yếu tố trong một operon là: _(a) _, _(b) _, _(c) _ và _(d) _

102. Theo định nghĩa chặt chẽ, một operon bao gồm một nhóm các _(a) _ có liên quan với nhau về mặt _(b) _ được liên kết chặt chẽ với một yếu tố _(b) _ nằm kề sát trước chúng

103. Đoạn trình tự đặc thù 5’-AAUAAA-3’ nằm đằng sau của hầu hết các pre-mARN sinh vật nhân chuẩn đóng vai trò là tín hiệu điều hòa

A kết thúc phiên mã B cắt và gắn đuôi polyA

C kéo dài phiên mã D tốc độ phiên mã

104. Quá trình xử lý các bản sao ARN sơ cấp ở tế bào nhân chuẩn được xem là sự điều hoà biểu hiện gen ở mức

A phiên mã B sau phiên mã

C dịch mã D sau dịch mã

105. Loại ARN nào sau đây có mặt trong thành phần của enzyme cắt-nối (splicing) đối với sản phẩm phiên mã sơ cấp của các gen phân đoạn?

A rARN B mARN C snARN D tARN

106. Khi môi trưòng nuôi cấy E.coli không có đường lactose thì operon Lac không hoạt động,

chủ yếu bởi vì:

A chất ức chế bám chặt vùng vận hành

B ARN polymerase bị các phân tử hiệu ứng ngăn cản từ xa

C Operator hoặc promoter bị mất chức năng tín hiệu

109. Nếu trong môi trường nuôi cấy E coli được bổ sung cả hai loại đường lacto và gluco thì vi

khuẩn sẽ sử dụng chất nào trước? Tại sao? Khi glucose đã được sử dụng hết thì việc ức chế dị hóa còn tiếp tục diễn ra nữa hay không, tại sao?

110. Xét 3 nòi vi khuẩn có kiểu gen của operon Lac như sau (dấu + biểu thị cho locus bình

thường tức kiểu dại, và dấu “–” chỉ locus bị đột biến) Hãy giải thích và cho biết kiểu hình của

mỗi nòi vi khuẩn sau: (1) R+ P+ O+ Z– Y+ A+; (2) R+ P+ O+ Z+ Y– A+; (3) R+ P+ O+ Z+ Y+ A+

111. Một nòi vi khuẩn có kiểu gen operon Lac như sau: R+ P+ O– Z+ Y+ A+ Hãy giải thích và xác định kiểu hình của vi khuẩn

112. Một nòi E coli có kiểu gen operon Lac là R+ P– O+ Z+ Y+ A+ Hãy giải thích và xác định kiểu hình của vi khuẩn

113. Một vi khuẩn có kiểu gen operon Lac là: R– P+ O+ Z+ Y+ A+ Hãy giải thích và xác định kiểu hình của vi khuẩn

114. Phân biệt các cặp khái niệm sau: (a) chất cảm ứng với chất ức chế; (b) điều hoà âm tính với điều hoà dương tính; (c) điều hoà theo kiểu cảm ứng - âm tính với ức chế - âm tính Hãy vẽ sơ

đồ một operon và giải thích mối quan hệ giữa các yếu tố điều hoà hoạt động của một operon

115. Hãy giải thích các tình trạng đóng-mở của lac operon dưới các điều kiện sau đây và cho các

hình vẽ minh hoạ: (a) chỉ có glucose; (b) chỉ có lactose; (d) có cả glucose và lactose; và (c) không có đường nào cả

116. Sự điều hòa dịch mã ở vi khuẩn xảy ra như thế nào? Nêu ý nghĩa của kiểu điều hòa ấy

117. Phân tích cơ chế sửa đổi sau phiên mã đối với sản phẩm của các gen phân đoạn và vẽ một sơ

đồ minh họa

118. Phân tích một ví dụ về sửa đổi sau phiên mã theo kiểu cắt nối chọn lọc đối với sản phẩm của

gen phân đoạn Vẽ một sơ đồ minh họa

119. Trình bày vai trò và ý nghĩa của các intron trong các gen phân đoạn

120. Trình bày sơ lược các yếu tố điều hòa biểu hiện gen ở mức phiên mã đối với các gen eukaryote

111

Chương 7 CÁC BIẾN ĐỔI CỦA BỘ GEN

Một trong những đặc tính căn bản của vật chất di truyền là khả năng bị biến đổi, tạo ra những vật liệu mới Ở mức độ phân tử đó là sự phát sinh các đột biến gen tự phát diễn ra trong quá trình tái bản của bộ gen cũng như do tác động của các yếu tố môi trường như hóa chất, các tia phóng xạ…;

sự phát sinh các biến dị tổ hợp và các yếu tố di truyền vận động Bằng cách đó các nguồn biến dị di truyền sơ cấp và thứ cấp được tạo ra và cung cấp cho quá trình chọn lọc và tiến hóa của sinh giới Bên cạnh đó bộ gen các tế bào cũng có các hệ thống sửa chữa nhằm hạn chế phát sinh đột biến cũng như các tổn thương trong ADN

Trong chương này, chúng ta sẽ tìm hiểu và giải đáp các vấn đề sau: (i) Đột biến gen là gì, có các loại cơ bản nào? Vai trò và ý nghĩa của chúng trong tiến hóa và chọn giống? (ii) Đột biến gen xảy ra do những tác nhân, nguyên nhân và cơ chế nào? (iii) Các tế bào có thể hạn chế sự phát sinh các đột biến gen tự phát như thế nào? Các tổn thương trong ADN được sửa chữa ra sao? (iv) Sự tái

tổ hợp của ADN diễn ra như thế nào? (v) Bản chất của các yếu tố di truyền vận động là gì? Các đoạn xen và gen nhảy khác nhau ở những điểm nào?

1 Đột biến gen

1.1 Đại cương về đột biến gen

Định nghĩa: Đột biến gen (gene mutation) là những biến đổi xảy ra bên trong cấu trúc của

một gen hoặc một vùng nhỏ của bộ gen, liên quan chủ yếu tới sự thay đổi trình tự nucleotide vốn có

của nó (kiểu dại), làm phát sinh các alen (allele) mới

Nguyên nhân: Các đột biến gen xảy ra có thể do sai sót trong quá trình tái bản, hoặc do

trong bộ gen có các vùng dễ phát sinh đột biến gọi là các ''điểm nóng'' (hot spots), hoặc các tổn thương tự phát dưới ảnh hưởng của các tác nhân lý-hoá từ môi trường ngoài

Phân loại: Các đột biến gen có thể được phân loại theo các cách khác nhau Chẳng hạn, dựa

vào các hiệu quả của chúng lên kiểu hình (các đột biến hình thái, đột biến gây chết, các đột biến soma và dòng mầm) hoặc lên chính bản thân vật chất di truyền ADN Căn cứ vào nguồn gốc, chúng

được chia thành các đột biến tự phát và đột biến cảm ứng

Hậu quả: Các đột biến gen nói chung làm suy yếu hoặc biến đổi chức năng của gen hơn là

tăng cường chức năng của nó Từ đó ảnh hưởng lên các đặc tính sinh lý-hoá sinh của tế bào cũng như sức sống và sinh sản của cơ thể sinh vật nói chung

Vai trò và ý nghĩa: Đột biến gen vì vậy được xem là cơ sở của hiện tượng đa hình di truyền

trong các quần thể và là nguồn biến dị di truyền sơ cấp vô cùng phong phú và đa dạng cho các quá trình chọn lọc và tiến hoá Người ta lợi dụng đặc tính biến đổi nầy của các sinh vật để xây dựng các phương pháp gây đột biến khác nhau và có thể kết hợp với lai hữu tính hoặc sử dụng kỹ thuật di truyền để cải biến bộ gen của các vật nuôi, cây trồng về các tính trạng cần quan tâm

Tỷ lệ đột biến gen (ở người): Nếu như đột biến bộ gen (genome mutation) và đột biến nhiễm sắc thể xảy ra với tần số trung bình tương ứng là 10-2 và 6×10-4 mỗi lần phân bào, thì với đột biến gen tỷ lệ là 10-10 cho mỗi cặp bazơ trong mỗi lần phân bào hoặc có thể biến thiên từ 10-4 đến 10-7(tính bằng số đột biến / locus / thế hệ) tuỳ thuộc vào kích thước gen và bản chất của nó Tỷ lệ này ở