Như chỳng ta đó biết, kể từ khi sinh học phõn tử ra đời và phỏt triển cho đến nay cú hàng loạt kỹ thuật và phương phỏp nghiờn cứu khỏc nhau được phỏt minh ra nhằm đỏp ứng cỏc nghiờn cứu trong cỏc lĩnh vực khỏc nhau của khoa học, cụng nghệ, sản xuõt và đời sống xó hội. Cú đến hàng trăm cuốn sỏch dày mụ tả cỏc kỹ thuật, cỏc phương phỏp và quy trỡnh cụng nghệ liờn quan đến sinh học phõn tử, kỹ thuật di truyền và cụng nghệ gen, cụng nghệ protein, cụng nghệ enzyme...
Cú thể kể ra đõy một số phương phỏp như vậy để chỳng ta thấy rằng, chỳng là vụ số, mà một số trong chỳng đó được đề cập sơ lược và rải rỏc trong giỏo trỡnh. Đú là cỏc phương phỏp hiển vi điện tử (dựng trong nghiờn cứu cấu trỳc cỏc phõn tử); đỏnh dấu đồng vị phúng xạ (S35
, P32, N15, triti v.v.); cỏc phương phỏp sắc ký (trong phõn tớch thành phần húa học của protein, ADN và ARN), sắc ký lỏng, sắc ký ỏi lực, sắc ký lọc gel hay sắc ký trao đổi ion; phương phỏp nhiễu xạ Rơngen (do L. Pauling phỏt minh năm 1949, dựng trong nghiờn cứu cấu trỳc phõn tử protein và sau này là ADN); ly tõm siờu tốc; điện di gel (protein và ADN); phúng xạ tự ghi; phương phỏp giải mó di truyền in
vitro do M. Nirenberg và H. Khorana đề xuất (1961); cỏc phương phỏp xỏc định trỡnh tự nucleotide
(bằng con đườn húa học của Maxam Gilbert, bằng enzyme của F. Sanger, xỏc định trỡnh tự ADN tự động); sử dụng cỏc mẩu dũ đỏnh dấu; cỏc phương phỏp lai phõn tử axit nucleic; phương phỏp Southern blots (dự trong trong lập bản đồ giới hạn chẳng hạn), Northern blots…; cỏc phương phỏp kiến tạo cỏc ADN tỏi tổ hợp trong ống nghiệm; cỏc phương phỏp tạo dũng cADN; cỏc phương phỏp biến nạp ADN tỏi tổ hợp; cỏc phương phỏp biểu hiện cỏc gen được tạo dũng; vi tiờm; gõy đột biến
phỏp PCR do K. Mullis đề xuất (1985) cựng hàng loạt cỏc phương phỏp cải biờn của nú về sau này; cỏc phương phỏp RFLP, AFLP…; chip ADN và phõn tớch vi mảng ADN; phương phỏp FISH; phõn tớch chuỗi của sự biểu hiện gen (SAGE); … Hàng loạt cỏc phương phỏp toỏn học xỏc suất và thống kờ hiện đại ra đời đó được đưa vào ứng dụng từ rất sớm. Đặc biệt, cựng với sự phỏt triển của mỏy tớnh và cụng nghệ thụng tin đó hỡnh thành nờn một lĩnh vực ứng dụng vụ cựng mới mẻ và rộng lớn, với hiệu quả và giỏ trị vụ song trong Sinh học phõn tử và kỹ thuật di truyền ngày nay, đú là Tin-Sinh
học (Bioinformatics).
Dưới đõy chỉ lược trỡnh vài phương phỏp đại diện, cú tớnh thụng dụng.
1.1. Lai phõn tử axit nucleic và sử dụng cỏc mẩu dũ
Người ta lợi dụng khả năng núi trờn của ADN để tạo ra cỏc phõn tử ADN lai bằng cỏch làm lạnh từ từ hỗn hợp cỏc ADN biến tớnh từ hai loài khỏc nhau. Kỹ thuật lai phõn tử (Hỡnh 8.1) này đó được ứng dụng rộng rói để xỏc định mức độ tương đồng ADN của cỏc nhúm phõn loại khỏc nhau. Trờn nguyờn tắc, nếu mức độ tương đồng càng lớn thỡ số lượng cỏc đoạn lai càng lớn và ngược lại. Vớ dụ, cỏc thực nghiệm cho thấy cú khoảng 25% tổng số ADN người và chuột cú thể lai với nhau. Thụng thường, mức độ lai được xỏc định bằng cỏc phương phỏp sắc ký hoặc ly tõm, trong đú một loại ADN được đỏnh dấu bằng đồng vị phúng xạ. Hiện giờ cỏc kỹ thuật này được ỏp dụng khỏ rộng rói trong cỏc nghiờn cứu sinh học phõn tử cũng như trong cỏc lĩnh vực điều tra hỡnh sự hoặc phỏt hiện sớm một số bệnh phõn tử để điều trị kịp thời.
Hỡnh 8.1. Biến tớnh và hồi tớnh của ADN (trỏi) và lai axit nucleic.
Túm lại, theo nghĩa rộng, lai phõn tử được hiểu là sự tương tỏc bổ sung giữa cỏc mạch đơn axit nucleic. Nú cú thể xảy ra giữa hai mạch ADN, giữa cỏc mạch ADN và ARN, hoặc giữa hai mạch ARN, và đú chớnh là cơ sở của nhiều kỹ thuật, như: lai một
mẩu dũ cú đỏnh dấu đồng vị
phúng xạ (radioactive probe) để lọc ra ADN hay ARN bỏm vào màng lai - là một trong
những thớ nghiệm quan trọng Hỡnh 8.2 Sử dụng mẫu dũ ADN để tỡm đoạn đớch.
trong sinh học phõn tử. Hai kiểu cơ bản của lai phõn tử là phương phỏp lai Southern (Southern blots) và lai Northern (Northern blots).
Trong đú, kiểu đầu lai bằng một mẩu dũ để phỏt hiện, định lượng một phõn tử ADN xỏc định; cũn kiểu sau dựng để phỏt hiện, định lượng một phõn tử ARN. Mẩu dũ (probe) là cụng cụ sơ cấp
được dựng để xỏc định cỏc trỡnh tự bổ sung mà ta quan tõm, cũn gọi là trỡnh tựđớch. Theo đú thỡ một axit nucleic mạch đơn cú đỏnh dấu phúng xạ được dựng để xỏc định một trỡnh tự axit nucleic bổ sung bỏm trờn màng lọc nitrocellulose hay màng lai bằng nylon (Hỡnh 8.2).
1.2. Phương phỏp PCR
Những tiến bộ của cụng nghệ sinh học ngày nay cú thể cho một ADN của vi sinh vật “sinh trưởng” thậm chớ ngay cả khi sinh vật đú khú nuụi cấy. Nhờ đú cú đủ cỏc mẩu ADN cho việc xỏc định hầu như bất kỳ vi sinh vật nào cú thể thu được từ một mẩu tiờu bản thậm chớ khụng phải qua nuụi cấy sinh vật đú. Đú chớnh là nhờ sự phỏt triển của phương phỏp PCR (Polymerase Chain Reaction).
PCR là một kỹ thuật cho phộp khuyếch đại nhanh một mẩu ADN cụ thể trong ống nghiệm (hơn là trong cỏc tế bào sống như là E. coli). Với quy trỡnh này người ta cú thể tạo ra vụ số bản sao của một phõn tử ADN đơn. Quy trỡnh “tạo dũng in vitro” này được túm tắt như sau (Hỡnh 8.3):
•Để thực hiện một PCR, cần phải biết ớt nhất một đoạn trỡnh tự của phõn tử ADN cần quan tõm (vớ dụ một mẩu mỏu).
•Sau đú phải tổng hợp cỏc đoạn mồi (primer), tức cỏc oligonucleotide ngắn (chứa khoảng 20
nucleotide) mà nú bổ sung chớnh xỏc với trỡnh tự ở đầu 3' của mỗi một sợi của ADN cần khuyếch đại.
•Mẩu ADN được đun núng để tỏch cỏc sợi đơn (biến tớnh) và trộn lẫn với cỏc đoạn mồi. •Nếu như cỏc đoạn mồi tỡm thấy cỏc trỡnh tự bổ sung trong ADN, chỳng sẽ kết hợp vào cỏc sợi đú.
•Sự tổng hợp bắt đầu (bao giờ cũng theo chiều 5' → 3') bằng cỏch sử dụng sợi gốc làm khuụn.
•Hỗn hợp phản ứng phải chứa tất cả bốn loại deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và một ADN polymerase chịu nhiệt (vớ dụ, Taq polymerase được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus - sống ở suối nước núng - vẫn giữ được hoạt tớnh trong khi gõy biến tớnh ở nhiệt độ cao).
•Sự trựng hợp tiếp diễn chừng nào mỗi sợi đơn được tổng hợp mới cũn chứa đủ vị trớ được nhận biết bởi đoạn mồi khỏc.
•Lỳc này ta cú hai phõn tử ADN giống hệt phõn tử ban đầu.
•Bõy giờ ta lấy hai phõn tử này cho biến tớnh và lặp lại quỏ trỡnh đú. •Sau mỗi chu kỳ số phõn tử ADN lại tăng gấp đụi.
Hỡnh 8.3. Sơ đồ minh họa quy trỡnh kỹ thuật PCR do Kary Mullis đề xuất.
Rừ ràng, phản ứng PCR tỏi bản ADN theo một cỏch thức tương tự với sự tỏi bản xảy ra trong tế bào, ở chỗ:
(1) ADN sợi kộp được tỏch thành cỏc sợi đơn. Tuy nhiờn, trong PCR, thỡ nhiệt chứ khụng phải enzyme được dựng để làm biến tớnh ADN.
(2) Cỏc mẩu nucleotide ngắn được dựng làm mồi để khởi đầu tỏi bản. Cỏc đoạn mồi của PCR được tổng hợp từ cỏc deoxynucleotide. Chỳng bổ sung với cỏc trỡnh tự ở hai đầu của gen quan tõm. Một đoạn mồi kết dớnh vào đầu 3' của mỗi một sợi ADN bổ sung.
(3) ADN polymerase tiếp tục kộo dài sợi ADN mới từ đầu 3'-OH của cỏc đoạn mồi. Sản phẩm của sự tỏi bản bỏn bảo toàn này là hai sợi con.
Ưu thế của PCR là ở chỗ, cứ sau mỗi vũng hay chu kỳ tỏi bản thỡ thế hệ ADN sợi kộp con lại
bị biến tớnh, nếu tiếp tục bổ sung cỏc đoạn mồi thỡ quỏ trỡnh này lại tiếp diễn. Nhờ sử dụng cỏc thiết bị tự động, mỗi chu kỳ tỏi bản cú thể hoàn thành chưa đầy 5 phỳt. Bằng cỏch đú, từ một mẩu ADN đơn cú thể khuyếch đại lờn 1.000 lần sau 10 chu kỳ (210
= 1.024 ≈ 103). Và sau 30 chu kỳ, từ một phõn tử ADN ban đầu được khuyếch đại lờn hơn một tỷ bản sao (230
= 1,02 x 109).
Ứng dụng của PCR: Trờn thực tế, PCR được dựng để tạo cỏc mẩu dũ (probe) nucleic acid cho
việc xỏc định cỏc vi sinh vật. Chẳng hạn, nú cú thể phỏt hiện số lượng nhỏ cỏc tỏc nhõn gõy bệnh trong cỏc mẩu lõm sàng và qua đú chẩn đoỏn cỏc bệnh gõy ra bởi cỏc tỏc nhõn khú nuụi cấy, như
virus HIV/AIDS, Mycobacterium tuberculosis sinh trưởng chậm v.v. PCR cũng đó được dựng để
Vựng DNA quan tõm 1. DNA bị biến tớnh. Cỏc đoạn mồi đớnh vào mỗi sợi. Một sợi DNA mới được tổng hợp trờn mỗi sợi khuụn nhờ DNA polymerase. 2. Vũng khỏc: DNA bị biến tớnh, cỏc đoạn mồi đớnh vào, và số sợi DNA được tăng gấp đụi. cỏc mồi (primer) được tổng hợp bằng hoỏ học 3. Vũng khỏc: DNA bị biến tớnh, cỏc đoạn mồi đớnh vào, và số sợi DNA được tăng gấp đụi. 4. Vũng khỏc: DNA bị biến tớnh, cỏc đoạn mồi đớnh vào, và số sợi DNA được tăng gấp đụi.