2. Cỏc cụng cụ và phương phỏp tạo dũng ADN tỏi tổ hợp
2.2.Cỏc vector thụng dụng trong kỹ thuật di truyền
ADN tỏi tổ hợp (recombinant ADN) là phõn tử ADN được tạo ra trong ống nghiệm bằng cỏch
kết hợp cỏc ADN từ cỏc nguồn khỏc nhau, theo một quy trỡnh kỹ thuật nhất định (gọi là kỹ thuật tỏi tổ hợp ADN).
Thụng thường một phõn tử ADN tỏi tổ hợp bao gồm một phõn tử ADN cú bản chất là plasmid hoặc phage nguyờn vẹn gọi là vector (Hỡnh 8.7) và một đoạn ADN từ nguồn khỏc mang một gen hoặc yếu tố điều hũa mong muốn được cho xen vào gọi là ADN ngoại lai (foreign ADN).
Hỡnh 8.7A. Cấu trỳc của cỏc plasmid pBR322 và pUC19. Lưu ý cỏc vựng chứa khởi điểm tỏi
bản (Ori), cỏc gen khỏng thuốc (ampicillin, tetracyclin) và cỏc marker chọn lọc; đặc biệt đối với vector pUC19 cho thấy vị trớ đa tạo dũng (chứa nhiều vị trớ cắt của cỏc enzyme giới hạn – xem thờm ở Hỡnh 8.7B). Với vector pUC19, lacZ′ = gen β-galactosidase; lacI = gen ức chế của operon Lac.
Hỡnh 8.7B. Bản đồ của một đoạn trỡnh tự chứa nhiều vị trớ tạo dũng của cỏc enzyme giới hạn khỏc
nhau của vector pUC19.
Trong số cỏc vector, cỏc plasmid của vi khuẩn được sử dụng rộng rói hơn cả, nhờ cú cỏc đặc điểm sau: (i) Mỗi plasmid là một phõn tử ADN sợi kộp thường ở dạng vũng và chỉ cú một khởi điểm tỏi bản riờng; (ii) Cú khả năng xõm nhập vào tế bào vật chủ và hoạt động bỡnh thường; (iii) Cú kớch thước bộ, thường chỉ vài ngàn cặp bazơ nờn dễ dàng tinh chiết; (iv) Số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khỏ cao; (v) Một số plasmid cú chứa cỏc gen khỏng thuốc tiện lợi cho việc theo dừi và phỏt hiện sự cú mặt của plasmid tỏi tổ hợp trong vi khuẩn chủ.
Hỡnh 8.8. Cỏc đầu dớnh của ADN lambda (a) và vector lambda cú xen một vựng ADN miễn dịch gt10 thụng qua vết cắt của EcoRI.
Hỡnh 8.9 Cấu trỳc và sử dụng của nhiễm sắc thể nhõn tạo của nấm men (YAC). Chỳ thớch:
trp1, ura3 = cỏc marker chọn lọc; cen/ars = centromere và trỡnh tự tỏi bản tự trị (autonomously replicating sequence = ARS), cho phộp tỏi bản ở S. cerevisiae; tel = telomere; để đơn giản, khởi điểm tỏi bản của E. coli và cỏc marker chọn lọc đối với E. coli khụng nờu ra ở đõy.
Trong số cỏc phage dựng làm vector thỡ phage lambda (λ; Hỡnh 8.8) cú nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ ở phần giữa của bộ gen cú chứa một số gen khụng quan trọng và khụng liờn quan với sự tỏi bản của nú, nờn thuận lợi cho việc xen đoạn ADN mong muốn vào đõy. Cỏc phage khụng chứa cỏc gen khỏng thuốc cho nờn việc theo dừi phage tỏi tổ hợp được xỏc định dựa vào cỏc vết tan dương tớnh
(positive plaques) trờn nền vi khuẩn.
Sau này, do kỹ thuật cụng nghệ ADN tỏi tổ hợp phỏt triển nhằm phục vụ cho giải trỡnh tự bộ gen cỏc sinh vật và đặc biệt là bộ gen người, cỏc plasmid kớch thước lớn ở nấm men được phỏt hiện và sử dụng rộng rói. Người ta đó tạo ra cỏc nhiễm sắc thể nhõn tạo của nấm men (yeast artificial chromosome = YAC; Hỡnh 8.9) và cỏc nhiễm sắc thể nhõn tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosome = BAC) gọi là cỏc siờu vector (supervectors).