Đặc điểm của gen dreb5 ở hai giống đậu tương cúc lông phú bình và vàng ngân sơn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THÙY GIANG ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN DREB5 Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÚC LƠNG PHÚ BÌNH VÀ VÀNG NGÂN SƠN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THÙY GIANG ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN DREB5 Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÚC LÔNG PHÚ BÌNH VÀ VÀNG NGÂN SƠN Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HỒNG MẬU THÁI NGUN – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill ) lƣơng thực có vị trí quan trọng cấu trồng nơng nghiệp giới nói chung Việt Nam nói riêng Trong họ đậu, đậu tƣơng đƣợc coi loại trồng chiến lƣợc nhiều quốc gia giới, có tác dụng nhiều mặt, có hiệu kinh tế cao, có thời gian sinh trƣởng ngắn lại dễ trồng Sản phẩm từ đậu tƣơng đƣợc sử dụng cho ngƣời gia súc nhƣ dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nƣớc tƣơng, làm bánh kẹo, sữa đậu nành đáp ứng nhu cầu đạm phần ăn hàng ngày ngƣời nhƣ gia súc [2] Hạt đậu tƣơng có từ 32% đến 56% protein từ 12% đến 25% lipit, từ 10-15% gluxit chứa nhiều loại vitamin [2] Gần nhà khoa học nghiên cứu phát đậu tƣơng có vai trị chữa điều trị bệnh nan y nhƣ ung thƣ, tim mạch Đậu tƣơng cịn giải phần vấn đề nóng bỏng giới lƣợng từ sản phẩm Ngồi ra, đậu tƣơng cịn có tác dụng cải tạo đất nhờ vi khuẩn cố định đạm chứa nốt sần rễ Với giá trị to lớn đó, đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến nhiều nơi từ 55o vĩ Bắc đến 55o vĩ Nam, từ vùng thấp mực nƣớc biển đến vùng cao 2000m so với mực nƣớc biển với diện tích đạt khoảng 74,7 triệu Hiện nay, Việt Nam, đậu tƣơng chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nên đƣợc gieo trồng vùng nơng nghiệp nƣớc với mục đích giải vấn đề thiếu protein cho ngƣời gia súc, xuất cải tạo đất Trên giới, đậu tƣơng đƣợc sản xuất quy mô lớn phát triển mạnh mẽ nƣớc Nam Mỹ nhƣ Brazil, Argentina, Canada nhƣng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lớn phải kể đến Mỹ gần Trung Quốc Hàng năm họ sản xuất đƣa thị trƣờng giới hàng triệu tấn/năm, điều góp phần giải vấn đề nóng giới nhƣ lƣợng, nhiễm Nƣớc ta có hệ sinh thái đa dạng, khí hậu vùng miền lại khơng giống Địa hình có đến 3/4 đồi núi thƣờng có mùa khơ hanh miền bắc, mùa khơ nóng Tây Ngun… Những năm gần diễn biến khí hậu ngày phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không vùng thời kỳ năm nên hạn hán nắng nóng kéo dài Tình trạng hạn hán ảnh hƣởng đến sản xuất đậu tƣơng không Việt Nam mà nƣớc sản xuất đậu tƣơng hàng đầu giới nhƣ Argentina Thống kê cho thấy, sản lƣợng đậu tƣơng Argentina vào vụ mùa năm 2009 giảm từ 34,5 triệu so với thời điểm năm 2008 46,2 triệu Ở Việt Nam, tình hình thiếu nƣớc trầm trọng địa phƣơng làm cho sản lƣợng đậu tƣơng năm 2009 giảm xuống cịn 213,6 nghìn so với năm 2007 275,2 nghìn năm 2008 267,6 nghìn [33] Đậu tƣơng tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm chịu hạn Chính nghiên cứu tạo giống đậu tƣơng có kiểu gen chống chịu hạn có khả sống điều kiện bất lợi nƣớc hƣớng nghiên cứu đƣợc quan tâm nhà chọn giống [6], [7] Cho đến Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu tìm hiểu sở phân tử đặc tính chịu hạn đậu tƣơng (Trần Thị Phƣơng Liên, 1999 [5]; Chu Hoàng Mậu, 2001 [7]; Hoàng Thị Thu Yến đtg 2003 [10]), kết nghiên cứu cơng trình rằng, thông tin gen protein liên quan đến tính chịu hạn đậu tƣơng sở cho việc tìm kiếm ứng dụng nhằm nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng Q trình phiên mã nhóm gen chịu hạn chịu tác động yếu tố điều khiển q trình phiên mã, có nhân tố DREB Nghiên cứu ứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn dụng protein DREB thành công đối tƣợng nhƣ khoai tây, cà chua, hoa cúc, lúa mì , nhƣng đậu tƣơng cơng trình nghiên cứu gen DREB cịn đƣợc cơng bố Vì vậy, nghiên cứu nhân tố phiên mã theo hƣớng tăng cƣờng khả biểu nhóm gen liên quan đến đặc tính chịu hạn đậu tƣơng đƣợc chúng tơi quan tâm nghiên cứu Từ lí tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: “Đặc điểm gen DREB5 hai giống đậu tƣơng Cúc lơng Phú Bình Vàng Ngân Sơn” Mục tiêu đề tài Xác định đƣợc sai khác trình tự gen DREB5 hai giống đậu tƣơng nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin gen DREB5 thành phần phản ứng để nhân gen DREB5; 3.2 Nhân gen DREB5 từ DNA hệ gen đậu tƣơng kỹ thuật PCR; 3.3 Tách dịng đọc trình tự gen DREB5 hai giống đậu tƣơng Cúc lơng Phú Bình (CPB) Vàng Ngân Sơn (VNS); 3.4 So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid hai giống đậu tƣơng CPB, VNS so sánh với trình tự DREB5 công bố Ngân hàng gen quốc tế Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Đặc điểm nông sinh học thành phần hoá sinh hạt đậu tƣơng Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill), có nhiễm sắc thể 2n = 40, loại trồng thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bƣớm (Papilionoidea) có nguồn gốc từ tỉnh phía Bắc Đơng Bắc Trung Q́c , vùng kế cận Cộng hòa Liên bang Nga, Triều Tiên Nhật Bản Các giống đậu địa phƣơng của nƣớc ta hiện đƣợc du nhập tƣ̀ Trung Quốc đã tƣ̀ lâu đời [2] Cây đậu tƣơng là thân thảo , phân cành dạng bụi đậu tƣơng có phận rễ, thân, lá, hoa Trong đậu tƣơng kép với chét, nhƣng cũng có – chét Hoa màu trắng hay tí m, thẳng hay quả cong đều có nhiều lông Vỏ hạt đậu tƣơng có màu nâu hoặc đen, vàng, xanh Khối lƣợng hạt rất đa dạng tƣ̀ 200 – 400mg/hạt Cây đậu tƣơng có đặc tí nh sinh trƣởng : sinh trƣởng hƣ̃u hạn và sinh trƣởng vô hạn ; thời gian sinh trƣởng có loại: chín sớm (75 – 85 ngày), trung bì nh (80 – 100 ngày), muộn (110 – 120 ngày) Thời gian sinh trƣởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn trồng luân canh xen vụ Một đặc điểm nổi bật là ở rễ đậu tƣơng thƣờng có nốt sần chƣ́a vi k huẩn có khả cố đị nh nitơ tƣ̣ do, trồng đậu tƣơng còn có tác dụng cải tạo đất Các cơng trình nghiên cƣ́u cho thấy nhƣ̃ng giống có khả cộng sinh và có đủ nốt sần thƣờng làm cho lƣợng protein cao Đậu tƣơng tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tƣơng có nhƣ̃ng giớng chỉ trờng vào vụ hè, có giống trồng vào vụ đông [2] Cây đậu tƣơng với trồng khác nhƣ bông, lạc, hƣớng dƣơng, cải dầu , dƣ̀a và cọ loại lấy dầu quan trọng đƣợc quan tâm, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đó , đậu tƣơng là trồng lấy hạt , cung cấp dầu quan trọng bậc nhất các lấy dầu Hiện nay, thống kê của FAO cho thấy tƣ̀ năm 1980 trở lại sản lƣợng đậu tƣơng giới tăng lên lần chủ yếu nhờ vào tăng diện tí ch và suất Trong vòng 20 năm qua diện tí ch gieo trồng tăng nhanh, suất bì nh quân khá cao 23 tạ/ha Các nƣớc sản xuất đậu tƣơng đứng đầu giới : Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90 – 95% tổng sản lƣợng đậu tƣơng thế giới [33] Hiện , Việt Nam đậu tƣơng chiếm vị trí quan trọng nền sản xuất nông nghiệp, đặc biệt ở nhƣ̃ng vùng nông thôn nghèo , kinh tế chƣa phát triển Nhƣng ngành sản xuất đậu tƣơng nƣớc ta chƣa đƣợc đầu tƣ, suất còn thấp, vậy nghiên cƣ́u cải tiến các đặc điểm nông sinh học giống địa phƣơng tạo giố ng mới có suất cao , thích nghi với điều kiện sinh thái ở nhƣ̃ng vùng khác bằng phƣơng pháp truyền thống kết hợp với kỹ thuật hiện đại sẽ đáp ƣ́ng đƣợc yêu cầu của thƣ̣c tiễn đặt và đó là chiến lƣợc quan trọng về sƣ̣ phát triển đậu đỗ của nƣớc ta Trong hạt đậu tƣơng, protein chiếm từ 30 – 56%, lipit 12- 25%, gluxit 20%; có muối khống Ca, Mg, K, P, Na, S, Fe, vitamin A, B1, B2, D, E, F, men, sáp, nhựa, cellulose Ngoài ra, đậu tƣơng cịn có đầy đủ amino acid bản, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylanalin, tryptophan, valin [2] Protein thành phần chủ yếu hạt chiếm từ 30 - 56%, thực tế cho thấy kiểu gen điều kiện canh tác làm ảnh hƣởng tới hàm lƣợng protein nhƣng chúng chứa hàm lƣợng protein lớn loài thực vật khác [2] Protein đƣợc dự trữ bào quan, có chức cung cấp nguồn amino acid nitơ cho trình nẩy mầm hạt, protein dự trữ chủ yếu hạt đậu tƣơng albumin globulin Dựa vào hệ số lắng ngƣời ta chia protein Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hạt đậu tƣơng thành loại: legumin, vixilin, enzim chất ức chế enzim có chất protein Trong hạt đậu tƣơng protein dự trữ chiếm tới 70%, enzim, chất ức chế proteaza lectin Thành phần protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan nƣớc (75,8%), globulin tan NaCl chiếm 3%, glutelin tan NaOH 0,2M chiếm 11,7% [5] Protein họ đậu nói chung, đậu tƣơng nói riêng đƣợc coi chất lƣợng tốt loại protein thực vật, chúng chứa tất amino acid không thay cần thiết cho thể ngƣời động vật, tỷ lệ lyzin cao, hàm lƣợng amino acid chứa gốc SH nhƣ methyonin, systein thấp [5], [7], [29] Hàm lƣợng lipid hạt đậu tƣơng cao chiếm từ 12 – 25% khối lƣợng khơ, hàm lƣợng axit béo no thấp, khoảng 13% khơng có cholestrol, 30% axit béo không no nối đôi Lƣợng axit không no cần thiết: axit linoleic 50%, đặc biệt có 7% axit - linoleic nguồn cung cấp chuỗi mạch dài omega quan trọng cho thể nhƣ DHA (Docosa Hexaenoic Acid) EPA (Eicosa Pentaenoic Acid) Chất lƣợng lipit hạt đậu tƣơng tốt, đƣợc sử dụng rộng rãi cơng nghiệp chế biến thực phẩm Hạt đậu tƣơng cịn có vitamin tan lipit, đặc biệt vitamin E=200mg/100glipit [2], hạt đậu tƣơng chứa số chất khác nhƣ cacbon hydrat, muối khống, axit nucleic, kích thích sinh trƣởng 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam Trên giới: Với giá trị kinh tế sử dụng đậu tƣơng nên đƣợc xem loại trồng chiến lƣợc nhiều quốc gia với vị trị đứng sau lúa, ngơ lúa mì Do có khả thích nghi rộng với điều kiện khí hậu sinh thái khác nên đậu tƣơng đƣợc trồng rộng rãi năm châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ, tiếp đến Châu Á Theo thống kê Tổ chức Nông nghiệp Lƣơng thực Liên hiệp quốc, diện Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tích gieo trồng đậu tƣơng giới tăng khoảng 3,6 triệu vòng năm trở lại (năm 2006 95,2 triệu năm 2009 98,8 triệu ha) [33] Trong đó, Hoa Kỳ quốc gia có diện tích gieo trồng đậu tƣơng lớn 30,91 triệu tiếp đến quốc gia Brazil (21,76 triệu ha) Argentina (16,77 triệu ha) vào năm 2009 (Bảng 1.1) so với Việt Nam 0,15 triệu Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tƣơng số quốc gia giới Quốc gia Diện tích thu hoạch (triệu ha)* Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Argentina 15,13 15,98 16,39 16,77 Brazil 22,05 20,57 21,06 21,76 Trung Quốc 9,30 8,75 9,13 8,80 Ấn Độ 8,33 8,88 9,52 9,60 Indonesia 0,58 0,46 0,59 0,72 Thailan 0,14 0,13 0,12 0,11 Hoa Kỳ 30,19 25,96 30,22 30,91 Việt Nam 0,19 0,19 0,19 0,15 * Theo số liệu thống kê Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO) [33] Mặc dù diện tích gieo trồng đậu tƣơng tăng lên đáng kể năm trở lại nhƣng sản lƣợng đậu tƣơng giới lại có biến động khác năm Năm 2006 sản xuất đậu tƣơng giới đạt 221,9 triệu tấn, năm 2007 giảm xuống 219,5 triệu tấn, tăng lên vào năm 2008 230,5 triệu nhƣng năm 2009 222,2 triệu Năm 2009, Hoa Kỳ quốc gia sản xuất đậu tƣơng nhiều giới với 91,42 triệu tấn, Brazil với 56,96 triệu Argentina 30,99 triệu [33] (Bảng 1.2) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.2 Sản lƣợng sản xuất đậu tƣơng số quốc gia giới Quốc gia Sản lƣợng (triệu tấn)* Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Argentina 40,54 47,48 46,24 30,99 Brazil 52,46 57,86 59,24 56,96 Trung Quốc 15,50 12,73 15.55 14,50 Ấn Độ 8,86 10,97 9,91 10,22 Indonesia 0,75 0,59 0,78 0,97 Thailan 0,21 0,20 0,19 0,19 Hoa Kỳ 87,00 72,86 80,75 91,42 Việt Nam 0,26 0,28 0,27 0,21 * Theo số liệu thống kê Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO) [33] Trong bốn năm trở lại suất cao đạt đƣợc vào năm 2007 24,3 tạ/ha thấp năm 2009 22,4 tạ/ha Trong số quốc gia trồng đậu tƣơng hàng đầu giới Hoa Kỳ trì đƣợc suất đậu tƣơng chí có phần tăng vào năm 2009 so với năm 2006, 2007 2008 (Bảng 1.3) Argentina nƣớc có suất đậu tƣơng giảm mạnh vào năm 2009 18,48 tạ/ha so với năm trƣớc trung bình đạt khoảng 27 tạ/ha (Bảng 1.3) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.10 cho thấy trình tự amino acid đƣợc phân bố hai nhóm: Nhóm thứ giống đậu tƣơng CPB, VNS Xanh Tiên Đài; Nhóm thứ hai gồm Bản Giốc EF 583447 Theo Nguyễn Thị Minh Hồng (2010) Nguyễn Hiệp Hòa (2010) giống đậu tƣơng CPB, VNS Xanh Tiên Đài đƣợc đánh giá có khả chịu hạn Giống đậu tƣơng Bản Giốc giống đậu tƣơng Trung Quốc EF 583447 giống chịu hạn tốt Điều chứng tỏ sai khác trình tự amino acid năm giống đậu tƣơng có liên quan đến khả chịu hạn giống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã nhân bản, tách dịng thành cơng giải trình tự nucleotide gen mã hoá nhân tố phiên mã DREB5 từ DNA hệ gen hai giống đậu tƣơng CPB VNS Trình tự nucleotide gen DREB5 giống CPB giống VNS dài 924bp Trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tƣơng CPB giống đậu tƣơng VNS có độ tƣơng đồng cao (99,2%) Trình tự nucleotide gen DREB5 giống CPB so với ba giống EF583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 92,4% đến 99,1% Trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tƣơng VNS so với ba giống EF583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 92,4% đến 98,5% Trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tƣơng CPB giống đậu tƣơng VNS có độ tƣơng đồng cao (98,7%) Trình tự amino acid protein DREB5 giống CPB so với ba giống EF 583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 88,7% đến 98,4% Trình tự amino acid protein DREB5 giống VNS so với ba giống EF 583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 88,4% đến 97,4% Đề nghị Cần tiếp tục nghiên c ứu gen DREB làm sở thiết kế vector mang cấu trúc gen DREB5 phục vụ chuyển gen tạo đậu tƣơng biến đổi gen chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bì nh, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chị u ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại Học Quốc gia, Hà Nội: 92 - 98 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Nguyễn Thị Thúy Hƣờng , Chu Hoàng Mậu , Lê Văn Sơn , Nguyễn Hƣ̃u Cƣờng, Lê Trần Bì nh , Chu Hoàng Hà (2008), “Đánh giá khả chị u hạn phân lập gen P 5CS một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”, Tạp chí cơng nghệ sinh học 6(4): 459 – 466 Trần Thị Phƣơng Liên , Nguyễn Huy Hoàng , Đinh Duy Kháng , Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (1998), “Phân lập gen chaperomin ở giống đậu tương chịu nóng M103”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ , 36: - 14 Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tí nh hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả chị u nóng , chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học , Viện Công nghệ sinh học , Hà Nội: 2234 Trần Đì nh Long (1991), Những nghiên cứu mới về chọn tạo giống đậu đỗ , NXB Nông nghiệp, Hà Nội: 1-10 Chu Hồng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đợt biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thu Hiền (2007), “Đánh giá khả chịu hạn tách dịng gen mã hóa protein dehydrin (LEA-D11) mợt số giống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 đậu tương (Glycine max L Merrill) địa phương miền núi”, Tạp chí Sinh học, 29(4): 31-41 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Minh Hồng, Hoàng Văn Mạnh (2011), “Đặc điểm gen DREB1 phân lập từ giống đậu tương địa phương (Glycine max L Merrill) Xanh lơ Ba bể (Bắc Kạn)”, Tạp chí Sinh học, 33(1): 74 - 79 10 Hồng Thị Thu Yến , Chu Hoàng Mậu , Nghiêm Ngọc Minh , Nơng Văn Hải, Trịnh Đình Đạt (2003), “Phân lập gen chaperonin ở các dòng đậu tương đột biến ML 10, ML48 ML 61”, Nhƣ̃ng vấn đề nghiên cƣ́u bản khoa học sƣ̣ sống, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 1073 – 1076 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 Cao Xin-You, and MA You-Zhi (2008), “Isolation and Identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean (Glycine max)” Acta Agronomica Sinica, 34(10): 1688−1695 12 Chen M., Wang Q Y, Cheng X G, Xu Z S, Li L C, Ye X G, Xia L Q, Ma Y Z., (2007) “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants” Biochem Biophys Res Commun 353(2): 299 - 305 13 Close T.J (1996), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins”, Physiol Plant 97: 795 – 803 14 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2005), “AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis”, Plant Cell 17(12): 3470 - 88 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 15 Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, Jiaming Guo and Youzhi Ma (2009), “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco” Journal of Experimental Botany, 60(13): 3781- 3796 16 Gawel N J., Jarret R L., (1991), Genomic DNA isolation http://www Weihenstephan.de/pbpz/bambra/html/dna.htmn 17 Hartl F.U (1996), “Molecular chaperones in cellular protein folding”, Nature, 381: 571 – 580 18 Keder J C.(1996), “Lipid – transfer proteins in plant”, Annual review of Plant Physiology and Plant moculelar Biology, 47: 627 – 654 19 Chu Hoang Lan, Nguyen Tuan Anh, Nguyen Vu Thanh Thanh, Nguyen Hiep Hoa, Chu Hoang Mau (2010), “Characterization of the GmDREB5 gene isolated from the soybean cultivar Xanh Tien Dai, Vietnam” Proceedings of 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010), 28-30, December 2010, Hong Kong, IEEE: 354-358 20 Liao Y., Zou H F., Wang H W., Zhang W K., Ma B., Zhang J S., Chen S Y., (2008), “Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants”, Cell Res, 18(10): 1047-1060 21 Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M and Peng Y (2007), “Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea”, Plant Sci 172 (1): 120-130 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 22 Liu Q., Y Sakuma, H Abe, M Kasuga, S Miura, K YamaguchiShinozai, and K Shinozaki (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low temperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis” Plant Cell 10: 1391–1406 23 Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein II (LTP 2) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300807 24 Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein I (LTP 1) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300806 25 Maitra N, Cushman J C (1994), “Isolation and characterization adrought – induced soybean cDNA encoding aD95 family late – embryogenesis – abudant protein”, Plant Physiol, 106: 805 - 806 26 Chu Hoang Mau, Nguyen Tuan Anh, Pham Thi Thanh Nhan, Dinh Thi Ngoc, Bui Thi Tuyet (2010), “The characteristics of chaperonin gene isolated local soybean cultivars (Glycine max L Merrill) grown in Tay Nguyen region, Viet Nam” Proceedings of 2010 International Conference on Chemical Engineering and Applications (CCEA 2010), Singapore: 452 - 456 27 Chu Hoang Mau, Nguyen Thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2010), “Characteristics of the gene encoding pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS) in Vietnam soybean cultivars (Glycine max L Merrill)”, Proceedings of 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010), 28-30, December 2010, Hong Kong, IEEE: 319-323 28 Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants” J Exp Bot, 56(417): 1933 - 1942 29 Serrtti C., Schapagh W T ADN Leffel R.C (1994), “Amino acid profile of high seed protein soybean”, Crop Sci, 34: 207 – 209 30 Tran L S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki K., (2007), “Co-expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis”, Plant J, (1): 46 - 63 31 Wangxia W., Basia V., Oded S., Arie A (2004), “Role of plant heat shock proteins and mocular chaperones in the abiotic stress response”, Plant Science, 9(5): 244 – 252 32 Wang Y M and He C.F (2010), “A cold-induced DREB gene in Aloe vera L”, Plant Mol Biol Rep 25: 121-132 33 Http://faostat.fao.org 34 Http://www.gso.gov.vn 35 Zhaoshi Xu, Ming Chen, Lanqin Xia, Liancheng Li, Xianguo Cheng, Jianhui Dong, Qiaoyan Wang and Youzhi Ma, (2008), Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-binding transcription factor gene, GmDREB3, in soybean (Glycine max L.): 121 – 135 36 Dubouzet JG, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura S, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, (2003) OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression: 63 – 751 37 Yanfang Yang, Jian Wu, Kai Zhu, Liqing Liu, Fadi Chen and Deyue Yu, (2007), Identification and characterization Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên of two chrysanthemum http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 (Dendronthema × moriforlium) DREB genes, belonging to the AP2/EREBP family 38 Xue-Ping Li, Ai-Guo Tian, Guang-Zuo Luo, Zhi-Zhong Gong, Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen, (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trì nh nghiên cƣ́u của riêng Các số liệu, kết quả nêu luận v ăn là trung thƣ̣c và chƣa tƣ̀ng công bố bất kỳ công trì nh nào khác Thái Nguyên, ngày 19 tháng năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thùy Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hồng Mậu, Đại học Thái Ngun tận tình hƣớng dẫn , tài trợ kinh phí và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Ngun trực tiếp hƣớng dẫn tơi tiến hành thí nghiệm đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ cán thuộc Phịng thí nghiệm Sinh học, Khoa khoa học sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Bộ môn Sinh học phân tử - Công nghệ gen, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác, Viện nghiên cứu Ngô cung cấp hạt số giống đậu tƣơng làm vật liệu nghiên cứu cho đề tài luận văn Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè nhiệt tình ủng hộ động viên tơi suốt q trình thực luận văn Công trình được thực với tài trợ kinh phí dự án TRIG Tác giả luận văn Nguyễn Thùy Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 BẢNG NHƢ̃NG CHƢ̃ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid (Axit abxisic) DNA Deoxyribonucleic amino ASTT Áp suất thẩm thấu bp Base pair (Cặp base) CTAB Cetyltrimethyl – ammonium bromide đtg Đồng tác giả DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethylen Diamin Tetraaccetic Amino kb Kilo base HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) LEA Late Embryogenesis Abundant (Protein tí ch lũy với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trì nh hì nh thành phôi) LTP Lipid transfer protein (Protein vận chuyển lipid) MGPT Môi giới phân tƣ̉ (Molecular chaperone) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TAE Tris Acetate EDTA CPB Giống đậu tƣơng địa phƣơng Cúc lơng Phú Bình VNS Giống đậu tƣơng địa phƣơng Vàng Ngân Sơn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN BẢNG NHƢ̃NG CHƢ̃ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC HÌ NH TRONG LUẬN VĂN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài 3 Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Đặc điểm nông sinh học thành phần hóa sinh hạt đậu tƣơng 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.2 GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 12 1.2.1 Hạn tác động hạn đến đậu tƣơng 12 1.2.2 Các gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tƣơng 16 1.2.2.1 Các gen chức 17 1.2.2.2 Các gen điều khiển trình phiên mã 20 1.3 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB 23 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 2.1 NGUYÊN LIỆU THƢ̣C VẬT 26 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 26 2.2.1 Các hóa chất chuyên dụng 26 2.2.2 Thiết bị 27 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 28 2.3.2 Định lƣợng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 29 2.3.3 Kỹ thuật PCR 29 2.3.4 Tạo vector tái tổ hợp 31 2.3.5 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide xử lí số liệu 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1.Kết khuếch đại tách dòng gen DREB5 từ hai giống đậu tƣơng CPB VNS 35 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số giống đậu tƣơng địa phƣơng 35 3.1.2 Nhân gen DREB5 tƣ̀ giớng đậu tƣơng Cúc lơng Phú Bình (CPB) Vàng Ngân Sơn (VNS) 36 3.1.3 Kết quả tách dòng gen DREB5 .37 3.2 Kết xác định trình tự gen DREB5 giống đậu tƣơng CPB VNS 40 3.3 So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tƣơng Cúc lơng Phú Bình Vàng Ngân Sơn Việt Nam với gen DREB5 giống đậu tƣơng khác 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 71 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên các bảng luận văn Trang 1.1 Diện tích sản xuất đậu tƣơng số quốc gia giới 1.2 Sản lƣợng sản xuất đậu tƣơng số quốc gia giới 1.3 Năng suất đậu tƣơng số quốc gia giới 1.4 Sản lƣợng sản xuất đậu tƣơng tỉnh thành phố 11 2.1 Nguồn gốc đặc điểm của các giống đậu tƣơng nghiên cƣ́u 26 2.2 Danh mục các thiết bị sƣ̉ dụng 27 2.3 Mồi nhân gen DREB5 29 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen DREB5 30 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 31 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 32 3.1 Thống kê vị trí nucleotide thay đổi gen DREB5 CPB VNS với EF 583447, Xanh Tiên Đài Bản Giốc 45 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide gen 3.2 DREB5 giống đậu tƣơng CPB, VNS với giống 52 đậu tƣơng, Xanh Tiên Đài, Bản Giốc EF583447 3.3 3.4 Trình tự amino acid gen DREB5 thay đổi 56 giống đậu tƣơng So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự amino acid c protein DREB5 giống đậu tƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 72 DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Tên các hì nh luận văn Trang Cơ chế phân tử q trình tăng cƣờng tính chịu hạn thực vật Hình ảnh điện di DNA tổng số giống đậu tƣơng nghiên cứu Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen DREB5 giống đậu tƣơng Vector pTZ57R/T 21 35 36 37 Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit enzym giới hạn BamHI So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tƣơng CPB VNS So sánh trình tự amino acid CPB VNS 38 41 42 So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 CPB, VNS với Xanh Tiên Đài, Bản Giốc EF 583447 Sơ đồ hình biểu diễn quan hệ di truyền dựa trình tự gen DREB5 số giống đậu tƣơng So sánh trình tự amino acid CPB, VNS với EF 583447, Xanh Tiên Đài Bản Giốc 45 53 55 Sơ đồ hình biểu diễn quan hệ di truyền dựa 3.10 trình tự amino acid protein DREB5 58 giống đậu tƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 ... tài luận văn thạc sĩ là: ? ?Đặc điểm gen DREB5 hai giống đậu tƣơng Cúc lơng Phú Bình Vàng Ngân Sơn? ?? Mục tiêu đề tài Xác định đƣợc sai khác trình tự gen DREB5 hai giống đậu tƣơng nghiên cứu Nội dung... HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THÙY GIANG ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN DREB5 Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÚC LƠNG PHÚ BÌNH VÀ VÀNG NGÂN SƠN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN... tin gen DREB5 thành phần phản ứng để nhân gen DREB5; 3.2 Nhân gen DREB5 từ DNA hệ gen đậu tƣơng kỹ thuật PCR; 3.3 Tách dòng đọc trình tự gen DREB5 hai giống đậu tƣơng Cúc lơng Phú Bình (CPB) Vàng