Phân lập và lưu giữ gen h5 của hai chủng virus cúm a h5n1 thu nhận năm 2013 tại khánh hoà việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VIỆT LINH PHÂN LẬP VÀ LƢU GIỮ GEN H5 CỦA HAI CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 THU NHẬN NĂM 2013 TẠI KHÁNH HÒA – VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VIỆT LINH PHÂN LẬP VÀ LƢU GIỮ GEN H5 CỦA HAI CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 THU NHẬN NĂM 2013 TẠI KHÁNH HÒA – VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học M· sè: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Bích Nga THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Bích Nga – phịng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, PGS TS Lương Thị Hồng Vân – Viện Khoa học sống – Đại học Thái Nguyên người thầy trực tiếp giúp đỡ bảo tận tình cho tơi suốt q trình nghiên cứu, học tập hồn thành luận văn Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thanh Hòa – Trưởng phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện hướng dẫn thời gian thực đề tài Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể cô, chú, anh, chị Phịng Miễn dịch học – Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ trình tiến hành thí nghiệm tạo điều kiện để tơi hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, Ban lãnh đạo Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, thầy cô khoa Khoa học sống tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí đề tài sở: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 clade 1.1 xuất Việt Nam lưu giữ gen để kiến tạo vacxin hệ mới” (2012-2013) Viện Công nghệ sinh học, PGS TS Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen trang thiết bị Cuối lời cảm ơn đặc biệt, tơi xin dành cho gia đình, người thân bạn bè tình yêu thương, động viên giúp đỡ hết lịng tơi học tập sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2014 Học viên Nguyễn Việt Linh Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn kết luận văn tơi thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Bích Nga Các số liệu, kết cơng bố luận văn hồn tồn trung thực xác Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT STT Từ thuật ngữ viết tắt AI WHO cDNA Ck Dal Dk DMSO DNA EtBr 10 GP 11 HA 12 HEF 13 HPAI 14 Kb 15 LB 16 LPAI 17 M 18 MCS 19 MEGA 20 N 21 NA 22 NP 23 NS 24 ORF 25 PA 26 PB 27 PCR 28 RNA 29 RNP 30 RT-PCR 31 SHPT 32 NJ Nghĩa đầy đủ từ thuật ngữ viết tắt Avian Influenza Tổ chức y tế giới (World Trade Organization) Complementary Deoxyribonucleic Chicken Dalton Duck Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid Ethidium bromide Glycoprotein Hemagglutinin Hemagglutinin esterase fusion Highly pathogenic avian influenza Kilobase pair Luria Bertami Low pathogenic avian influenza Matrix protein Mutiple cloning site Molecular Evolutionary Gentics Analysis Asparagin Neuraminidase Nucleoprotein Non-structural protein Open reading frame (Khung đọc mở) Polymerase acidic protein Polymerase basic protein Polymerase chain reaction Ribonucleic acid Ribonucleoprotein Reverse transcription – polymerase chain reaction Sinh học phân tử Neighbour Joining Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Thống kê số lượng người bị nhiễm chết cúm gia cầm qua năm Bảng 2.1: Thành phần chuyển đổi cDNA nghiên cứu 28 Bảng 2.2: Danh sách cặp mồi sử dụng thu nhận gen H5 28 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR chu trình nhiệt 28 Bảng 3.1: Minh họa kết truy cập ngân hàng Gen sử dụng trình tự nucleotide chuỗi gen H5 chủng A-Ck-VN-KH23-2013 ADk-VN-KH24-2013 41 Bảng 3.2: Danh sách chủng virus cúm A/H5N1 Việt Nam giới sử dụng gen H5 xác định clade mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 43 Bảng 3.3: Các vị trí nucleotide sai khác gen H5 chủng so sánh 46 Bảng 3.4: Tỉ lệ (%) tương đồng thành phần nucleotid (trên đường chéo); acid amin (dưới đường chéo) gen H5 chủng H5N1 phân lập Việt Nam chủng H5N1 giới 51 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Mơ hình ảnh chụp tiểu phần virus cúm A Hình 1.2: Mối quan hệ lây nhiễm thích ứng vật chủ biến chủng virus cúm A 13 Hình 1.3: Quá trình xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào 15 Hình 1.4: Mơ hình cấu trúc hemagglutinin 17 Hình 1.5: Sơ đồ minh họa đột biến điểm phân đoạn gen virus cúm A 21 Hình 1.6: Sơ đồ minh họa tượng trộn kháng nguyên virus cúm A/H5N1 A/H3N2 22 Hình 2.1: Sơ đồ qui trình nghiên cứu phân tích gen H5 virus cúm A/H5N1 27 Hình 2.2: Cấu trúc vector pCR 2.1- TOPO (Invitrogen Inc.) 30 Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR gen H5 thạch agarose 1% 35 Hình 3.2: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp mang gen H5 enzyme EcoRI 37 Hình 3.3: Trình tự chuỗi gen H5 chủng cúm A-Ck-VN-KH23-2013 39 Hình 3.4: Trình tự chuỗi gen H5 chủng cúm A-Dk-VN-KH24-2013 40 Hình 3.5: So sánh đối chiếu trình tự amino acid gen H5 hai chủng A-Ck-VN-KH23-2013 A-Dk-VN-KH24-2013 với chủng liên quan có Ngân hàng gen 49 Hình 3.6: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng cúm A/H5N1 xác lập dựa thành phần nucleotide gen H5 54 Hình 3.7: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng cúm A/H5N1 dựa thành phần amino acid polypeptide H5 55 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh cúm cúm gia cầm A/H5N1 1.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.1.2.Bệnh cúm người cúm gia cầm 1.1.3 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 giới Việt Nam 1.1.3.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 giới .7 1.1.1.2 Tình hình dịch cúm A/H5N1 Việt Nam .7 1.2 Virus cúm A 1.2.1 Cấu tạo chung danh pháp .8 1.2.2 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 10 1.2.2.1 Cấu trúc chung hệ gen virus cúm 10 1.2.2.2 Chức phân đoạn hệ gen 11 1.2.3 Độc lực tính thích ứng đa vật chủ virus cúm A/H5N1 12 1.2.4 Sức đề kháng virus 14 1.2.5 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào .14 1.2.6 Phương thức lây truyền virus cúm gia cầm A/H5N1 16 1.3 Cấu trúc, chức gen kháng nguyên Hemagglutinin (HA/H5) 17 1.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên 20 1.5 Một số nghiên cứu virus cúm A/H5N1 Việt Nam 23 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nguyên liệu 25 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất 25 2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị .25 2.2.2 Hóa chất 25 2.3 Quy trình nghiên cứu 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp chuyển đổi cDNA .27 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii 2.4.2 Phương pháp PCR 28 2.4.3 Phương pháp điện di kiểm tra tinh sản phẩm PCR 29 2.4.4 Phương pháp dịng hóa 29 2.4.4.1 Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng 29 2.4.4.2 Chuyển nạp sản phẩm dịng hóa vào tế bào khả biến 31 2.4.4.3 Chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc tách chiết DNA tái tổ hợp 31 2.4.4.4 Kiểm tra DNA tái tổ hợp 31 2.4.5 Phương pháp giải trình tự 32 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng phần mềm tin-sinh học .32 2.4.6.1 Nguyên tắc chung 32 2.4.6.2 Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA) 33 2.4.6.3 Chương trình so sánh phân tích chuỗi gen GeneDoc .34 2.4.6.4 Xử lý số liệu nghiên cứu .34 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết thu nhận lưu giữ gen H5 chủng virus cúm A/H5N1 vector tách dòng 35 3.1.1 Kết chuyển cDNA thực PCR .35 3.1.2 Kết dịng hóa lưu gen vector tách dịng .36 3.2 Kết giải trình tự gen H5 .38 3.3 Kết truy cập Ngân hàng Gen (GenBank) 41 3.4 Kết so sánh, phân tích thành phần nucleotide amino acid gen H5 với chuỗi đăng ký Ngân hàng gen 43 3.5 Phân tích tương đồng nucleotide amino acid gen H5 50 3.6 Phân tích mối quan hệ phả hệ xác định kháng nguyên hai chủng phân lập năm 2013 .53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 KẾT LUẬN .57 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Việt Nam nước phát triển, phần lớn dân số sinh sống ngành nghề nơng nghiệp, chăn ni gia cầm chiếm vị trí quan trọng Tuy nhiên, với gia tăng nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thực phẩm gia cầm an tồn xuất bệnh gia cầm thách thức lớn ngành chăn nuôi gia cầm Nhiều nhân tố dịch bệnh làm ảnh hưởng đến chất lượng sản lượng thịt, nhiều đàn gia cầm, thủy cầm mắc bệnh bị tiêu hủy toàn để hạn chế khả lây lan dịch Năm 2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát nhiều nước giới, có Việt Nam Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh diễn biến phức tạp nhiều quốc gia Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có khả gây bệnh người với tỉ lệ tử vong cao trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khoẻ cộng đồng Các cơng trình nghiên cứu hệ gen virus dịch tễ học dịch cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy, chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành gây bệnh có độc lực cao, thích ứng lây nhiễm gây bệnh chủ yếu quần thể chim hoang dã gia cầm, chưa có khả dễ dàng thích ứng lây nhiễm người, q trình tiến hóa chủng virus cúm A/H5N1 ln có biến đổi hệ gen, đặc biệt gen kháng nguyên hemagglutinin (HA(H5)) neuraminidase (NA(N1)), để trở thành virus cúm thích ứng lây truyền người Hai protein (H5 N1) bề mặt vỏ capsid hạt virus cúm A/H5N1, có vai trò quan trọng liên quan đến khả xâm nhiễm, độc lực gây bệnh virus vật chủ mang đặc tính kháng nguyên đặc trưng chủng virus Trong đó, protein kháng nguyên H5 mã hóa phân đoạn 4, có vai trị định độc lực, tính gây bệnh khả thích ứng xâm nhiễm virus loài vật chủ khác vị trí qui định trình tự nucleotide gen H5 điểm cắt protease (chuỗi nối HA1-HA2) Sự xuất tích lũy đột biến nucleotide trình tự gen H5, dẫn đến thay đổi amino acid trình tự protein H5 mã hóa, làm thay đổi 56 Virus cúm A/H5N1 lần phát vào năm 1996 Quảng Đông (Trung Quốc) thuộc clade (A-Gs-Gd-1996(H5N1)), khoảng 10 năm gần (từ 2003 nay), trình tiến hóa gen HA (H5) phát sinh thêm nhiều clade Đặc biệt xuất thêm clade 2.3.2.1 phổ biến Đông Nam Á nhiều quốc gia từ năm 2009 – 2012, phát chim hoang dã, sau gia cầm Trung Quốc (vùng Thanh Hải), Mông Cổ, Nga, Lào Sự xuất clade 2.3.2.1 nay, đặc biệt có đa nhiễm clade 2.3.2.1A; 2.3.2.1B; 2.3.2.1C Việt Nam làm ảnh hưởng phức tạp hóa chương trình sử dụng vacxin nước số quốc gia vùng Hai chủng nghiên cứu thu nhận địa phương (tỉnh Khánh Hòa) thời điểm nhiên lại có khác biệt nguồn gốc phả hệ, điều cho thấy mức độ tiến hóa biến đổi virus cúm A/H5N1 gia cầm ngày đa dạng có lưu thơng nhanh chóng cần đặc biệt quản lý chặt chẽ cơng tác kiểm sốt dịch bệnh vận chuyển gia cầm địa phương 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Gen H5 hai chủng A-Ck-VN-KH23-2013 A-Dk-VN-KH24-2013 phân lập Khánh Hòa – Việt Nam năm 2013, giải trình tự lưu giữ vector tách dịng, có kích thước 1704 nucleotide, mã hóa cho 567 amino acid Chuỗi gen H5 chủng A-Ck-VN-KH23-2013 có mức độ tương đồng cao đạt 95-99% so với gen H5 chủng H5N1 phân lập từ vịt Việt Nam đăng ký Ngân hàng gen Chuỗi gen H5 chủng A-Dk-VN-KH24-2013 có mức độ tương đồng 94-99% so với gen H5 chủng H5N1 phân lập từ vật chủ gà, người Việt Nam, Trung Quốc Gen H5 chủng A-Ck-VN-KH23-2013 A-Dk-VN-KH24-2013 có tỷ lệ tương đồng cao đạt 96% thành phần nuleotide amino acid Cả hai chủng nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng đạt 90-99% nucleotide amino acid so với chủng lựa chọn so sánh Vùng chuỗi nối HA1-HA2 polypeptide H5 suy diễn có motif (-RRRK-) thuộc nhóm HPAI nằm nhóm virus H5N1 độc lực cao Chủng A-Ck-VN-KH23-2013 xác định thuộc clade 2.3.2.1A chủng A-Dk-VN-KH24-2013 xác định thuộc clade 2.3.2.1C KIẾN NGHỊ Tiếp tục giải trình trình tự phân đoạn gen lại hệ gen hai biến chủng A-Ck-VN-KH23-2013 A-Dk-VN-KH24-2013, để phân tích đánh giá mức độ tiến hóa, mối quan hệ kháng nguyên-miễn dịch biến chủng A/H5N1 cập nhật với chủng virus vacxin, nhằm giúp cho việc phòng chống dịch gia cầm ngăn chặn có hiệu dịch cúm A/H5N1 người tương lai 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Quang Anh Văn Đăng Kỳ (2004), “Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đoán kiếm sốt dịch bệnh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3), 69-75 Lê Trần Bình (2007), “Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm (2006-2007”), Trung tâm Thông tin Tư liệu Quốc gia Bộ Khoa học Công nghệ, Hà Nội Võ Văn Bình (2005), “Cúm gà nhiễm virus cúm gà cho người”, Tạp chí thơng tin Y Dược, 12-13 Nguyễn Tiến Dũng (2008), “Vài nét virus cúm gia cầm H5N1”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XV(4), 80-86 Lê Thanh Hòa (2006), “Chiến lược nghiên cứu ứng dụng virus vector tái tổ hợp sản xuất vaccine hệ mới”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, VI(4), 397-416 Lê Thanh Hòa (2006), “Y-sinh học phân tử”, Nhà xuất Y học tập 1, 240 trang Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải (2005), “Nghiên cứu sinh học phân tử chủng virus cúm A/H5N1 phân lập Việt Nam Viện công nghệ sinh học”, Hội nghị khoa học kỉ niệm 30 năm Viện Khoa học Công nghệ sinh học (19/05/2005), 75-82 Lê Quỳnh Mai (2011), “Sự khác kiểu hình HA virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 gây bện cho người Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, V(764), 73-75 Nguyễn Thị Bích Nga Lê Thanh Hịa (2012), “Xác định nhóm kháng nguyên 1.1 2.3.2.1 virus cúm A/H5N1 xuất Việt Nam qua phân tích đặc điểm di truyền phả hệ hemagglutinin (H5) giai đoạn 2004-2011”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, XIX(2), 20-27 10 Một số tư liệu dịch cúm gia cầm vừa qua Việt Nam (2004), “Báo cáo tổng kết cơng tác phịng chống dịch cúm gia cầm Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3), 99-100 11 Lê Văn Năm (2004), “Kết khảo sát biểu lâm sang bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm số sở chăn nuôi tỉnh phía Bắc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI (3), 86-90 59 12 Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp (2006), “Nghiên cứu sản xuất vaccine phịng chống cúm A/H5N1 cho người phơi gà từ chủng NIBRG-14 Viện vaccine sinh phẩm y tế - Nha Trang”, Tạp chí Y học dự phịng, V(84), 5-10 13 Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), “Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1) người khu vực phía Nam”, Tạp chí Y học thực hành, 517, 46-49 14 Cao Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dương (2005), “Đánh giá độc tính khả lây cho người virus cúm A/H5N1 qua vụ dịch 2004-2005 miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen”, Tạp chí Y học dự phòng, XVI(6), 5-10 Tài liệu tiếng Anh 15 Alexander D.J (1996), “Highly Pathogenic Avian Influenza (Fowl plague)”, In: OIE manual of standards for diagnostic tests and vacxins List A and B diseases of mammals, birds and bees, Office InteARNtional des Epizooties 3nd ed., Paris, 155-160 16 Bauer T T., Ewig S, Rodloff A C., Müller E E (2006), “Acute respiratory disess syndrome and pneumonia: a comprehensive review of clinical data, Clinical infectious diseases”, Review, 43(6), 748-756 17 Bosch F X., Garten W, Klenk H D., Rott R (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary sucture of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology, 113(2), 725-735 18 Biswas S K., Nayak D P (1996), “Influenza virus polymerase basic protein interacts with influenza virus polymerase basic protein at multiple sites”, Journal Virol, 70(10), 6716-6722 19 Castrucci M.R., Kawaoka Y (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, Journal Virol,67(2), 759-764 20 Cauthen A N., Swayne D E., Schultz-Cherry S., Perdue M L and Suarez D L (2000), “Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in pouly and humans”, Journal Virol, 74(14), 6592-6599 21 Chen J., Skehel J J., Wiley D C (1999), “N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subuit to form an N cap that 60 terminates the triple-straned coiled coil”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96(16), 8967-8972 22 Creanga A., Nguyen D.T, Gancy N., Do H.T., Balish A., Nguyen H.D., Jang Y., Dam V.T., Thor J , Jones J., Simpson N., Shu B., Emery S., Berman L., Nguyen H.T., Bryant J.E., Linstrom S., Klimov A., Donis R.O., Davis C.T., Nguyen T (2013), “Emergence of multiple clade 2.3.2.1 influenza A (H5N1) virus subgroups in Vietnam and detection of novel reassortants”, Virology 444, 12–20 23 De BK, Brownlee GG, Kendal AP and Shaw MW (1998), “Complete sequence of cDNA clone of the hemaglutinin gene of influenza A/Chicken/Scotland/59 (H5N1) virus: comparision with contermporary North American and European strains”, Nucleic Acids Res 16(9): 4181-4182 24 deWit E., Fouchier R.A (2008), “Emerging influenza”, Journal of clinical virology, 41(1), 1-6 25 Ducatez M F., Olinger C M., Owoade A A., Tarnagda Z., Tahita M C., Sow A., De Landtsheer S., Ammerlaan W., Ouedraogo J B., Osterhaus A D., Fouchier R A., Muller C P (2007), “Molecular and antigenic evolution and geographical spread of H5N1 highlypathogenic avian influenza viruses in western Africa”, The Journal of general virology, 88(8), 2297-2306 26 Gao W., Soloff A C., Lu X., Montecalvo A., Nguyen D C., Matsuoka Y., Robbins P D., Swayne D E., Donis R O., Katz J M., Barratt-Boyes S M., Gambotto A (2006), “Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization”, Journal of virology, 80(4), 1959-1964 27 Grauer D and Li W H (2000), “Fundamentals of molecular evolution (second edition”), Sinauer Associates, Inc Sunderland, MA, USA, 481 28 Hilleman M.R (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogensis, epidemiology and control”, Vaccine 20 (25-26), 3068-3087 29 Holsinger L J., Nichani D., Pinto L H and Lamb R.A (1994), “Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-function analysis”, Journal of virology, 68, 1551-1563 61 30 Horimoto T and Kawaoka Y (1995), “Direct reverse transcriptase PCR to determine virulence potential of influenza A viruses in birds”, J Clin Microbiol, 33(3), 748-751 31 Horimoto T and Kawaoka Y (2001), “Pandemic threat posed by avian influenza A viruses”, Clinical microbiology reviews, 14(1), 129-149 32 Ito T., Couceiro J.N., Kelm S., Baum L.G., Krauss S., Castrucci M.R., Donatelli I., Kida H., Paulson J.C., Webster R.G and Kawaoka Y (1998), “Molecular basis for the genration in pigs of influenza A viruses with pandemic potentiall”, J.Virol, 7367-7373 33 Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noornpanth S., Fouchier R A., Osterhaus A D., Payungporn S., Theamboonlers A., Poovorawan Y (2005), “Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand”, Acta virologica, 49(4), 277-280 34 Kumar S., Dudley J., Nei M and Tamura K (2008), “MEGA: A biologist centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences”, Briefings in Bioinformatics 9, 299-306 35 Ligon B L (2005), “Avian influenza virus H5N1 A review of its history and information regarding its potential to cause the next pandemic”, ElsevierSemin Pediatr infectious diseases, 16(4), 326-335 36 Luo G., Palese P (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Current opinion in genetics and development, 2(1), 77-81 37 Murphy B.R and Webster R.G (1996), “Orthomyxoviruses”, In Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M (eds.), Fields Virology 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1397-1445 38 Nicholas K.B and Nicholas H.B (1997), “Genedoc: a tool for editing and annotating multiple sequenca alignments”, Distributed by the author 39 OIE – World organisation for animal health (2005), “Avian influenza Manual of diagnostic test and vacxins for terrestrial animals”, Version adopted 40 Steinhaure D A (1999), “Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus”, Virology, 258(1), 1-20 62 41 Svedda M M., Lai C J (1981), “Functional expression in primate cells if cloned ADN coding for the hemagglutinin surface glycoprotein of influenza virus”, P NATL ACAD SCI USA, 78(9), 5488-5492 42 Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007), “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0”, Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599 43 Taubenberger J.K and Morens D.M (2009), “Pandemic influenza-including a risk assessment of H5N1”, Revue scientifique et technique, 28(1), 187-202 44 Wagner R., Maosovich M., Klenk H (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Reviews in medical virology,12(3), 159-166 45 Webster R.G (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis 4, 436441 46 WHO (2004), “Excutive Board 114th section Avian influenza and Human health”, EB 14/6 Repeat by the secretariat 47 Zhu Q., Yang H., Chen W., Cao W., Zhong G., Jiao P., Deng G., Yu K., Yang C., Bu Z., Kawaoka Y., Chen H (2008), “A naturally occurring deletion in its NS gene contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens”, Journal of virology, 82(1), 220-228 48 Zhao Z M., Shoridge K.F., Garcia M., Guan Y., Wan X F (2008), “Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses”, The Journal of general virology, 89 (Pt 9), 2182-2193 Tài liệu Internet 49 http://www.cucthuy.gov.vn/ 50 http://flu.lanl.gov/ 51 http://www.moh.gov.vn/ PHỤ LỤC So sánh trình tự nucleotide gen H5 chủng A-Ck-VN-KH23-2013 ADk-VN-KH24-2013 với chủng có liên quan ngân hàng gen Ghi chú: dấu (.) biểu thị giống với trình tự nucleotide tương ứng chuỗi gen A-Ck-VN-KH23-2013 (sự sai khác nucleotide chủng chữ ký hiệu chúng) Các vị trí đóng khung cho thấy sai khác lớn chủng Chủng nghiên cứu gạch chân * 20 * 40 * 60 * 80 * A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAACAATTAGCCTTGCCAAAAGCGATCATATTTGCATTGGTTATCATGCAAATAACTCGACAGAGCAGGTT : T C C .T A : TT C : C .TT : T : T T : T T : T T : T : C T : T C C .T : T : T : T C C .T : T C C .T : T : T C CC .T : T C C .T : T C CC .T : T C C .T : G CT C C .T A : G A.T C C A : G A.T A C .T A : T C .TT : T C .TT : .A A T.G.C .TT C .C C : AT C .TT : C T TT : C .TT : C .TT : .A T C .TT C C : - : T.G.C .TT C C : T.G.C .TT C C C : .A T.G.C A TT C C : .A T.G.C .TT C C : 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 100 * 120 * 140 * 160 * 180 GACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAAATGGAGTGAAG C A A .A A T G G T C C .T C G T .G T T G T T T G T .G T C G : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 103 192 192 192 192 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH : : 200 * 220 * 240 * 260 * CCTCTGATTTTAAAAGATTGTAGTGTAGCAGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCAGAATGGTCTTACATAGTA .T T .C : : 280 288 288 A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : T T TT .C .T T .C T T .C .T T .C T T .C T T .C T T .C T T .C T T .C T T .C .C .C G G G T .T G G G .T G G C G G G G G G A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi * 300 * 320 * 340 * 360 * : GAGAAGGCCAATCCAGCCAATGACCTCTGTTACCCAGGAAACTTCAACGATTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGGATAAACCATTTTGAG : A .G T G : T C : G T A : : : : : : : G G T : : : G T : G T : : G T : G T : G T : G G T : T : T : T : G .G T : G .G T .C : G T A G A C : C T : T T : G T : G T : G T A .A : C .G T : G T A : G T A : G T A .A : G T A .A A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 400 * 420 * 440 * 460 * AAAATACAGATCATCCCCAAAGATTCTTGGTCAGATCATGAAGCCTCATTGGGGGTGAGTGCAGCATGTCCATACCAGGGAAATTCCTCCTTCTTC C .T T C .T C .T .AA T C .T T A .C .T .C .T .C .T .C .T .C .T C C .T C : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 288 199 288 288 288 288 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 380 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 384 295 384 384 384 384 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 480 A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : .C .T C G G G .G T G C C .T A T A .G A A .G A G C C .T T C CT .A CT .T T C CT .T .G C C .T T .G C C T : : : : : : : : : : : : : : 480 480 480 480 480 480 480 480 480 391 480 480 480 480 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi * 500 * 520 * 540 * 560 : AGAAATGTGGTATGGCTTGTCAAAAAGGACAATGCATACCCAACAATAAAGAAAGGCTACAATAATACCAATCAAGAAGATCTCTTGGTAATGTGG : G A C.G A C : A A C : A C C : A .C : G A .C : G A .C : G A .C : A .C : A .C : G A C.G A C : A .C : A .C : G A C.G A C : G A C.G A C : G A .C : G A C.G A C : G A C.G T .A C : G A C.G A C : G A T C.G A C : G A T C.G A C : G A T C C.G A C : G A T C C.G A C : A A .A C : A A .A C : C T A CAG C A C : A .C : A .C : A C C : A C C : C T A .A .C : A C.G T : A A C.G C : A .G .A CA A C : A T A .A .C : A T A .A .C : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 576 487 576 576 576 576 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 580 * 600 * 620 * 640 * 660 GGGATTCACCATCCTAATGATGAGGCAGAGCAGACAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGA .C .G C T T G G T A C .G C T T T G T G .C .G C T T .C .G C T T C .G C T T .C .G C T T .C .G C T T .C .G C T T .C .G T T .C .G T T .C .G T T .G .G .G .G A C T GT G T G C.AC A G .G .C .G .G .C .G .T .C .A G .C .G C .C .G .C .G : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 672 583 672 672 672 672 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB : : : : 680 * 700 * 720 * 740 * TTGGTACCAAAAATAGCCACTAGGTCTAAAATAAATGGGCAAAGGGGCAGGATAGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCCAC .A C C T T C C C T T A C C T T : : : : 760 768 768 768 768 A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : C C T T A C C T T C C T T A C C T T C C T T C C T T A C C C T C C C T T C C T T A C C T T A C C C T C G .C C T T A C C T T C A C C T T C A C C T T C A C C C T C A C C T T C A C C T T C A C C T T C A .C C T T A .C C T T G T A C G C T A T C A C T C T T .C .- C C T T C C T T C C T T G T A C G C T A T A A C C T T T G T A C G C T A T C A G T A C G C T A T A G T A C G.T C T A T A.T G T A C G C T A T A : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 768 767 768 768 768 768 679 768 768 768 768 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 780 * 800 * 820 * 840 * TTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGAGACTCAACAATTATGAAAAGTGAAGTGGAATACGGT .G T G C C G .T .C T T T T T T T T G C C G .T T T G C C G .T G C C G T T T G C C G .T G C C G A T G C C G .T G C C G .T C C G .T C C G .T C C G .T T .T T .T G .T .C T .C T T T - A G .T C GG T T T T T : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 860 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 864 863 864 864 864 863 775 864 864 864 864 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 880 * 900 * 920 * 940 * AACTGCAACACCAGGTGTCAGACTCCGATAGGGGCGATAAACTCCAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGAGAATGTCCCAAA A G T T T G A .T C .C .C A .T .A A .T A .T A .T A .T A .T A .T A .T A .T : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 960 * A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : C .G G T T A A .G G T T A .T .G T C .G T T .G G T T .G T A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 980 * 1000 * 1020 * 1040 TATGTGAAATCAAACAAACTAGTCCTTGCAACTGGGCTCAGAAATAGTCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAGA -GGATTGTTTGGAGCTATA : T - C : .G - : G C .T - : C G - : .G - : .G - : .G - : .G - : .G - : T - C : .G - : .G - : T - C : T - C : .G G - : T - C : T - C : T - C : T - C : T - C : T C - C : T G - C : .G C - A : C G - A : T T G AGAGG C : .G .C - : .G AC - : .G .C G CGC C : .G G . - : T G .T A GG.A.AGG GC : T G - C : T G G A.AGA C : T G G A.AGA C : T G .T A G A.AGA C : T G .T G A.AGA C : A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi 1060 * 1080 * 1100 * 1120 * 1140 : GCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTACGGGTACCACCACAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCGGCAGACAAA : .T .T A T T : .T T : .T T G : .T : .T : .T : .T : .T : .T : .T A T T : .T : .T : .T T A T T : .T A T T : .T : .T T A T T : .T T A T T : .T T A T T : .T A T T : .T A T T : .T A T T : .G .T A T T : .T T .T : .T T .T : .C A T T T T : .T T : C T T : .T T : .T T : .T A T T : A T T T : .T GA T T : .T T T : .T T T : .T T T A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB : : : : : : 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 GAATCTACTCAAAAGGCAATAGACGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTAGGAAGGGAATTT G T T : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1245 1245 1245 1245 1245 1245 960 960 959 960 960 960 959 871 960 960 960 960 * 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1053 1056 1052 1053 1044 1053 1055 964 1056 1056 1056 1056 * 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1149 1152 1148 1149 1140 1149 1151 1060 1152 1152 1152 1152 A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : G T .C T G T T .G T T G .G T T .G T T .G T T .G T .C T C G T A T G G T T G G T T G C G T G A .A T G .A G G .C .T G A .A C .T .C .T A A C .T G A .A C .T G A .A : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1245 1248 1244 1245 1236 1245 1247 1156 1248 1248 1248 1248 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 1260 * 1280 * 1300 * 1320 * 1340 AATAACTTAGAGAGGAGAATAGAGAATTTGAACAAGAAGATGGAAGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATG .A A A A G .A .A A A A A A A A A A A A A G .A A A A A A G .A C A C C T .A C A .A .A A .C A .T C G A C G A G C : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1344 1340 1341 1332 1341 1343 1252 1344 1344 1344 1344 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 GAAAATGAGAGAACTCTAGACTTCCATGACTCAAATGTCAGGAACCTTTACGACAAGGTCAGACTACAGCTCAAGGATAATGCAAAAGAGCTGGGT G A T C T .A .T A T C T G T .A T C T .A G A T C T .A G A T C T .A G T A T C T .A G T A T C T .A G T A T C T .A G T .A T C T .A G A T C T .A G A T C T .A G A T C T .A .T G T G G A T.G C : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1437 1440 A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : T G .T .T .T A T.G AA T .T A T.G A T.G A T.G A T.G : : : : : : : : : : 1436 1437 1428 1437 1439 1348 1440 1440 1440 1440 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : * 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * AACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTAACAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAATATTCAGAAGAAGCA T G .G T .G T .G T .G T .G T .G T .G T A G T A G T G .G .T T .G .T T .G T G .G T T G .G T .G T G .G T G .G T G .G T G .G .T T G .G .T T G .G .T T G .G T .G T .G G.T .G C T .G C T .G G.T .G G.T .G G.T .G T .T C G.TG G G.T .G G.T .G G.T .G : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1533 1536 1532 1533 1524 1533 1535 1444 1536 1536 1536 1536 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620 * AGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATCTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGTA C G C G .C G C G C G C G C G C G C G C G C G G A G A .G .CT G CT .T A G G CT .T CT CT CT : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1629 1632 1628 1629 1620 1629 1631 1540 1632 1632 1632 1632 A-Ck-VN-KH A-Dk-VN-KH A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB : : : : : : : 1640 * 1660 * 1680 * 1700 CTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGTTCCAACGGTTCGTTACAGTGCAGAATTTGCATTTAA .G .G .G .G : : : : : : : 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Md-VN-LB A-Md-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-LB A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Ck-VN-OI A-Dk-VN-OI A-Dk-Bantu A-Dk-Slema A-Md-Tegal A-Dk-VN-QT A-Dk-VN-QT A-Md-VN-LB A-Dk-VN-Qu A-environm A-Hubei-1A-Hubei-1A-barn-swa A-HK-6841A-Dk-VN-27 A-GuangxiA-oriental A-feral-pi : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : A .G G G .G .G .G .G .G .G .G .G .G .G G A C .G .G .G .G G G A G .T G A G.T G A G G A G A : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1704 1707 1703 1704 1695 1704 1706 1586 1707 1707 1707 1707 ... TGGACAATTTTAAAACCGAATGACGCAATCCACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCGGAATATGCATATAAAATTGTCAAGAAGGGAGACTCCACAATC : W 630 P A- Dk-VN-KH24 : ACTACCTATATTTCCATTGGGACTTCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCCACTAGATCCAAAATAAACGGGCAAAGTGGCAGGATAGATTTCTTC... CATGAAGCCTCATTGGGGGTGAGCGCAGCATGTTCATACCAGGGAAATTCCTCCTTCTTCAGAAATGTGGTGTGGCTTATCAAAAAGGACAATGCATACCCAACA : H 315 L A- Dk-VN-KH24 : TGTTACCCAGGGAATTTCAACGATTATGAAGAATTGGAACACCTATTGAGCAGGATAAACCATTTTGAGAAAATACAGATCATCCCCAAAGATTCTTGGTCAGAT... CATGAAGCCTCATTGGGGGTGAGTGCAGCATGTCCATACCAGGGAAATTCCTCCTTCTTCAGAAATGTGGTATGGCTTGTCAAAAAGGACAATGCATACCCAACA : H 315 L A- Ck-VN-KH23 : TGTTACCCAGGAAACTTCAACGATTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGGATAAACCATTTTGAGAAAATACAGATCATCCCCAAAGATTCTTGGTCAGAT : C 210 D A- Ck-VN-KH23