Tuy nhiên, các chủng vi nấm khác nhau sử dụng các loại đường khác nhau trong đó các chủng nấm nhiễm trên cá tra không có khả năng sử dụng arabinose ngược lại các chủng A.. bisexua[r]
(1)Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nông nghiệp Phát triển nông thôn; ISSN 2588–1191 Tập 126, Số 3D, 2017, Tr 143–152; DOI: 10.26459/hueuni-jard.v126i3D.4105
* Liên hệ: dtmthy@ctu.edu.vn
Nhận bài: 13–03–2017; Hoàn thành phản biện: 24–07–2017; Ngày nhận đăng: 20–12–2017 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI NẤM Achlya bisexualis
NHIỄM TRÊN CÁ NUÔI THÂM CANH
Đặng Thụy Mai Thy*, Trần Thị Tuyết Hoa, Phạm Minh Đức
Trường Đại học Cần Thơ, Đường 3/2, P Xuân Khánh, Q Ninh Kiều, TP Cần Thơ, Việt Nam
Tóm tắt: Nghiên cứu thực nhằm xác định đặc điểm sinh học vi nấm Achlya bisexualis gây bệnh cá nuôi thâm canh Tổng cộng chủng Achlyabisexualis phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata) cá điêu hồng (Oreochromis sp.) Kết cho thấy A.bisexualis phát triển tốt khoảng nhiệt độ 28–33 °C Vi nấm phát triển nhanh pH 6–8 Các chủng phát triển độ mặn 2,0 % Vi nấm sử dụng glucose, maltose, mannose, sucrose arabinose A. bisexualis cho phản ứng với NO2 mM không phản ứng với NO2 43 mM
Từ khóa: Achlya bisexualis, cá điêu hồng, cá lóc, cá tra, sinh học, vi nấm
1 Đặt vấn đề
Vi nấm sinh vật nhân thực, sống dị dưỡng, khơng có diệp lục tố, hấp thụ chất dinh dưỡng qua vách tế bào cách tiết enzymes vào vật chủ sống hoại sinh, cộng sinh ký sinh động vật thực vật [5] Vi nấm nhiễm động vật thủy sản đa dạng thành phần loài, mức độ nhiễm khả gây thiệt hại khác Trong đó, nhóm vi nấm phổ biến gồm Saprolegnia sp., Achlya sp., Aphanomyces sp thường gây bệnh thủy sản [8,2] Hiện nay, đồng sông Cửu Long động vật thủy sản nhiễm vi nấm Achlya sp dần trở nên phổ biến gây thiệt hại cho người ni Khảo sát cá lóc nhiễm bệnh An Giang Đồng Tháp cho thấy giống Achlya sp chiếm 21,4 % nhiễm phổ biến cá lóc giai đoạn giống
Achlya bisexualis [18,19] Ngoài ra, nghiên cứu Nguyễn Thị Huyền (2006) cho thấy vi nấm
Achlya sp cịn có khả gây nhiễm trứng cá tra cá basa Theo Czeczuga cs (2013) vi nấm nhiễm trứng cá da trơn Châu Phi gồm loài Achlya sp., Aphanomyces sp.,
Leptolegnia sp Saprolegnia sp có khả sử dụng alanine, không sử dụng methionine, lysine, ornithine, leucine glycine [4] Tất lồi sử dụng glucose tinh bột, không cho phản ứng với arabinose salicin Kết thí nghiệm nấm S diclina A bisexualis ký sinh cá chép (C carpio) cho thấy nhiệt độ tối ưu loài vi nấm 25 °C 10–30 °C vi nấm phát triển [20] Tuy nhiên, nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011) cho thấy nhiệt độ 30–35 °C mức thích hợp cho vi nấm Achlya bisexualis
(2)Đặng Thị Mai Thy CS Tập 126, Số 3D, 2017
144
nghiên cứu thực nhằm cung cấp thông tin đặc điểm sinh học vi nấm Achlya bisexualis góp phần việc định danh phân loại vi nấm gây bệnh cá
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Chủng vi nấm
Các chủng vi nấm trữ Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Vi nấm phục hồi môi trường Glucose Yeast Agar – GYA (1 % glucose, 0,25 % yeast–extract, 1,5 % agar) ủ 28 °C Các chủng vi nấm phát triển sau ngày nuôi cấy sử dụng cho thí nghiệm (Bảng 1)
Bảng 1. Các chủng vi nấm Achlyabisexualis thí nghiệm
TT Chủng vi nấm Loài cá Cơ quan phân lập
1 PCT01.02 Cá tra Da PAG02.07 Cá tra Da TCT02.02 Cá điêu hồng Da TVL02.03 Cá điêu hồng Mang CĐT02.32 Cá lóc Da CCT01.09 Cá lóc Da
2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển vi nấm
Phương pháp thí nghiệm thực theo Koeypudsa cs (2005) Dùng ống cắt số (cork borer No 2) cắt khối agar với đường kính 5,5 mm rìa khuẩn lạc có nấm phát triển đặt vào đĩa petri chứa môi trường GYA Ủ đĩa cấy với mức nhiệt độ khác 23, 28, 33 38 °C, đo đường kính phát triển khuẩn lạc nấm sau 3–5 ngày Thí nghiệm thực với lần lặp lại
2.3 Ảnh hưởng pH đến khả phát triển vi nấm
(3)Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3D, 2017
145 chiếm < 20 % khối agar, (2) nấm phát triển có số lượng vừa chiếm 20–70 % khối agar (3) nấm phát triển có số lượng nhiều, dài chiếm > 70 % khối agar Trong trường hợp nấm khơng phát triển, mẫu agar dùng thí nghiệm rửa nước cất vô trùng cấy trở lại đĩa môi trường GYA để đánh giá khả sống sót nấm Thí nghiệm thực với lần lặp lại
2.4 Ảnh hưởng độ mặn đến khả phát triển vi nấm
Phương pháp thí nghiệm thực theo Koeypudsa cs (2005) Dùng ống cắt số cắt khối agar có nấm phát triển với đường kính khoảng 5,5 mm đặt khối agar vào đĩa petri có mơi trường GYA với nồng độ muối khác %; 0,5 %; %; 1,5 % % ủ nhiệt độ tối ưu chọn thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ Thí nghiệm thực với lần lặp lại đo đường kính khuẩn lạc nấm vòng 5–7 ngày 2.5 Khả sử dụng cacbohydrat vi nấm
Phương pháp thí nghiệm thực theo Kitancharoen Hatai (1998) Chuẩn bị môi trường gồm 8,4 mM NH4H2PO4; 2,7 mM KCl; 0,8 mM MgSO4.7H2O; 0,035 mM ZnSO4.7H2O
và 0,02 mM CuSO4.5H2O Bổ sung thêm bromcresol tím cho vào để làm chất thị với
nồng độ 50 mg/L môi trường tiệt trùng 121 °C 10 phút Cacbohydrat (glucose, sucrose, maltose, mannose arabinose) bổ sung vào môi trường với nồng độ % Cho mL môi trường vào ống nghiệm 10 mL cấy vi nấm vào Ủ mẫu 14 ngày đánh giá phát triển vi nấm sau: (+) vi nấm phát triển (–) vi nấm khơng phát triển Thí nghiệm thực với lần lặp lại
2.6 Khả sử dụng nitrit vi nấm
Phương pháp thí nghiệm thực theo Kitancharoen Hatai (1998) Chuẩn bị môi trường gồm 5,7 mM K2HPO4.3H2O; 0,3 % sucrose 1,2 % agar có bổ sung 43 mM NaNO2
và mM NaNO2 cho vào 10 mL dung dịch (0,6 M KCl; 0,2 M MgSO4.7H20; 3,6 mM FeSO4.7H2O)
Môi trường tiệt trùng 121 °C 10 phút Sau cấy vi nấm vào môi trường, mẫu ủ 3–5 ngày đo đường kính khuẩn lạc Thí nghiệm thực với lần lặp lại
2.7 Phương pháp xử lý số liệu
(4)Đặng Thị Mai Thy CS Tập 126, Số 3D, 2017
146
3 Kết thảo luận
3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis
Nhiệt độ đóng vai trị quan trọng ảnh hưởng đến q trình phát triển hình thành bào tử vi nấm Các chủng vi nấm thí nghiệm có khả phát triển nhiệt độ 23–38 °C Vi nấm phát triển tốt khoảng nhiệt độ 28–33 °C Ở 28 °C, vi nấm phát triển tối ưu đường kính trung bình khuẩn lạc A bisexualis 78,5 ± 4,6 mm sau ngày nuôi cấy môi trường GYA Các chủng A bisexualis phân lập loài cá phát triển 38 °C với đường kính khuẩn lạc 17,0 ± 3,9 mm Khi nhiệt độ giảm xuống mức 23 °C, A bisexualis phát triển tốt (Bảng 2) Khuẩn lạc vi nấm có màu trắng kem đồng nhất, phát triển tròn đều, sợi nấm dài, mọc nhô cao lên khỏi bề mặt môi trường Khuẩn lạc phát triển nhanh sau 24 h, đường kính trung bình khoảng 10–14 mm 28°C Đường kính khuẩn lạc chủng vi nấm mức nhiệt độ khác khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05)
Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển vi nấm A bisexualis
A bisexualis loài cá 23 °C 28 °C 33 °C 38 °C
Đường kính khuẩn lạc (mm) sau ngày Cá tra 68,2 ± 4,6aA 75,2 ± 5,4bA 73,4 ± 8,6cA 17,0 ± 2,6dA
Cá điêu hồng 71,2 ± 3,0aB 80,0 ± 3,5bB 76,4 ± 6,6cB 18,6 ± 5,3dB
Cá lóc 70,6 ± 2,0aAB 80,2 ± 2,4bAB 71,0 ± 2,3cAB 15,5 ± 2,5dAB
Ghi chú: Các chữ thường khác hàng chữ in hoa khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
(5)Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3D, 2017
147
Hình 1 Sự phát triển Achlyabisexualis mức nhiệt độ khác
Theo Madan Thind (1998), nhiệt độ tác động lớn đến trình sinh trưởng, sinh sản phát triển vi nấm Trong đó, chủng vi nấm có giá trị nhiệt độ khác liên quan đến giai đoạn vòng đời, thời gian nuôi cấy dinh dưỡng môi trường nuôi cấy Hệ enzyme ảnh hưởng đến trình phát triển nấm, nhiệt độ tăng làm enzyme bị biến tính hủy hoại nên vi nấm khơng phát triển sinh sản tạo bào tử Kết nghiên cứu tương tự báo cáo Nguyễn Thị Huyền (2006), nhiệt độ thích hợp cho nấm Achlya gây bệnh trứng cá tra cá basa 25–30 °C Các chủng A bisexualis phát triển khoảng 10–35 °C, phát triển tối ưu 25–30 °C không phát triển 40 °C [14,15]
3.2 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis
pH yếu tố ảnh hưởng đến trình phát triển vi nấm Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên phát triển chủng vi nấm môi trường GY lỏng sau ngày nuôi cấy cho thấy chủng A bisexualis phát triển tốt khoảng pH 6–8 không phát triển pH ≤ ≥ 11 pH ức chế phát triển vi nấm mức pH 4, 10 Ở mức pH có chủng A bisexualis cá tra, chủng cá điêu hồng chủng cá lóc phát triển sợi nấm mơi trường Ngồi ra, chủng A bisexualis có sợi nấm phát triển trung bình pH Ở mức pH 10, chủng A bisexualis cá điêu hồng bị ức chế (Bảng 3)
Bảng Ảnh hưởng pH đến phát triển vi nấm A bisexualis
A bisexualis loài cá pH
3 4 5 6 7 8 9 10 11
Cá tra 3 1 Cá điêu hồng 3 0 Cá lóc 3 1
(6)Đặng Thị Mai Thy CS Tập 126, Số 3D, 2017
148
Kết tương đồng với kết Madan Thind (1998) cho thấy vi nấm chịu đựng mơi trường có khoảng pH rộng sinh trưởng tối ưu pH mơi trường axít nhẹ Q trình phát triển nấm bị ngưng lại mơi trường axít (pH 3) kiềm (pH 8–9) Hơn nữa, môi trường axít màng tế bào vi nấm bị bão hịa, làm hạn chế trao đổi ion thiết yếu Các giống Saprolegnia, Aphanomyces Achlya phát triển khoảng pH tối ưu từ đến 10 [10] Ngoài ra, Achlya A bisexualis nhiễm cá rô phi Thái Lan sinh trưởng tốt động bào tử nảy mầm pH 4–11 nấm phát triển tối ưu khoảng pH 6–8 [16] A klebsiana nhiễm cá chép phát triển pH 6–7 [3] 3.3 Ảnh hưởng độ mặn đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis
Khảo sát ảnh hưởng độ mặn (NaCl) đến phát triển vi nấm ghi nhận độ mặn tăng A bisexualis phát triển giảm Các chủng nấm A bisexualis không phát triển độ mặn % A bisexualis sinh trưởng tốt đến độ mặn 0,5 % Ở nồng độ %, tăng trưởng chủng vi nấm giảm ½ so với nồng độ 0–0,5 % Độ mặn mức 1,5 % ức chế phát triển chủng A bisexualis (Bảng 4) Kết xử lý thống kê cho thấy khơng có khác biệt độ mặn 0–0,5 % khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) độ mặn 1–2 %
Bảng Ảnh hưởng độ mặn đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis
A bisexualis loài cá 0 % 0,5 % 1 % 1,5 % 2 %
Đường kính khuẩn lạc (mm) sau ngày
Cá tra 79,2 ± 1,5aA 78,6 ± 3,4aA 36,9 ± 3,1bA 18,4 ± 2,4cA –
Cá điêu hồng 80,3 ± 2,1aA 80,0 ± 2,3aA 39,1 ± 2,9bB 16,6 ± 3,4cB –
Cá lóc 77,9 ± 2,1aA 78,2 ± 2,4aA 38,7 ± 2,5bB 16,9 ± 3,5 cB –
Ghi chú: Các chữ thường khác hàng chữ in hoa khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Kết nghiên cứu tương đồng với kết Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011)
Achlya bisexualis và cho thấy nấm phát triển đến độ mặn % bị ức chế hoàn toàn độ mặn % Theo Abking cs (2008), trứng cá tra dầu (Pangasianodon gigas) nấm Achlya spp tăng trưởng tối ưu với nồng độ muối 1,5 % khơng thấy có phát triển nấm độ mặn %–2,5 % Trong đó, Fuangsawat cs (2011) cho nấm Achlya bisexualis có khả tồn đến nồng độ muối 2,5 % Hơn nữa, tăng nồng độ muối ảnh hưởng trực tiếp đến trình thẩm thấu sợi nấm Lúc này, NaCl hoạt động chất độc màng tế bào nấm gây ổn định màng hoạt động enzym, số lồi vi nấm phát triển tốt mơi trường có muối [6]
(7)Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3D, 2017
149 Cacbohydrat nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho q trình sinh trưởng vi nấm Thí nghiệm bổ sung nguồn cacbohydrat khác ghi nhận chủng A bisexualis
đều sử dụng sucrose, maltose manose trình phát triển Tuy nhiên, chủng vi nấm khác sử dụng loại đường khác chủng nấm nhiễm cá tra khơng có khả sử dụng arabinose ngược lại chủng A bisexualis nhiễm cá điêu hồng cá rơ phi có khả sử dụng arabinose Hai chủng nấm nhiễm cá điêu hồng có khả sử dụng maltose, sucrose, arabinose, mannose có chủng nấm có khả sử dụng (Bảng 5)
Bảng Khả sử dụng cacbohydrat Achlyabisexualis
A bisexualis loài cá Glucose Sucrose Maltose Mannose Arabinose
Cá tra + + + + –
Cá điêu hồng + + + + +
Cá lóc + + + + +
(+): vi nấm phát triển (–): vi nấm khơng phát triển
Kết thí nghiệm có tương đồng với kết Kitancharoen Hatai (1998) cho thấy tất chủng Achlya sp sử dụng 14/19 loại cacbohydrat glucose, maltose, mannose, sucrose lại không sử dụng arabinose Theo tác giả, glucose cacbohydrat mà tất giống nấm hấp thu được, arabinose, xylose sucrose khả đồng hóa giống vi nấm khác Một số cacbohydrat có khả gây độc cho vi nấm bổ sung vào môi trường cho thấy vi nấm khơng có khả phát triển Theo Czeczuga cs (2013), thí nghiệm nghiên cứu trứng cá da trơn Châu Phi ghi nhận thấy loài Achlya, Aphanomyces, Leptolegnia và Saprolegnia sử dụng glucose tinh bột, khơng đồng hóa arabinose salicin
3.5 Ảnh hưởng nitrit đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nitrit đến phát triển vi nấm ghi nhận chủng A bisexualis lồi cá phát triển mơi trường có bổ sung NO2 nồng độ
5 mM không phát triển nồng độ 43 mM Đường kính khuẩn lạc trung bình 2/3 chủng A bisexualis mơi trường có mM NO2 cao so với môi trường không bổ sung NO2
(Bảng 6)