Tìm hiểu khả năng phân giải cellulosecủa vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn của nhà máy fococev Thừa Thiên Huế

Diversity of cellulolytic microbes and the biodegradation of municipal solid waste by a potential strain.[r]

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSECỦA VI SINH VẬT

PHÂN LẬPTỪ CHẤT THẢI RẮNCỦA NHÀ MÁY FOCOCEV THỪA THIÊN HUẾ

Nguyễn Ngọc Trúc Ngân1*, Phạm Thị Ngọc Lan2 1

Khoa Môi trường, Trường ðại học Khoa học Huế 2

Khoa Sinh học, Trường ðại học Khoa học Huế *

Email: ms.trucngan@gmail.com TÓM TẮT

Chất thải rắn, ñặc biệt phần vỏ gỗ nhà máy sản xuất tinh bột sắn thường chứa lượng lớn cellulose ðây hợp chất hữu khó phân hủy, thời gian phân hủy dài chiếm diện tích mặt đáng kể Chính vậy, nghiên cứu hệ vi sinh vật phân giải cellulose khối ủ, nhưñánh giá khả phân hủy chúng tìm chủng có hoạt tính cellulase mạnh cần thiết để xử lý khối ủ, góp phần giảm thiểu nhiễm môi trường tạo phân hữu sinh học Kết nghiên cứu cho thấy: số lượng vi sinh vật có biến động lớn chênh lệch rõ nhóm, cao vi khuẩn (dao ñộng khoảng từ 56,02x106 ñến 343,23x106 CFU/g mẫu khơ), tiếp xạ

khuẩn (từ 5,63x106 ñến 96,24x106 CFU/g mẫu khô) nấm mốc chiếm số lượng thấp (từ 2,43x106 ñến 34,78x106 CFU/g mẫu khơ) Phân lập 112 chủng vi khuẩn, 92 chủng xạ khuẩn 55 chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose chọn ñược chủng PV41, PX90và PM39 có hoạt tính mạnh Trong mơi trường dịch thể với nguồn carbon CMC, nuôi cấy lắc xạ khuẩn, nấm mốc sau 120 vi khuẩn sau 60 cho hoạt tính cellulase sinh khối cao

Từ khóa: nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn, cellulose, hoạt tính cellulase

1 MỞðẦU

Trong năm trở lại ñây, hoạt ñộng nhà máy sản xuất tinh bột sắn

Thừa Thiên Huế ngày phát triển mạnh mẽ Nhà máy ñã tiêu thụ lượng lớn sắn nguyên liệu, ñồng thời ñã tạo việc làm cho nhiều nông dân Mặc dù vậy, chất thải nhà máy theo tăng lên đáng kể nên vấn ñềñặt cần phải giải triệt ñể

những chất thải nhằm bảo vệ môi trường sinh thái cho vùng phụ cận Hiện nay, nhà máy ñã ñầu tư xây dựng hệ thống xử lý chất thải lỏng thu hồi biogas nên phần giải nhiễm nước thải gây Tuy nhiên, xử lý chất thải rắn chưa ñược quan tâm nhiều Vỏ gỗ sắn sau bóc chất thành đống

địa có khả phân giải cellulose khối ủ, ñánh giá khả phân hủy chúng, tìm chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase mạnh cần thiết để

giải vấn đề nhiễm mơi trường nguồn thải gây [1], ñồng thời chuyển phế phẩm thành sản phẩm có lợi phân hữu sinh học

2 ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn, xạ khuẩn nấm mốc có khả phân giải cellulose phân lập từ bã thải vỏ sắn nhà máy tinh bột sắn Thừa Thiên Huế

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phân lập xác ñịnh số lượng tế bào[2]: sử dụng phương pháp Koch ñể phân lập ñếm số lượng xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc phân giải cellulose môi trường Gauses I, Vinogradski Czapek với nguồn carbon CMC (Carboxymethyl Cellulose)

- Xác ñịnh khả phân giải cellulose vi sinh vật [2]:

Nguyên tắc chung: Trên môi trường chứa CMC, vi sinh vật tiết cellulase ngoại bào phân hủy chất để sinh trưởng làm cho mơi trường nhuộm thuốc thử Lugol ðộ lớn khoảng môi trường suốt vệt cấy phản ánh khả sinh trưởng phát triển phân giải CMC vi sinh vật

- Xác định hoạt tính cellulase phương pháp khuếch tán thạch[2]: Nguyên tắc: cellulase tác động lên chất CMC mơi trường thạch CMC bị phân hủy làmđộ đục mơi trường bị giảm trở nên suốt nhuộm Lugol ðộ lớn vòng phân giải phản ánh hoạt tính enzyme

Phương pháp tiến hành: Các ống thạch nghiêng chứa giống chuyển vào mơi trường dịch thể Tiến hành ni cấy lắc120 vịng/phút thời gian ngày

nhiệt độ phịng thu dịch chiết enzyme Thử hoạt tính cellulase đĩa thạch – CMC biểu diễn hoạt tính đường kính (mm)vịng thủy phân cellulose

- Xác định thời gian tối ưu cho trình sinh tổng hợp cellulase tích lũy sinh khối vi sinh vật [2]: các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc ñược nuôi môi trường Gauses I, Vinogradski Czapek dịch thể ñể thu dịch enzyme sinh khối Xác định hoạt tính cellulase phương pháp khuếch tán thạch xác định sinh khối khơ theo phương pháp cân

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập xác định số lượng tế bào

Chúng tơi ñã tiến hành ñợt thu mẫu ñống vỏ sắn khác nhà máy tinh bột sắn Thừa Thiên Huế Từ 11 mẫu vỏ thải thu ñược, tiến hành phân lập ba môi trường Gauses I, Vinogradski Czapek thạch ñĩa thu ñược 92 chủng xạ khuẩn, 112 chủng vi khuẩn 55 chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose Số lượng vi sinh vật có khả phân giải cellulose mẫu vỏ sắn trình bày bảng

Bảng 1 Số lượng vi sinh vật phân giải cellulose mẫu vỏ sắn phân lập STT Ký hiệu mẫu pH mẫu CFU/g mẫu khô(x106)

Nấm mốc Vi khuẩn Xạ khuẩn

1 A1 4,52 9,45 128,18 88,35

2 A2 5,11 21,56 111,34 35,68

3 A3 5,86 14,78 56,02 53,43

4 A4 4,11 7,90 167,57 24,79

5 A5 5,52 11,32 188,72 96,24

6 A6 5,63 34,78 156,91 46,69

7 A7 5,41 2,43 101,03 68,95

8 A8 4,34 3,61 132,79 11,34

9 A9 4,08 18,69 230,47 29,67

10 A10 5,71 20,05 343,23 76,56

11 A11 4,01 27,45 208,55 5,63

(Ghi chú: CFU: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

Số lượng vi sinh vật bã thải vỏ sắn cao có chênh lệch rõ nhóm xạ khuẩn, vi khuẩn nấm mốc Số lượng vi khuẩn có khả phân giải cellulose mẫu cao nhất, dao ñộng khoảng từ 56,02x106 đến 343,23x106 CFU/g mẫu khơ Trong đó, số lượng nấm mốc lại thấp (dao ñộng khoảng từ 2,43x106 đến 34,78x106 CFU/g mẫu khơ) pH mẫu phù hợp cho sinh trưởng phát triển nấm mốc nói chung ðiều vỏ sắn

ñược chất thành ñống lớn nên tạo vùng kỵ khí hạn chế phát triển nấm mốc Kết so với mẫu khác mùn rác, mẫu nước,… số lượng vi sinh vật ởñây thấp nhiều [3], [4], [5]

3.2.Khả phân giải cellulose chủng vi sinh vật

3.2.1.Khả năng phân giải cellulose của chủng nấm mốc phân lập

ðể ñánh giá khả phân giải cellulose chủng nấm mốc phân lập

enzyme sinh khối nhằm ñánh giá khả sinh trưởng, phát triển hoạt tính cellulase.Kết quảđược trình bày bảng 2, hình hình

Hoạt tính cellulase chủng nấm mốc chênh lệch ít, thể ởđường kính vịng phân giải dịch chiết enzyme chủng PM39 PM41 28,5mm

và 27mm Chủng PM39 vừa có hoạt lực mạnh vừa tích lũy sinh khối cao (2,89

mg/ml) nên chúng tơi chọn chủng cho thí nghiệm

Bảng 2 Kích thước vịng phân giải sinh khối khô chủng nấm mốc

Chủng nấm mốc ðường kính vịng phân giải (mm) Sinh khối khô (mg/ml)

PM39 28,50 ± 0,33 2,89 ± 0,03

PM41 27,00 ± 0,00 2,52 ± 0,01

Hình 1. Vạch phân giải cellulose khuẩn lạc chủng nấm mốc

Hình 2. Vòng phân giải CMC dịch enzyme từ chủng nấm mốc PM39 (phải)và PM41 (trái) 3.2.2.Khả năng phân giải cellulose của chủng xạ khuẩn phân lập

Tương tự bước ñánh giá khả phân giải chủng nấm mốc,

đối với chủng xạ khuẩn, chúng tơi tiến hành cấy vạch mơi trường Gause I thạch

đĩa với nguồn carbon CMC Sau đo kích thước khuẩn lạc vạch phân giải, kết thu ñược sau: mức ñộ phân giải cellulose chủng xạ khuẩn ñồng

ñều từ yếu ñến mạnh (lần lượt 41,3%, 31,52% 21,74%),trong tỷ lệ chủng có khả phân giải mạnh chiếm 5,44% tổng số 92 chủng phân lập ñược Từ

92 chủng này, chủng PX16 PX90 ñược chọn để ni cấy dịch thể, thu dịch chiết

enzyme sinh khối nhằm ñánh giá khả sinh trưởng, phát triển hoạt tính cellulase Kết quảđược trình bày bảng 3, hình hình

Hai chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase chênh lệch nhau, chủng PX90 vừa thể hoạt tínhmạnh ni cấy dịch thể vừa tích lũy sinh khối

nhiều chủng PX16 nên ñược chọn cho nghiên cứu

Bảng 3 Kích thước vịng phân giải sinh khối khơ chủng xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn ðường kính vịng phân giải (mm) Sinh khối khơ (mg/ml)

PX19 21,00 ± 0,33 1,91 ± 0,01

Hình 3. Vạch phân giải cellulose khuẩn lạc chủng xạ khuẩn

Hình 4. Vịng phân giải CMC dịchenzyme tách từ chủng xạ khuẩnPX16 (trái) PX90 (phải) 3.2.3. Khả năng phân giải cellulose của chủng vi khuẩn phân lập

Các chủng vi khuẩn ñược cấy vạch mơi trườngVinogradski thạch đĩa với nguồn carbon CMC Kết thu ñược cho thấy mức ñộ phân giải cellulose khác

ở chủng vi khuẩn phân lập Trong số 112 chủng vi khuẩn phân lập được, chủng có hoạt tính yếu chiếm tỷ lệ cao với 76,79% Số chủng có mức độ phân giải từ trung bình đến mạnh chiếm số lượng ít, số chủng trung bình chiếm 13,39%, số chủng có hoạt tính mạnh chiếm 7,14% số chủng có hoạt tính mạnh tìm thấy với tỷ lệ 2,68% Từ kết nghiên cứu trên, chúng tơi chọn hai chủng có hoạt tính mạnh để tiến hành ni cấy dịch thể, thu dịch chiết enzyme sinh khối PV41 PV69 Kết quảđược trình bày bảng 4, hình hình

Khả phân giải cellulose hai chủng vi khuẩn ñồng ñều

tích lũy sinh khối thể mạnh chủng có khả phân giải cao nên ta chọn chủng PV41 (với đường kính vịng phân giải 24,5mm sinh khối khơ đạt

4,72 mg/ml) để tiến hành nghiên cứu

Bảng 4. Kích thước vịng phân giải sinh khối khơ chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn ðường kính vịng phân giải (mm) Sinh khối khơ (mg/ml)

PV41 24,50 ± 0,67 4,72 ± 0,01

3.3. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy ñến trình sinh tổng hợp cellulase

tích lũy sinh khối vi sinh vật

ðể thăm dị ảnh hưởng thời gian ni cấy ñến hoạt tính cellulase

khả tích lũy sinh khối, tiến hành nuôi cấy lắc (120 vịng/ phút)các chủng vi sinh vật mơi trường dịch thể(Czapek, Vinogradski, Gause I) với khoảng thời gian khác

Bảng 5.Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase và tích lũy sinh khối vi sinh vật

Chủng

vi sinh vật Thời gian (giờ) vòng phân giải (mm) ðường kính Sinh khối khơ (mg/ml)

PM39

24 15,00 ± 0,00 1,78 ± 0,01

48 19,50 ± 0,67 2,03 ± 0,01

72 22,00 ± 0,00 2,45 ± 0,01

96 28,00 ± 0,67 2,77 ± 0,01

120 31,50 ± 0,33 2,73 ± 0,01

144 30,00 ± 0,00 2,54 ± 0,01

PV41

24 8,50 ± 0,00 2,47 ± 0,01

36 18,50 ± 0,67 3,94 ± 0,01

48 24,00 ± 0,00 4,85 ± 0,03

60 31,50 ± 0,00 4,64 ± 0,01

72 22,50 ± 0,33 3,74 ± 0,01

96 14,50 ± 0,00 2,20 ± 0,01

PX90

24 7,50 ± 0,33 1,56 ± 0,01

48 13,00 ± 0,67 1,87 ± 0,03

72 16,00 ± 0,67 2,30 ± 0,03

96 23,50 ± 0,00 2,75 ± 0,01

120 26,50 ± 0,67 2,73 ± 0,01

144 15,00 ± 0,33 2,66 ± 0,01

Hình 7. Vịng phân giải CMC chủng PV41(trái), PM39 (giữa) PX90 (phải) sau 60 (vi khuẩn) 120 (xạ khuẩn nấm mốc) nuôi cấy

Qua kết cho thấy hoạt tính cellulase tích lũy sinh khối hai chủng nấm mốc PM39và xạ khuẩn PX90 biến thiên khoảng thời gian nuôi cấy rộng

(144 giờ) ñạt cực ñại thời ñiểm 120 với sinh khối đạt 2,7 mg/ml

đường kính vịng phân giải 31,5mm 26,5 mm Trong chủng vi khuẩn PV41đạt cực đại sau 60 ni cấy với đường kính vịng phân giải ñạt 31,5

ñược, chủng vi khuẩn PV41 có thời gian ni cấy ngắn nhất, thể hoạt tính cellulase

mạnh khả tích lũy sinh khối cao nên chủng có nhiều ưu

điểm vượt trội (bảng hình 7)

4 KẾT LUẬN

1 Số lượng vi sinh vật chất thải vỏ sắn Nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế cao có biến động lớn theo thời gian: nấm mốc: 2,43x106- 34,78x106CFU/g mẫu khô, vi khuẩn: 56,02x106- 343,23x106 CFU/g mẫu khô xạ

khuẩn: 5,63x106 - 96,24x106 CFU/g mẫu khô

2 đánh giá khả phân giải cellulose 259 chủng vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn, ựó chủng có hoạt tắnh mạnh chiếm tỷ lệ 5,4 Ờ 20%

3 Thời gian nuôi cấy tối ưu cho q trình tích lũy sinh khối sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc PM39và xạ khuẩn PX90 120 giờ, chủng vi khuẩn

PV41 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Gautam SP, Bundela PS, Pandey AK, Jamaluddin, Awasthi MK, Sarsaiya S (2012) Diversity of cellulolytic microbes and the biodegradation of municipal solid waste by a potential strain.Int J Microbiol., article ID 325907

[2] Phạm Thị Ngọc Lan (2012) Giáo trình thực tập vi sinh vật học Nhà xuất ðại học Huế

[3] Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn số

giống xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác. Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 177 – 182

[4] ðặng Minh Hằng(1999) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ñến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật ñể xử lý rác Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 333 – 339