The transformation efficiency of the lipofection method was 4 - 15 times better in comparison with the electroporation method, dependently on applied vetors (such as close or open vec[r]
(1)70
29(1): 70-75 T¹p chÝ Sinh học 3-2007
ứng dụng phơng pháp thể mỡ Để chuyển nạp gien vào tế bào
của loài vi tảo lam Spirulina platensis
Ngô Hoài Thu, Đặng DiƠm Hång ViƯn C«ng nghƯ sinh häc Sei-ichi Aiba, Yoshikazu Kawata
Viện nghiên cứu Khoa học Công nghệ tiên tiến, Osaka, Nhật Bản Spirulina platensis là loài vi
to lam cú tính th−ơng mại cao Hàng năm, sản l−ợng ni trồng thu hoạch loài vi tảo lam tồn giới đạt khoảng 3000 tấn/năm Việc phân tích thành phần dinh d−ỡng S platensis cho thấy hàm l−ợng protein chiếm khoảng 50-70%, lipit chiếm 16%, hydratcacbon chiếm khoảng 15% trọng l−ợng khô tế bào [2] S platensis cịn nguồn cung cấp vitamin, chủ yếu vitamin B [1] Vì thế, S platensis đD đ−ợc dùng làm thực phẩm chức cho ng−ời động vật Ngồi ra, S platensis cịn đ−ợc dùng để cung cấp số hợp chất có hoạt tính sinh học nh− phycoxianin, axit béo khơng bDo hòa cần thiết cho thể nh− axit linolenic (C18:2) axit γ-linolenic (axit 6, 9, 12-octadecatrienoic-C18:3) Với tiềm ứng dụng nh− việc mở rộng khả ứng dụng S platensis trong lĩnh vực nh− xử lý môi tr−ờng, cung cấp hoạt chất sinh học có giá trị nh− axit γ-linolenic hay chất dẻo sinh học (bioplastic) điều khả thi Hiện nay, kỹ thuật ADN tái tổ hợp ph−ơng pháp việc nâng cao khả tổng hợp chất có hoạt tính sinh học Để chuyển nạp gien vào tế bào S platensis, ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp biến nạp xung điện, nhiên ph−ơng pháp nhiều hạn chế nh− gây độc cho tế bào, khả sinh sản tế bào sau thấp màng tế bào bị tổn th−ơng, không thuận tiện hiệu [8, 9]
Hiện nay, có số ph−ơng pháp chuyển nạp đD đ−ợc áp dụng rộng rDi nh−: DEAE dextran, phốtphát canxi, vi tiêm, xung điện, lipofection-liposome hay thể mỡ… Trong đó,
chuyển nạp xung điện [3] thể mỡ cho hiệu cao Ph−ơng pháp thể mỡ đD đ−ợc sử dụng rộng rDi cho chuyển nạp; nh−ng đ−ợc áp dụng chủ yếu cho tế bào động vật, tế bào trần Ph−ơng pháp cho hiệu an toàn so với ph−ơng pháp biến nạp truyền thống- ph−ơng pháp xung điện [5] Trong ph−ơng pháp thể mỡ, có sử dụng DOTAP (N-[ 1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-mêtylsunphát trimêtylammonium) thể mỡ đ−ợc gắn bề mặt plasmit, tích điện âm nên chúng có vai trị hỗ trợ cho việc vận chuyển plasmit vào tế bào thông qua lỗ bề mặt màng tế bào Chính vậy, ảnh h−ởng đến cấu trúc màng tế bào
(2)Trong báo này, chúng tơi trình bày kết b−ớc đầu ứng dụng ph−ơng pháp thể mỡ để chuyển nạp gien vào tế bào S platensis, đồng thời so sánh với ph−ơng pháp chuyển nạp truyền thống xung điện thơng qua hiệu suất chuyển nạp
I Ph−¬ng pháp nghiên cứu 1. Vt liu
- Véctơ pHSG397 hDng TaKaRa (Nhật Bản) cung cấp, có chứa gien thị cat, kháng chất kháng sinh chloramphenicol (Cm) Véctơ pHSG397 đợc cắt mở vòng nhờ enzim cắt giới hạn EcoRI, có ký hiệu pHSG397/EcoRI
- Hai chủng vi tảo lam Spirulina platensis C1 Vin Bảo tồn giống Pasteur cung cp S platensis VN1 phòng Công ngh to, Vin Công ngh sinh hc cung cp
- Hoá cht dïng cho viƯc biến nạp phương ph¸p thĨ mì hDng Roche cung cấp DOTAP (N-[1-(2, 3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-mêtylsunphát trimêtylammonium) thể mỡ (Roche, Basel, Switzerland 1,0 àg/àl)
- Cặp mồi nhân gien cat với kích thớc tơng ứng khoảng 700 bp, có trình tự nucleotit nh− sau:
CT-a: accaccttgatatatccca CT-2b: tgttccacgactacggcgac 2. Phương ph¸p
a Tạo tế bào Spirulina platensis khả biến theo ph−ơng pháp Toyomizu M cs [8] Tế bào S platensis ủược nuôi lắc môi trường SOT (150 vòng/phút), nhiệt ủộ 28-30oC, với ánh sáng 1500 lux, cho ủến OD600 ủạt 0,5-0,8 Vì S platensis lồi tảo lam đa bào, có dạng sợi màng tế bào khơng có xenluloza, nên để thu đ−ợc dịch đồng thể tế bào một, đD sử dụng máy cắt sợi tảo thành phần nhỏ tế bào (US-300, Nippon Seki Co., Tokyo, Japan, điều kiện 50W 30 giây) Ly tâm 6000 v/p 10 phút để thu sinh khối tế bào Sau đó, tế bào tảo đ−ợc hồ tan trở lại 10 ml mơi tr−ờng SOT, đ−ợc nuôi tĩnh khoảng thời gian 12 giờ, nhiệt độ phòng (28o-30oC) với ánh sáng yếu Sau đó, lại ly tâm 8000 v/p phút,
4oC để thu sinh khối tảo Rửa tế bào thu đ−ợc lần n−ớc cất vơ trùng Cuối cùng, hồ tan tế bào tảo ml dung dịch HEPES (1 mM, pH = 7) cho mật độ tế bào đạt khoảng 3,75 ì 108 đến ì 108 tế bào/ml [9] Dịch tế bào khả biến đ−ợc giữ đá sử dụng (trong vòng 24 giờ)
Phản ứng nối ghép gen: trộn àl véctơ pHSG397 véctơ pHSG397/EcoRI (200 ng/àl) àl DOTAP (1 àg/àl) với nhau, theo tỉ lệ hàm l−ợng ADN 1: Sau đó, phản ứng đ−ợc ủ 25oC phút
b BiÕn nạp gien vào tế bào S platensis phơng ph¸p thĨ mì
Bổ sung àg vectơ vào 50 àl tế bào S platensis khả biến, đặt đá khoảng phút Sau bổ sung ml môi tr−ờng SOT, nuôi dịch 25oC giờ, không lắc Các tế bào S platensis tái tổ hợp đ−ợc sàng lọc môi tr−ờng rắn lỏng có bổ sung chất kháng sinh Cm nồng độ t−ơng ứng là: 0, 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 10 àg/ml Sau tuần nuôi cấy, thể S platensis tái tổ hợp quan sát thu nhận đ−ợc
c Biến nạp gien vào tế bào S platensis phơng pháp xung điện
B sung àg véctơ pHSG397 véctơ pHSG397/EcoRI (200ng/ml) vào 50 àl tế bào S platensis khả biến Giữ dịch đá khoảng 5-10 phút, sau chuyển dịch vào cuvét đD đ−ợc giữ lạnh (có khoảng cách điện cực mm) Biến nạp xung điện điều kiện 200 Ω, 25 àF, kV/cm thời gian từ 4-5 mini giây Sau biến nạp, dịch S platensis tái tổ hợp đ−ợc giữ đá phút bổ sung ml môi tr−ờng SOT Tiếp tục nuôi dịch điều kiện 25oC Sau đó, cấy trải dịch thu đ−ợc môi tr−ờng rắn nuôi môi tr−ờng lỏng có bổ sung Cm với nồng độ t−ơng ứng từ 0-10 àg/ml
(3)72
trị OD600 Tiếp theo, nồng độ SDS t−ơng ứng đ−ợc dùng để bổ sung vào môi tr−ờng rắn (1,2% thạch) tiếp tục nuôi cấy 10-15 ngày
Trong báo này, đD sử dụng phơng pháp biến nạp nêu với chủng tảo lam S platensis C1 VN1 Hiệu
chuyển nạp ph−ơng pháp đ−ợc đánh giá thông qua hiệu suất chuyển nạp nồng độ chất kháng sinh Cm cao mà tế bào S platensis tái tổ hợp sống sót nhiều Các cơng thức thí nghiệm đ−ợc sử dụng báo đ−ợc bảng
Bảng Các công thức thí nghiệm đợc sử dụng báo
Ký hiệu
mÉu Tªn mÉu S platensis pHSG397
pHSG397/ EcoR I
DOTAP thể mỡ
1 ĐC âm +
2 §C ©m + +
3 §C ©m + +
4 MÉu thư nghiƯm + + +
5 MÉu thư nghiƯm + + +
Ghi chú: ĐC i chng
II Kết thảo luận
1. Sng lc tế bào S platensis tái t hp
trên môi trng lng
S platensis có cấu tạo dạng sợi, xoắn có khả di chuyển môi tr−ờng lỏng nh− mơi tr−ờng rắn Vì vậy, chuyển gien vào S platensis, chúng tơi đD gặp khó khăn cần xác định dòng mang gien tái tổ hợp Do đó, tr−ớc chuyển gien vào S platensis, chúng tơi cần phải sàng lọc đ−ợc chủng có khả tạo dịng khơng chuyển động bề mặt thạch nhờ sử dụng SDS SDS chất tẩy rửa, có vai trò phá vỡ màng tế bào; song, nồng độ định, chúng lại có vai trị ngăn cản chuyển động tế bào S platensis Để kiểm tra khả sống sót hai chủng C1 VN1 nồng độ SDS khác nhau, dải nồng độ từ 0,001% đến 1% đD đ−ợc sử dụng Kết thu đ−ợc cho thấy, S platensis có khả sống sót cao nồng độ SDS 0,002% (kết không đây) nồng độ này, có chủng S platensis C1 có khả tạo đ−ợc dịng cố định bề mặt thạch, sau 10-15 ngày nuôi cấy
2. Chun n¹p gien ë S platensis
Với mô hình thí nghiệm nh đD nêu trên, đD tiến hành biến nạp véctơ pHSG397
và pHSG397 đD đ−ợc mở vòng EcoRI (pHSG397/EcoRI) vào tế bào hai chủng S platensis C1 VN1 theo ph−ơng pháp thể mỡ Kết sau tháng chuyển nạp, nhận thấy mẫu đối chứng âm, tế bào S platensis tái tổ hợp khơng có khả sống sót mơi tr−ờng có bổ sung Cm Điều chứng tỏ tế bào S platensis không chứa gien kháng Cm vectơ pHSG397 đD khơng đ−ợc chuyển vào tế bào S platensis khơng có hỗ trợ DOTAP thể mỡ Đối với mẫu thử nghiệm (bảng 1), tế bào S platensis C1 VN1 tái tổ hợp có khả sống sót đ−ợc mơi tr−ờng SOT có bổ sung Cm với nồng độ từ 0,1 đến 0,5 àg/ml từ 0,1 đến 1,0 àg/ml, t−ơng ứng Kết đD cho thấy vectơ pHSG397 đD đ−ợc chuyển nạp vào tế bào S platensis với hỗ trợ DOTAP thể mỡ Kết thu đ−ợc đ−ợc hình
(4)đ−ợc dòng cố định bề mặt thạch Do vậy, việc xác định dịng tế bào có mang gien tái tổ hợp khó khăn Kết thu đ−ợc đ−ợc hình 2, cho thấy nồng độ
0,5àg/ml Cm, sau tháng chuyển nạp, đĩa petri thứ thứ bề mặt đĩa có xuất dịng S platensis tái tổ hợp cố định có màu xanh
Hình 1. Tế bào S platensis C1 S platensis VN1 tái tổ hợp sau tháng chuyển nạp nồng độ Cm khác
1 tÕ bµo Spirulina platensis ĐC âm tế bào S platensis + DOTAP thể mỡ ĐC âm tế bào S platensis + véctơ pHSG397 ĐC âm
4 tế bào S platensis + vÐct¬ pHSG397 + DOTAP thĨ mì MÉu thư nghiệm tế bào S platensis + véctơ pHSG397/EcoRI +DOTAP thĨ mì MÉu thư nghiƯm
1 ĐC âm ĐC âm ĐC âm Mẫu thử nghiệm Mẫu thử nghiệm Hình 2. Tế bào chủng S platensis C1 tái tổ hợp tạo dòng cố định bề mặt thạch
với nồng độ 0,5 àg/ml Cm sau tháng chuyển nạp Để khẳng định cách xác
véctơ pHSG397 đD đ−ợc chuyển nạp vào tế bào S platensis hay không, chúng tơi đD tiến hành phân tích mức độ ADN dòng tái tổ hợp thu đ−ợc hình Vì cấu trúc véctơ pHSG397 có chứa gien thị - cat, có vai trị kháng Cm nên chúng tơi đD kiểm tra có mặt véctơ tế bào S platensis tái tổ hợp nhờ vào có mặt gien cat Kết quả, với cặp mồi CT-a CT-2b, đD khuyếch đại đ−ợc gien cat vectơ pHSG397
tế bào S platensis tái tổ hợp với kích thớc gien khoảng 700 bp (hình 3)
Kết hình cho thấy, công thức đối chứng âm (các giếng 1, 3) đD khơng thu đ−ợc băng có kích th−ớc 700 bp Trong băng đD thu đ−ợc công thức mẫu thử nghiệm (các giếng 5) Điều đD góp phần khẳng định vectơ pHSG397 đD đ−ợc chuyển nạp vào tế bào S platensis với hỗ trợ DOTAP thể mỡ
Cm (µg/ml) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0
S platensis C1
1 Cm
(µg/ml) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0
(5)74
Hình 3. Kết phân tích gien cat tế bào vi tảo lam tái tổ hợp
Ghi chú: giếng M. Chỉ thị phân tö Kb Plus DNA Ladder; giÕng C+. gien cat vectơ pHSG397; các giếng 1, 2, 3, 4, 5. gien cat tế bào S platensis tái tổ hợp sau tháng chuyển nạp tơng ứng với công thức thí nghiệm bảng
Khi so sánh hiệu suất chuyển nạp hai phơng pháp thể mỡ xung điện, nhận thấy phơng pháp thể mỡ có hiệu
chuyn np cao gấp lần so với ph−ơng pháp xung điện thông th−ờng véctơ pHSG397 không đ−ợc cắt mở vòng (3,00.103/7,45.102) Còn véctơ đ−ợc cắt mở vịng EcoRI hiệu suất chuyển nạp ph−ơng pháp thể mỡ so với ph−ơng pháp xung điện 15 lần (4,50.104/ 2,98.103) Kết hiệu suất chuyển nạp đ−ợc bảng Ngoài ra, bảng 2, cho thấy véctơ pHSG397 đ−ợc mở vịng enzim EcoRI hiệu suất chuyển nạp đạt đ−ợc cao so với véctơ loại nh−ng khơng đ−ợc mở vịng 15 lần (4,50.104/3,00.103) sử dụng ph−ơng pháp thể mỡ Nh− vậy, so với ph−ơng pháp chuyển nạp xung điện hiệu suất chuyển nạp ph−ơng pháp thể mỡ đạt cao gấp từ đến 15 lần t−ơng ứng véctơ chuyển nạp không đ−ợc mở vòng mở vòng Kết đD cho thấy khả ứng dụng ph−ơng pháp thể mỡ việc chuyển nạp gen vào tế bào S platensis cách có hiệu so với ph−ơng pháp truyền thống - ph−ơng pháp xung điện
Bảng So sánh hiệu suất chuyển nạp phơng pháp thể mỡ phơng pháp xung điện
Plasmit Phơng pháp Hiệu suất chuyển nạp (Số khuẩn lạc)/ààààg DNA
Thể mỡ 3,00 103
Véctơ pHSG397
Xung điện 7,45 102
ThĨ mì 4,50 104
VÐct¬ pHSG397/EcoRI
Xung ®iƯn 2,98 103
III KÕt ln
1 ĐD chuyển nạp thành công véctơ pHSG397 vào tế bµo cđa chđng S platensis C1 vµ chđng S platensis VN1 phơng pháp thể mỡ
2 Hiu suất chuyển nạp ph−ơng pháp thể mỡ cao gấp đến 15 lần so với ph−ơng pháp chuyển nạp xung điện t−ơng ứng véctơ chuyển nạp không đ−ợc mở vòng mở vòng
Các kết thu đ−ợc báo cho thấy khả áp dụng có hiệu ph−ơng pháp chuyển nạp thể mỡ so với ph−ơng pháp xung điện theo định h−ớng sử dụng kỹ thuật ADN
tái tổ hợp để tạo chủng S platensis tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp số chất có hoạt tính sinh học cao nh− axit béo khơng bDo hồ hay chất dẻo sinh học
TàI LIệU THAM KHảO
1 Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phớc Hiền, 1999: Công nghệ sinh học vi tảo Nxb Nông nghiệp
2. Nguyn c Lng, 2002: C«ng nghệ vi sinh, Vi sinh vật học c«ng nghiệp Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2: 119-133
M C+1
(6)3. Hanahan D., 1983: J Mol Biol., 166: 577-580
4 Inoue H.et al., 1990: Gene, 96: 23-28 Kawata Y. et al., 2003: Biosci Biotechnol
Biochem., 67 (5): 1179-1181
6 Kawata Y et al., 2004: Marine Biotechnol.,
6: 355-363
7 Takeshita S et al., 1987: Gene, 61: 63-74 Thiel and Poo H., 1989: Journal of
Bacteriology: 5743-5746
9 Toyomizu M et al., 2001: Journal of Applied Phycology, 13: 209-214
Application of the lipofection method to transform gene into the cells of
the cyanobacterium - species Spirulina platensis
Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Sei-ichi AIBA, Yoshikazu KAWATA
Summary
Spirulina platensis was a commercially cultured cyanobacterium spcies, having biomass up to 3.000 tons in a year and used as health food and animal feed If we could draw its potential, we could apply S platensis to solve environment problems S platensis produced valuable materials such as γ-linolenic acid, bioplastic etc To increase the content of these materials, the recombinant DNA technique was most important, but its application has just been started At present, to transform gene into Spirulina cells, only the electroporation method was applied for this purpose
The lipofection method was used widely for transfection It had advantages for its convenience, efficiency and safety but its application was limited to culture mammalian cells Recently, we found E coli and S platensis could be transformed by lipofection method
We investigated conditions to transform S platensis with DOTAP liposomal transfection reagents We used the pHSG397 vector with cat to transform S platensis The transformed Spirulina cells could survive in the condition of chloramphenicol concentration more than 0.5 µg/ml for weeks The transformation efficiency of the lipofection method was - 15 times better in comparison with the electroporation method, dependently on applied vetors (such as close or open vector cutted used by the enzyme EcoRI)