Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn (pedv porcine epidemic diarrhea virus) phân lập được từ các đàn lợn yorkshire nuôi tại vùng phụ cận hà nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƢƠNG THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GÂY BỆNH CỦA VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY TRÊN LỢN ( PEDV - PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC ĐÀN LỢN YORKSHIRE NUÔI TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis Abstract xii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu dịch tiêu chảy lợn Yorkshire (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) giới việt nam 2.1.1 Một số nghiên cứu bệnh Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) Việt Nam 2.2 Hiểu biết bệnh 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Hình thái cấu trúc 2.2.3 Tính chất ni cấy 2.2.4 Sức đề kháng 2.3 Hiểu biết bệnh Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) 2.3.1 Loài mắc bệnh 2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh 2.3.3 Đƣờng xâm nhập 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh iii 2.3.5 Triệu chứng lâm sàng 2.3.6 Bệnh tích 10 2.3.7 Chẩn đoán 11 2.3.8 Phịng kiểm sốt bệnh 12 2.3.9 Phƣơng pháp nuôi cấy virus tế bào tổ chức 15 2.3.10 Định lƣợng virus 15 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 17 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.2.1 Đặc tính sinh học 17 3.2.2 Đặc điểm gây bệnh 17 3.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 17 3.4 Nguyên liệu, hóa chất, máy móc 17 3.4.1 Nguyên liệu 17 3.4.2 Hóa chất 17 3.4.3 Máy móc dụng cụ 18 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.5.1 Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng 18 3.5.2 Phƣơng pháp mổ khám 18 3.5.3 Phƣơng pháp lấy mẫu bảo quản mẫu làm tiêu 18 3.5.4 Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR 19 3.5.5 Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân lập virus 21 3.5.6 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 21 3.5.7 Phƣơng pháp phân lập virus môi trƣờng tế bào 23 3.5.8 Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50 23 3.5.9 Phƣơng pháp làm nhuộm tiêu vi thể 24 3.5.10 Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu 26 Phần Kết thảo luận 27 4.1 Đặc tính sinh học 27 4.1.1 Xác định mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV 27 4.1.2 Kết phân lập giám định virus PEDV môi trƣờng tế bào 29 4.1.3 Xác định hiệu giá chủng virus phân lập đƣợc 32 iv 4.1.4 Khả gây bệnh tích tế bào virus PEDV 33 4.2 Đặc điểm gây bệnh chủ yếu lợn mắc PEDV 36 4.2.1 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn mắc PEDV 36 4.2.2 Bệnh tích đại thể chủ yếu lợn yorkshine mắc PEDV 39 4.2.3 Bệnh tích vi thể chủ yếu lợn Yorkshine mắc PEDV 42 Phần Kết luận kiến nghị 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 47 Tài liệu tham khảo 48 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Micro lit CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecc’s Modified Eagle Medium ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal bovine serum IFA Indirect Immunofluorescense Assay IPMA Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay MOI Multiplicity Of Infection PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGEV Transmissible Gastro Enteritis Virus RNA Ribonucleoic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình 24 Bảng 4.1 Kết phản ứng RT-PCR mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh PEDV 28 Bảng 4.2 Nguồn gốc mẫu lợn Yorkshire theo địa phƣơng đƣợc chẩn đoán dƣơng tính với PEDV 30 Bảng 4.3 Kết phân lập virus PEDV môi trƣờng tế bào Vero 30 Bảng 4.4 Kết giám định virus PEDV mẫu phân lập đời thứ 32 Bảng 4.5 Kết xác định hiệu giá virus chủng virus PEDV phân lập đƣợc 33 Bảng 4.6 Bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng virus PEDV phân lập 34 Bảng 4.7 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn mắc PEDV 36 Bảng 4.8 Bảng kết biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu lợn Yorkshire mắc PEDV 39 Bảng 4.9 Biến đổi bệnh tích vi thể số quan lợn theo mẹ mắc PEDV 42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc Coronavirus (Kathryn V.Holmes, 2003) Hình 2.2 Cơ chế gây bệnh PEDV Hình 2.3 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR 12 Hình 4.1 Gen đƣợc khuếch đại phần gen S (651bp) 27 Hình 4.2 Tế bào Vero bình thƣờng 31 Hình 4.3 Tế bào Vero bắt đầu có bệnh tích 31 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào phát triển 31 Hình 4.5 Tế bào bị phá hủy hoàn toàn 31 Hình 4.6 Bệnh tích tế bào 24h - PEDV – 03 35 Hình 4.7 Bệnh tích tế bào 48h – PEDV – 03 35 Hình 4.8 Bệnh tích tế bào 72h – PEDV – 03 35 Hình 4.9 Bệnh tích tế bào 84h - PEDV - 03 35 Hình 4.10 Lợn Yorkshire gây sút cân, gầy còm 38 Hình 4.11 Lợn Yorkshire nơn mửa 38 Hình 4.12 Lợn Yorkshire nằm dồn đống 38 Hình 4.13 Phân dính hậu mơn, chân 38 Hình 4.14 Phân lỏng màu vàng 38 Hình 4.15 Phân màu xi măng 38 Hình 4.16 Ruột chứa dịch lỏng màu vàng 41 Hình 4.17 Thành ruột mỏng chứa đầy 41 Hình 4.18 Hạch bẹn nông sƣng to 41 Hình 4.19 Thận xuất huyết điểm 41 Hình 4.20 Phổi xuất huyết 41 Hình 4.21 Gan sƣng, túi mật căng 41 Hình 4.22 Biểu mơ dày đứt nát (HEx10) 45 Hình 4.23 Ruột non sung huyết, xuất huyết (HEx10) 45 Hình 4.24 Phổi sung huyết thâm nhiễm tế bào viêm (HE x 10) 45 Hình 4.25 Lơng nhung ruột đứt nát (HE x 10) 45 Hình 4.26 Thâm nhiễm tế bào viêm ruột (HE x 40) 45 Hình 4.27 Thận sƣng huyết, thâm nhiễm tế bào (HE x 10) 45 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dƣơng Thị Hồng Tên Luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học gây bệnh virus gây dịch tiêu chảy lợn (PEDV-Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập từ đàn lợn Yorkshire nuôi vùng phụ cận Hà Nội” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc số đặc tính sinh học gây bệnh chủng virus PEDV phân lập từ lợn Yorkshire mắc PEDV vùng phụ cận Hà Nội phục vụ công tác chẩn đốn bệnh điều chế vaccine phịng bệnh Phƣơng pháp nghiên cứu  Nội dung : - Đặc tính sinh học + Xác định mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV + Phân lập chủng PEDV môi trƣờng tế bào + Xác định hiệu giá virus chủng PEDV phân lập + Đánh giá khả gây bệnh tích tế bào (CPE) chủng PEDV phân lập môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero - Đặc điểm gây bệnh +Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) +Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) +Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus )  Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu : - Vật liệu + Nguyên liệu Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi số trang trại vùng phụ cận Hà Nội Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy khay nuôi tế bào đĩa lồng ix xuất sau 36 gây nhiễm) tăng chậm thời gian Sau 48 gây nhiễm, CPE chủng gây đạt từ 20-30%, đạt từ 30-50% thời điểm 60 sau gây nhiễm Sau 72 gây nhiễm, CPE chủng gây đạt xấp xỉ 75-80%, hẳn so với CPE đƣợc gây chủng PEDV-03 Đạt 100% CPE đƣợc ghi nhận thời điểm 84 sau gây nhiễm đến 96 toàn tế bào bị tan vỡ bong khỏi bề mặt nuôi cấy, chậm 12 so với chủng PEDV-03 Nhƣ chủng PEDV phân lập đƣợc, thời điểm xuất bệnh tích tế bào nhƣ phá hủy toàn tế bào Vero có khác nhau, điều phản ánh khác khả nhân lên phá hủy tế bào Vero chủng virus phân lập đƣợc 4.2 ĐẶC ĐIỂM GÂY BỆNH CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC PEDV 4.2.1 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn mắc PEDV Triệu chứng lâm sàng dấu hiệu bất thƣờng đƣợc biểu bên ngồi mà chẩn đoán qua phƣơng pháp khám bệnh lâm sàng nhƣ: nhìn, sờ nắn, gõ nghe Những triệu chứng lâm sàng lợn đƣợc quan sát kết hợp với thu thập thông tin từ cán thú y, chủ trang trại nơi có lợn mắc PEDV Kết triệu chứng lâm sàng đƣợc trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn mắc PEDV Triệu chứng STT Số quan sát lâm sàng Số biểu Tỷ lệ (%) Ủ rũ, mệt mỏi, 15 15 100 Tiêu chảy, phân lỏng màu vàng 15 15 100 Gầy sút giảm ăn 15 12 80,00 Nôn 15 Nằm chồng đống, nằm bụng mẹ 15 46,67 Sốt 15 33,33 Khó thở 15 13,33 53,33 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng lợn mắc PEDV cho thấy: Triệu chứng lâm sàng lợn thay đổi phụ thuộc vào chủng virus, trạng thái 36 miễn dịch đàn, nhƣ điều kiện quản lý chăm sóc, đồng nhiễm loại virus, vi khuẩn gây tiêu chảy khác Qua theo dõi nhóm lợn cho thấy rằng: Các biểu lợn mắc PEDV gồm: Tiêu chảy (100%), sốt (33,33%), ủ rũ, mệt mỏi (100%), chán ăn, bỏ ăn, gầy sút, nơn Lợn cịn có tƣợng nằm dồn đống (46,67%)có thể bị tiêu chảy mạnh nên thân nhiệt giảm chúng thích nằm tụ lại Hiện tƣợng tiêu chảy biểu đặc trƣng phổ biến lợn mắc PEDV nhiên nhóm đối tƣợng khác biểu tiêu chảy lại có đặc trƣng riêng Ở lợn theo mẹ phân màu vàng, chứa nhiều cặn sữa trắng không tan nhiều nƣớc triệu chứng chính, đặc trƣng điển hình bệnh chiếm tỉ lệ 100% Từ đặc trƣng lợn theo mẹ mắc tiêu chảy nghĩ đến nhiễm PEDV có tỉ lệ mắc tỉ lệ chết cao, bệnh diễn biến nhanh, ạt, sử dụng kháng sinh không hiệu Nghiên cứu tập trung chủ yếu vào nhóm lợn theo mẹ nhóm lợn chịu ảnh hƣởng hậu nặng nề PEDV gây Bên cạnh nhóm lợn thịt lợn nái có biểu tiêu chảy phân lỏng, màu xi măng, nhiều nƣớc dẫn đến tƣợng nƣớc, tai cụp, mắt trũng sâu bụng hóp Lợn thƣờng ủ rũ, bỏ ăn, sốt 40-41°C có kèm theo nơn mửa Tuy tỉ lệ mắc cao nhƣng nhóm lợn lại có tỉ lệ chết thấp điều khác biệt bệnh virus PEDV gây so với virus gây bệnh khác Ngồi q trình quan sát, lợn bị tiêu chảy cịn có tƣợng nằm tụ lại, dồn đống, lông xơ xác, da khô, bẩn, dính phân xung quanh hậu mơn, chân Phân lợn sau chuyển sang màu tro xám, sền sệt nhƣ màu xi măng, mùi khó chịu Khi điều tra cho thấy lợn nái thƣờng phát bệnh đầu tiên, sau lợn theo mẹ, cuối lợn trƣởng thành Lợn nái có biểu tiêu chảy 1-3 ngày qua khỏi, lợn thịt 5-6 ngày biểu triệu chứng Nhìn chung lợn thịt lợn nái mắc bệnh nhƣng thƣờng qua khỏi tỉ lệ chết thấp Lợn theo mẹ sau ngày nhiễm thƣờng tiêu chảy ạt, nƣớc, gầy sút nhanh, chết nhanh nƣớc nhiều, sống đƣợc ngày sau mắc khỏi hồi phục dần dầ 37 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CỦA LỢN YORKSHIRE MẮC PEDV Hình 4.10 Lợn Yorkshire gây sút cân, gầy cịm Hình 4.11 Lợn Yorkshire nơn mửa Hình 4.12 Lợn Yorkshire nằm dồn đống Hình 4.13 Phân dính hậu mơn, chân Hình 4.15 Phân màu xi măng Hình 4.14 Phân lỏng màu vàng 38 4.2.2 Bệnh tích đại thể chủ yếu lợn yorkshine mắc PEDV Các mẫu bệnh phẩm đƣợc gửi phịng thí nghiệm trọng điểm thú y, khoa thú y có biểu lâm sàng mắc bệnh PEDV tiến hành chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR, theo dõi, quan sát, ghi lại triệu chứng lâm sàng chủ yếu sau tiến hành mổ khám quan sát biến đổi bệnh tích đại thể quan, tổ chức, chụp ảnh bệnh tích, ghi lại hồ sơ mẫu, biên mổ khám lƣu mẫu lại Kết quan sát biến đổi bệnh tích đại thể lợn mắc PEDV đƣợc trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8 Bảng kết biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu lợn Yorkshire mắc PEDV STT Biến đổi bệnh lý đại thể Ruột non căng phồng, chứa đầy dịch màu vàng,thành ruột mỏng Số lợn quan sát Số lợn có bệnh tích Tỷ lệ (%) 15 15 100 Dạ dày căng phồng, chứa sữa không tiêu 15 15 100 Hạch màng treo ruột sƣng, xuất huyết 15 15 100 Gan sƣng, túi mật căng, dịch mật đặc 15 13 86,67 Hạch bẹn nông sƣng, xuất huyết 15 12 80,00 Thận sƣng xuất huyết 15 12 80,00 Lách nhồi huyết, xuất huyết, rìa lách sƣng nhẹ 15 20,00 Phổi tụ huyết, xuất huyết điểm, có bọt khí phổi, phổi viêm 15 20,00 39 Từ kết bảng 4.8 cho thấy bệnh tích đại thể chủ yếu lợn mắc PED tập trung quan tiêu hóa hệ thống hạch, quan khác có tổn thƣơng nhƣng khơng nhiều đó: Ruột: 100% lợn có bệnh tích thành ruột non mỏng, nhạt màu bình thƣờng chứa đầy dịch màu vàng, lợn cợn lịng ruột xuất huyết (hình ảnh 4.16) Các đoạn không tràng hồi tràng phồng to, chất chứa đƣờng ruột lỗng, lợn bị tiêu chảy, giảm hấp thu nên vật còi cọc, chậm lớn chết nƣớc điện giải Cùng với bệnh tích ruột hạch màng treo ruột sƣng to, xuất huyết chiếm 100% Các ống dƣỡng chấp rõ, niêm mạc ruột có tƣợng xuất huyết lan tràn Hạch bẹn nông: Hạch bẹn nông sƣng to bình thƣờng 2-3 lần mầu đỏ thẫm, xuất huyết lấm bề mặt hạch cắt hạch có chút dịch hồng phớt chảy (hình ảnh 4.18) Bên cạnh hạch màng treo ruột có những tổn thƣơng nhƣ sƣng, xuất huyết chiếm 100%, hạch khác biến đổi Dạ dày: Dạ dày căng phồng chứa nhiều sữa không tiêu chiếm 100%, số thấy có xuất huyết Niêm mạc dày sung huyết nhẹ, thành dày mỏng Gan: Bệnh tích chủ yếu gan sƣng, túi mật căng, dịch mật đặc chiếm 86,67%, có trƣờng hợp sung huyết nhẹ, đơi khơng thấy bệnh tích (hình ảnh 4.21) Thận: Bệnh tích thận lợn mắc PEDV điển hình Hiện tƣợng thận sƣng xuất huyết (hình ảnh 4.19) chiếm tỷ lệ 80% Lách: Lách nhồi huyết, xuất huyết chiếm 20% Hiện tƣơng rìa lách sƣng tù hệ thống gan lách bị ứ máu giống nhƣ gan Phổi: Có tƣợng tụ huyết, xuất huyết điểm nhƣng khơng đƣợc điển hình chiếm 20%, có bọt khí phổi (hình ảnh 4.20) Đây khơng phải bệnh tích đặc trƣng PEDV, mức độ biến đổi phổi phụ thuộc vào tiến triển bệnh nhƣ kế phát bệnh khác Tim: Có tƣợng mỡ vành tim, tích nƣớc vàng nhạt xoang bao tim, tim mềm nhão bình thƣờng Những biến đổi bệnh tích khác tùy thuộc vào diễn biến bệnh 40 MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ CỦA LỢN YORKSHIRE MẮC PEDV Hình 4.16 Ruột chứa dịch lỏng màu Hình 4.17 Thành ruột mỏng vàng chứa đầy Hình 4.18 Hạch bẹn nơng sưng to Hình 4.19 Thận xuất huyết điểm Hình 4.20 Phổi xuất huyết Hình 4.21 Gan sưng, túi mật căng 41 4.2.3 Bệnh tích vi thể chủ yếu lợn Yorkshine mắc PEDV Nghiên cứu đặc điểm gây bệnh vi thể có vai trò quan trọng việc nghiên cứu bệnh lý học, giúp hiểu đƣợc đích tác động virus nhƣ tổn thƣơng bệnh lý cấp độ mơ tế bào Các quan có bệnh: Phổi, gan, lách, thận, tim, ruột hạch đƣợc lấy để quan sát bệnh tích vi thể Kết nghiên cứu tổn thƣơng vi thể lợn mắc PEDV đƣợc trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Biến đổi bệnh tích vi thể số quan lợn theo mẹ mắc PEDV Tổn thƣơng vi thể STT Cơ quan Dạ Xuất huyết Sung huyết (n=30) (n=30) Thối hóa tế bào Hoại tử tế bào Thâm nhiễm tế bào viêm (n=30) (n=30) (n=30) Dƣơng tính Tỷ lệ % Dƣơng tính Tỷ lệ % Dƣơng tính Tỷ lệ % Dƣơng tính Tỷ lệ % Dƣơng tính Tỷ lệ % 22 73,33 24 80,00 18 60,00 18 60,00 20,00 18 60,00 30 100 20 66,67 18 60,00 20 66,67 dày Hạch ruột Ruột 22 73,33 24 80,00 12 40,00 12 40,00 22 73,33 Phổi 20,00 24 80,00 26,67 20,00 24 80,00 Gan 12 40,00 10 33,33 18 60,00 12 40,00 12 40,00 Thận 20,00 20,00 24 80,00 20,00 18 60,00 Lách 12 60,00 10 33,33 30,00 20,00 40,00 Tim 13,33 13,33 6,67 20,00 20,00 n: Số block đƣợc nghiên cứu, mẫu bệnh phẩm chọn block 42 Từ kết bảng 4.9 cho thấy trình tổn thƣơng hạch, phổi, hạch ruột, gan, thận chủ yếu sung huyết xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm hoại tử tế bào Ruột: Ruột xuất huyết (73,33%), sung huyết nặng (80%), lông nhung bị gãy nát thành mảng có chỗ lơng nhung bị rụng gần nhƣ niêm mạc ruột bị bào mịn, tế bào biểu mơ bị thối hóa (40%) Thâm nhiễm tế bào viêm chiếm 73,33% có nhiều bạch cầu đa nhân trung tính Các tổn thƣơng ruột điển hình Dạ dày: Dạ dày có tổn thƣơng sung huyết (80%), xuất huyết (73,33%), thối hóa tế bào (60%) Các lông nhung dày bị gãy nát, biểu mơ bị bong tróc thành mảng, có nơi biểu mơ bị bào mịn, tế bào biểu mơ bị thối hóa Cũng giống nhƣ ruột, dày có thâm nhiễm tế bào nhƣng khơng nhiều chiếm 20% vị trí bị thâm nhiễm tế bào tập trung bạch cầu đa nhân trung tính Hạch ruột: Các tƣợng biến đổi bệnh lý hạch chiếm tỷ lệ tƣơng đối cao tƣợng hạch sung huyết (100%), thối hóa tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm chiếm 66,67%, bên cạnh hoại tử tế bào xuất huyết chiếm 66,67% Các tế bào lympho bị thối hóa thâm nhiễm tế bào viêm tế bào thực bào đƣợc minh họa hình, đặc biệt tế bào chất thƣờng chứa hạt nhỏ, thể vùi Hiện tƣợng thối hóa tế bào mô hạch lan tràn miền vỏ hạch lympho hầu hết tiêu Ngồi ra, có xuất tế bào khổng lồ nhiều nhân hay gọi thể hợp bào, xuất tế bào khổng lồ nguyên nhân dẫn tới việc khó khăn tìm tế bào miễn dịch đa nhân trung tính, đơn nhân lớn, lympho bào, tƣơng bào Gan: Tế bào gan bị thối hóa thâm nhiễm tế bào viêm đặc trƣng Từ bảng 4.9 cho thấy biến đổi bệnh tích vi thể gan chủ yếu thối hóa tế bào chiếm cao 60% tƣợng biến đổi bệnh lý khác Các tƣợng thâm nhiễm tế bào, tăng sinh tế bào nang lympho chiếm tỷ lệ thấp 40% Trong sung huyết gan chiếm 33,33% Phổi: Phổi bị sung huyết thâm nhiễm tế bào viêm, hai bệnh tích chiếm tỷ lệ cao tới 80%, thối hóa tế bào (26,67%), xuất huyết, hoại tử tế bào phổi không nhiều chiếm 20% Khi lợn mắc PED thấy rõ tƣợng 43 sung huyết phổi, mạch quản dãn rộng chứa đầy hồng cầu, hồng cầu tràn ngập vào lòng phế quản, ngồi cịn tăng sinh tế bào có tƣợng hoại tử tế bào xơ, phù kẽ phổi vài điểm tế bào chiếm tỷ lệ thấp Thâm nhiễm tế bào đơn nhân lớn, bạch cầu đa nhân trung tính, lâm ba cầu Tim: Bệnh tích tim chủ yếu thối hóa tim, tim bị viêm, ngồi cịn có tƣợng thâm nhiễm tế bào viêm, hoại tử tế bào chiếm tỷ lệ 20%, lại tổn thƣơng sung huyết, xuất huyết chiếm 13,33%, thối hóa tế bào khơng đáng kể, tim giãn rộng theo thời gian Thận: Khác với gan thận cịn có tƣợng bệnh lý khác biệt nhƣ biến đổi kẽ thận, xuất huyết xâm nhiễm chiếm tới 20%, với bệnh tích đặc trƣng thận nhƣ: Thâm nhiễm tế bào viêm (60%), thối hóa tế bào chiếm 80%, số tiêu thấy ống thận bị hoại tử, kẽ thận xuất huyết có nhiều hồng cầu tập trung, tế bào viêm thâm nhiễm chèn ép ống thận, có dạng tế bào thƣờng gặp nhƣ lympho, tổ chức tế bào (histyocyte), lâm ba cầu, có hoại tử xảy nhƣng khơng đáng kể Lách: Ít có biến đổi bệnh lý, số tiêu có tƣợng sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm 44 MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH VI THỂ Hình 4.22 Biểu mơ dày đứt nát (HEx10) Hình 4.23 Ruột non sung huyết, xuất huyết (HEx10) Hình 4.24 Phổi sung huyết thâm nhiễm tế bào viêm (HE x 10) Hình 4.25 Lơng nhung ruột đứt nát (HE x 10) Hình 4.26 Thâm nhiễm tế bào viêm ruột (HE x 40) Hình 4.27 Thận sưng huyết, thâm nhiễm tế bào (HE x 10) 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đƣa số kết luận sau: Đặc tính sinh học - Phân lập thành công chủng virus PEDV từ 15 mẫu lợn đƣợc chẩn đốn dƣơng tính kỹ thuật RT-PCR Môi trƣờng tế bào Vero dịng tế bào thích hợp cho nhân lên virus Để phân lập thành công virus PEDV cần bổ sung mơi trƣờng phân lập thích hợp mơi trƣờng DEME có 10% TPB, 10mg/ml trypsin 0,02% dịch chiết nấm men Bệnh tích tế bào đƣợc biểu rõ với đám tế bào bị dung giải màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại với hình thành thể hợp bào, quan sát rõ kính hiển vi soi ngƣợc - Các chủng virus PEDV phân lập đƣợc có hiệu giá từ 104.25/25µl đến 105.50/25µl - Nghiên cứu khả gây bệnh tích tế bào bắt đầu xuất sau 24 gây nhiễm sớm Tế bào sau gây nhiễm bị phá hủy hoàn toàn sau 84 gây nhiễm Đặc điểm gây bệnh - Các lợn Yorkshire mắc PEDV có triệu chứng lâm sàng: lợn ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, bỏ bú, lợn bị tiêu chảy nặng, phân lỏng màu vàng lợn (100%), gầy sút giảm cân (80,00%), nằm chồng đống, thích nằm bụng mẹ (46,67%) - Các bệnh tích đại thể thƣờng gặp quan lợn mắc PEDV chủ yếu gặp đƣờng tiêu hóa: ruột căng phồng chứa đầy dịch vàng bên trong, có chứa căng mọng, thành ruột mỏng (100%), có sung huyết ruột, gan sƣng, túi mật căng, dịch mật đặc (86,67%) Dạ dày chứa thức ăn khơng tiêu, sữa vón đơng 100% Một số quan khác có bệnh tích nhƣng khơng phải đặc trƣng bệnh - Một số bệnh tích vi thể bệnh: dày xuất huyết (73,33%,), sung huyết tập trung nhiều quan nhƣ hạch ruột (100%), ruột, phổi, dày đồng chiếm (80,00%) Thâm nhiễm tế bào tổn thƣơng chiếm tỷ lệ lớn quan: Hạch ruột (66,67%), ruột (73,33%), phổi (80,00%) Thối hóa tế bào 46 quan nhìn chung có tỷ lệ thấp hơn, đặc biệt tập trung thận (80%), hạch ruột (66,67%) Hoại tử tế bào xảy quan (20 – 60%) 5.2 KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu đặc điểm triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PEDV lợn độ tuổi khác Tiếp tục ứng dụng phản ứng RT-PCR với loại mẫu bệnh phẩm khác nhƣ nƣớc bọt, thực quản… để chẩn đoán phát sớm virus lợn mắc PEDV từ đƣa biện pháp điều trị bệnh đạt hiệu cao giảm thiệt hại cho ngƣời chăn nuôi Nghiên cứu tập trung chủ yếu virus PEDV phân lập tế bào Vero môi trƣờng dinh dƣỡng Tiến hành nghiên cứu sâu sinh học phân tử để thu đƣợc kết có giá trị thực tiễn cao 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phƣợng Lê Ngọc Mỹ (1995) Bệnh đƣờng tiêu hóa lợn NXB Nơng Nghiệp Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phƣợng, Lê Ngọc Mỹ Huỳnh Văn Kháng (2000) Bệnh lợn nái lợn con, NXB Nông Nghiệp Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Nguyên Phạm Ngọc Thạch (1997) Giáo trình chẩn đốn lâm sàng thú y, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2011) , Giáo trình Bệnh Truyền nhiễm thú y, NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải, Chẩn đoán bệnh động vật kỹ thuật phân tử NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Nhƣ Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hƣơng (1997) Giáo trình vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Tất Toàn Đỗ Tiến Duy (2001) Một số yếu tố liên quan đặc điểm sinh học dịch tiêu chảy cấp heo theo mẹ số tỉnh phía Nam” Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XX, số 2, 2013 Nguyễn Tất Tồn, Nguyễn Đình Qt Huỳnh Văn Kháng (2012) Đặc điểm dịch tễ chẩn đoán bệnh đƣờng ruột Coronavirus,NXB Nông Nghiệp Nguyễn Văn Điệp Nguyễn Thị Lan (2013) Bệnh tiêu chảy dịch lợn (Porcine Epidemic Diarrhea), thông tin cho công tác chẩn đốn, phịng trị bệnh” Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XX, số 2, 2013 10 Trịnh Văn Thịnh (1995) Bệnh lợn Việt Nam, NXB KHKT, Hà Nội 11 Võ Trọng Hốt, Trần Đình Miên, Võ văn Sự, Vũ Đình Tơn, Nguyễn Khắc Tích Đinh Thị Nơng (2000) Giáo trình chăn ni lợn NXB Nông nghiệp Hà Nội Tiếng Anh: 12 Ana Carvajal, Ignacio Lanza, Rafael Diego, Pedro Rubio, Pedro Cármenes (1995) “Seroprevalence of porcine epidemic diarrhea virus infection among different types of breeding swine farms in Spain” Pre Vet Med 23: 33-40 48 13 Bridgen A, Duarte M, Tobler K, Laude H, Ackermann M (1993) “Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus” J Gen Virol 74 (Pt 9):1795–1804 14 Callebaut P, Debouck P, Pensaert M (1982) “Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea” Vet Microbiol 7:295–306 15 Callebaut P, DeBouck P (1981) “Some characteristics of a new porcine coronavirrus detection of antibody by ELISA” Proe 5b Int Congr Virol, p 420 16 Chasey D, Cartwright SF (1978) “Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhea” Res Vet Sci Sep; 25 (2):255–256 17 Chae C, Kim O, Choi C, Min K, Cho WS, Kim J, Tai JH 2000 “Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs” Vet Rec 147: 606–608 18 DeBouck P, Callebaut P, Pensaert M (1982) “ Prevalence of the porcine epidemic diarrhea (PEDV) virus in pig population of the different contries” Proc Congrt Int Pig Vet Soc 7: 53 19 Debouck P and Pensaert M (1980) “Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus, CV777” Am J Vet Res., 41, 219-223 20 Hofmann M Wyler R (1987) “Serolgishe Untersuchung uber das Vorkommen der Epizootischen Virusdiarrhoe dẻ Schweine (EVD) in der Schewiz” Schewiz Arch Tierhilkd 129: 437 - 442 21 Hofmann M, Wyler R (1988) “Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture” J Clin Microbiol 26:2235–2239 22 Hofmann M Wyler R (1989) “Quantitation, biological physiochemical properties of the cell culture – apdapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV)” Vet Microbiol 20:131 - 142 23 Kadoi K., Sugioka H., Satoh T Kadoi BK (2002) “The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell line New Microbiol” 25: 285 -290 24 Kweon CH., Kweon DJ., An SH (1995) “Insolution of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Korea” Korean J Vet Rec 35:349 -358 49 25 Kocherhans., R, Bridgen (2001) “Completion of the porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV) genome serotype”.23(3): 135- 246 26 Lee HK, Yeo SG, (2003) “Propagation of pocine epidemic diarrhea virus Chinjin 99 in Korea” Vet Clin 20: 150 -154 27 Ishikawa K, Sekiguchi H, Ogino T, Suzuki S (1997) “Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR” J Virol Methods 69(1-2): 191-5 28 Pensaert, M.B., de Bouck P (1978) “A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine” Arch Virol 58:243–247 29 Pensaert, M.B., (1986) “Porcine epidemic diarrhe In: A.D Leman et al (Editors), Diseases of Swine” Iowa State University Press, Ames, IA 30 Pensaert, M.B., (1989) “Porcineepidemic diarrhea In: M.B Pensaert Virus Infectionsof Porcines” 31 (Editor), Elsevier, Amsterdam Pensaert, M and Callebaut, P., (1982) “Porcine epidemic diarrhea (PED) caused by coronavirus present knowledge” Proc.7th IPVS Congress, July 1982, Mexico Edited by the Scientific Committee of the 7th IPVS Congress,p 52 32 Peenseart and Van Rech K (1998) “Porcine epidemic diarrhea porcine respiratory coronavirus” 423 -436 33 Rodak and S.Nakai (2004), Porcine Epidemic Diaarrhea Virrus Emergence in the US: Status Report, Diagnostics, Observations 34 http://www.iowapork.org/FileLibrary/States/IA/PEDV%20update%20-4 35 %20Diagnostics-transmission-management-%20reporting.pdf 36 http://www.usda.gov/documents/pedv-summary-actions.pdf https://www.aasv.org/shap/issues/v10n2/v10n2p81.pdf 50 ... Hồng Tên Luận văn: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh học gây bệnh virus gây dịch tiêu chảy lợn (PEDV- Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập từ đàn lợn Yorkshire nuôi vùng phụ cận Hà Nội? ?? Ngành: Thú y... Epidemic Diarrhea Virus) phân lập từ đàn lợn Yorkshire nuôi vùng phụ cận Hà Nội ” 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Nghiên cứu đƣợc số đặc tính sinh học chủng virus PEDV phân lập từ lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV vùng. .. phẩm sinh học, vacine phịng bệnh kit chẩn đốn bệnh nhanh Xuất phát từ thực tế, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh học gây bệnh virus gây dịch tiêu chảy lợn (PEDV- Porcine Epidemic