Xác định gen kháng thuốc của chủng vi khuẩn salmonella đa kháng thuốc phân lập từ thịt tươi ở một số địa điểm tại hà nội

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ HỒI THU XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CHỦNG VI KHUẨN SALMONELLA ĐA KHÁNG THUỐC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Bích Thủy PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực với giúp đỡ cán bộ, cơng nhân viên Phịng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn khoa học TS Võ Thị Bích Thủy Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Các tài liệu trích dẫn rõ nguồn gốc xuất xứ, tên tác giả Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Trần Thị Hoài Thu i LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Võ Thị Bích Thủy, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa thú y – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đóng góp ý kiến q báu giúp tơi q trình hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cám ơn tập thể cán Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tập thể Bộ môn Vệ sinh thú y, Viện Thú y Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ động viên suốt q trình hồn thiện luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban quản lý đào tạo – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho suốt hai năm học vừa qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Chuyển giao công nghệ Thú y, gia đình bạn bè đồng nghiệp động viên, cổ vũ giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Trần Thị Hoài Thu ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục ảnh, hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract .x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn salmonella bệnh chúng gây 2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước .6 2.2 Ô nhiễm salmonella thực phẩm có nguồn gốc động vật .8 2.3 Một số đặc điểm vi khuẩn salmonella .10 2.3.1 Đặc điểm hình thái 10 2.3.2 Đặc tính ni cấy 11 2.3.3 Đặc tính sinh hố 12 2.3.4 Sức đề kháng vi khuẩn Salmonella .12 2.3.5 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Salmonella 13 2.3.6 Các yếu tố gây bệnh Salmonella 14 2.4 Hiện tượng kháng thuốc Salmonella 15 2.4.1 Hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn .15 2.4.2 Hiện tượng kháng thuốc Salmonella 17 2.5 Gen kháng kháng sinh 18 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 3.1 Địa điểm nghiên cứu .22 3.2 Thời gian nghiên cứu 22 iii 3.3 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1 Đối tượng 22 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 22 3.4 Nội dung nghiên cứu 23 3.5 Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp 23 3.5.2 Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh .24 3.5.3 Phương pháp định typ phản ứng huyết học .26 3.5.4 Phương pháp xác định số gen kháng sinh chủng Salmonella đa kháng phương pháp RT-PCR 27 3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 30 Phần Kết thảo luận 31 4.1 Kết nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella .31 4.1.1 Kết xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp mẫu thịt lợn, gà 31 4.1.2 Kết giám định đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập 33 4.2 Kết kiểm tra khả mẫn cảm với kháng sinh vi khuẩn salmonella phân lập 39 4.3 Kết định typ chủng vi khuẩn salmonella đa kháng phân lập .43 4.4 Kết phát đánh giá gen kháng thuốc chủng Salmonella đa kháng phân lập .45 4.4.1 Kết tách chiết RNA tổng số chủng Salmonella đa kháng phân lập 45 4.4.2 Kết RT-PCR phát gen kháng kháng sinh chủng Salmonella đa kháng 47 4.4.3 Kết đánh giá gen kháng kháng sinh chủng Salmonella đa kháng 49 Phần Kết luận kiến nghị 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 55 Tài liệu tham khảo .57 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACMSF Advisory Committee on the Microbiological Safety of Food BGA Brilliant Green Agar BHI Brain Heart Infusion BLAST Basic Local Alignment Search Tool BPW Buffer Peptone Water BSA Bismuth Sulphite Agar CDC Center for Diease Control and Prevention CIRAD Centre International de Reseaux Agriculture and Development CLSI Clinical Laboratory Standards Instittute Cs Cộng DEPC- DW Diethylpyrocarbonate Distilled water DNA Deoxyribonucleic Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations ISO International Organization for Standardization LCD Lysine Decarboxylase broth MK Muller kauffmann MSRV Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis NCBI National Center for Biotechnology Information RNA RibonucleicAcid RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Tp Thành phố TSI Triple Sugar Iron VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm XLD Xylose Lysine Desoxycholate XLT4 Xylose Lysine Tergitol v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩnvới số loại kháng sinh .25 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi đặc hiệu xác định gen kháng kháng sinh .29 Bảng 4.1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ mẫu thịt 31 Bảng 4.2 Kết giám định đặc tính ni cấy hình thái khuẩn lạc chủng Salmonella spp trình phân lập 34 Bảng 4.3 Kết giám định số đặc tính sinh hố chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập .36 Bảng 4.4 Kết kiểm tra mức độ mẫn cảm với số loại khángsinh chủng vi khuẩn Salmonellaspp phân lập .41 Bảng 4.5 Mức độ kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập 41 Bảng 4.6 Kết kháng chloramphenicol tetracycline chủng vi khuẩn Salmonella phân lập 43 Bảng 4.7 Kết xác định serotype chủng vi khuẩn Salmonella đa kháng sinh 44 Bảng 4.8 Nồng độ RNA chủng Salmonella sau tách chiết .46 vi DANH MỤC ẢNH, HÌNH Hình 4.1 Vi khuẩn Salmonella môi trường MSRV .34 Hình 4.2 Vi khuẩn Salmonella mơi trường thạch XLT4 .35 Hình 4.3 Vi khuẩn Salmonella môi trường thạch Rambach 35 Hình 4.4 Vi khuẩn Salmonella mơi trường thạch Kligler 36 Hình 4.5 Vi khuẩn Salmonella môi trường thạch Kligler 37 Hình 4.6 Vi khuẩn Salmonella mơi trường Lysine decarboxylase broth (LDC) 37 Hình 4.7 Vi khẩn Salmonella môi trường thạch nghiêng Simmoncitrate 38 Hình 4.8 Vi khuẩn Salmonella mơi trường Ureaza broth 38 Hình 4.9 Tần số kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập .39 Hình 4.10 Kết kiểm tra RNA chủng Salmonella L5, G7, L2(1), L2(2), G1(1), G1(2) 46 Hình 4.11 Kết RT – PCR phát có mặt gen tetB mã hóa kháng tetracycline chủng Salmonella đa kháng 47 Hình 4.12 Kết RT - PCR phát gen floR mã hóa kháng phenicol chủng Salmonella đa kháng nguồn gốc từ gà G7 48 Hình 4.13 Kết RT – PCR phát gen cmlA mã hóa kháng chloramphenicol chủng Salmonella đa kháng nguồn gốc từ lợn L5 48 Hình 4.14 Tỷ lệ biểu gen tetA/16S rRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh .50 Hình 4.15 Tỷ lệ biểu gen cat-1/16SrRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh .51 Hình 4.16 Tỷ lệ biểu gen cmlA/16S rRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh .52 Hình 4.17 Tỷ lệ biểu gen floR/16S rRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh .53 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Hồi Thu Tên Luận văn: Xác định gen kháng thuốc chủng vi khuẩ Salmonella đa kháng phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu 60 mẫu thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt lợn, thịt gà) bày bán chợ Hà Nội kiểm tra để xác định có mặt mức độ biểu số gen kháng thuốc chủng Salmonella gây bệnh Phương pháp nghiên cứu Phương pháp lấy mẫu, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định khả mẫn cảm với kháng sinh, định typ phản ứng huyết học Phương pháp tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA, thiết kế mồi, RT-PCR điện di agarogel Kết kết luận - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp mẫu thịt thu thập từ số chợ tự địa bàn Hà Nội 21,67% đó, thịt lợn chiếm 20,0%, thịt gà chiếm 23,3% - Các chủng vi khuẩn Salmonella kiểm tra mang đặc tính sinh vật hóa học đặc trưng tài liệu ngồi nước mơ tả - Trong số 13 chủng Salmonella phân lập kiểm tra mức độ mẫn cảm với 10 loại kháng sinh thông dụng kháng cao với streptomycine (chiếm tỷ lệ 83,3%), tetracycline (chiếm tỷ lệ 66,7%), kháng chloramphenicol (50%), amoxicillin (50%), trimethoprime/sulfamethoxazol (50%), ampicillin (50%).Các chủng lựa chọn có khả đa kháng kháng sinh với - loại kháng sinh - Từ chủng Salmonella đa kháng thực định typ: serovar xác định S Rissen có mặt mẫu thịt gà (G7) S Meleagridis có mặt mẫu có nguồn gốc thịt lơn (L5) - Đã tách chiết thành công mẫu RNA tổng số tổng hợp cDNA phục vụ cho tiến hành thí nghiệm RT-PCR - Phát kiểu gen kháng sinh tetA, cat-1, cmlA, floR kháng tetracycline, chloramphenicol phenicol chủng Salmonella đa kháng viii - Tỷ lệ kháng chloramphenicol cao, đặc biệt tỷ lệ kiểu gen cmlA với 83,7% chủng L5(nguồn gốc thịt lợn) - Mẫu thịt lợn có tỷ lệ gen kháng sinh chủng Salmonella đa kháng cao mẫu thịt gà ix tetracycline.Còn mẫu đối chứng âm là2 chủng G1 L2 không cho sản phẩm PCR (Hình 4.14, giếng G1 giếng L2) Gen tetA mã hóa kháng tetracycline chủng L5 (nguồn gốc từ thịt lợn) có tỷ lệ 86, 9% cao so với chủng G7 (nguồn gốc từ thịt gà) 75,2% Kết nghiên cứu cho thấy chủng Salmonella đa kháng phân lập từ mẫu thịt gà mẫu thịt lợn kháng tetracycline với tỷ lệcao (Hình 4.14) Hình 4.14 Tỷ lệ biểu gen tetA/16S rRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA(house keeping gene) dùng để so sánh 4.4.3.2 Kết quảđánh giá gen cat-1 mã hóacho enzyme chloramphenicol acetyltransferase kiểu I kháng chloramphenicol chủng Salmonella đa kháng Với sản phẩm PCR có kích thước 549 bp (Hình 4.15, giếng G7 giếng L5) chủng Salmonella đa kháng G7, L5 phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội có mang gen cat-1 mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase kiểu I kháng chloramphenicol Còn mẫu đối chứng âm chủng G1 L2 không cho sản phẩm PCR (Hình 4.7, giếng G1 giếng L2) Gen cat-1 mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase kiểu I kháng chloramphenicol chủng G7 (nguồn gốc từ thịt gà) có tỷ lệ 89,1 % cao 50 so với chủng L5 (nguồn gốc từ thịt lợn)là 79,6 % Kết nghiên cứu cho thấy chủng Salmonella đa kháng phân lập từ mẫu thịt gà mẫu thịt lợn kháng chloramphenicol với tỷ lệcao (Hình 4.15) Hình 4.15 Tỷ lệ biểu gen cat-1/16SrRNAcủa chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh 4.4.3.3 Kết đánh giá gen cmlA mã hóa kháng chloramphenicol chủng Salmonella đa kháng Với sản phẩm PCR có kích thước 682 bp (Hình 4.8, giếng G7 giếng L5) chủng Salmonella đa kháng G7, L5 phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội có mang gen cmlA mã hóa kháng chloramphenicol.Cịn mẫu đối chứng âm chủng G1 L2 không cho sản phẩm PCR (Hình 4.16, giếng G1 giếng L2) Gen cmlA mã hóa kháng chloramphenicol chủng L5 (nguồn gốc từ thịt lợn) có tỷ lệ 83,7% cao gấp lần so với chủng G7 (nguồn gốc từ thịt gà) 28,2% Kết nghiên cứu cho thấy chủng Salmonella đa kháng phân lập từ mẫu thịt lợn kháng chloramphenicol với tỷ lệcao (Hình 4.16) 51 Hình 4.16 Tỷ lệ biểu gen cmlA/16S rRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh 4.4.3.4 Kết đánh giá gen floR mã hóa kháng phenicol chủng Salmonella đa kháng Với sản phẩm PCR có kích thước 1212 bp (Hình 4.9, giếng G7 giếng L5) chủng Salmonella đa kháng G7, L5 phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội có mang gen floR mã hóa kháng phenicol Cịn mẫu đối chứng âm chủng G1 L2 khơng cho sản phẩm PCR (Hình 4.17, giếng G1 giếng L2) Gen floR mã hóa kháng phenicol chủngL5 (nguồn gốc từ thịt lợn) 57,4 % thấp so với chủng G7 (nguồn gốc từ thịt gà) có tỷ lệ 82,6 % Kết nghiên cứu cho thấy chủng Salmonella đa kháng phân lập từ mẫu thịt gà mẫu thịt lợn kháng phenicol với tỷ lệ cao (Hình 4.17) 52 Hình 4.17 Tỷ lệ biểu gen floR/16S rRNA chủng Salmonella đa kháng phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16SrRNA (house keeping gene) dùng để so sánh Từ kết nghiên cứu cho thấy: Mức độ kháng kháng sinh Salmonella spp đa kháng phân lập từ thịt tươi cao Trên chủng G7(nguồn gốc thịt gà) L5 (nguồn gốc thịt lợn) phát thấy có tỷ lệ cao gen tetA, cat-1, cmlA floRkháng tetracycline, chloramphenicol phenicol Những vi khuẩn mối nguy với sức khoẻ cộng đồng chúng lây truyền qua chuỗi thực phẩm Khi so sánh với nhóm nghiên cứu Hoàng Hoài Phương (2008) khảo sát gen kháng kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm, 11 chủng Salmonella spp đa kháng sinh phát thấy có tỷ lệ cao blaTEM (90,9%), sul2 (72,7%), tetA, tetB, sul1 63,6%, gen phát clmA (45,5%) blaSHV (18,2%) Như vậy, chủng Salmonella đa kháng phân lập từ thực phẩm phát chủ yếu gen kháng ampicillin,sulfamethoxazol, tetracycline với tỷ lệ cao Nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu trước Trong chủng Salmonella đa kháng lựa chọn để nghiên cứu kháng nhóm chloramphenicol mức độ mạnh, đặc biệt tỉ lệ phát kiểu gen cmlAcao 83,7% kiểu gen floR thấp với tỉ lệ 57,4% chủng L5 (nguồn gốc thịt lợn) 53 Theo Adesiji et al (2014) nghiên cứu gen kháng thuốc chủng vi khuẩn Salmonella phân lập mẫu thực phẩm từ Ấn Độ mẫu người Nigeria, số 14 chủng đa kháng thuốc thử nghiệm, chủng dương tính với gen cmlA (61%) chủng dương tính với gen cmlB (69%) Trong nghiên cứu phát gen cat-1 gen kháng tất 14 chủng đa kháng chủng nhạy cảm Thêmvào đó, gen cat-2 phát tất mẫu thực phẩm tươi sống, gen floR có mặt tất 13 mẫu phân lập kháng florfenicol Điều cho thấy chloramphenicol kháng sinh chủ yếu sử dụng chăn nuôi, đặc biệt với chăn ni lợn với mục đích phịng trị bệnh Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh điều tra 628 sở chăn nuôi gà, lợn (2001 – 2002) địa bàn Bình Dương phát 26 loại kháng sinh sử dụng rộng rãi chăn nuôi, nhiều chloramphenicol (chiếm 15,35%), tylosin (15%), colistin (13,24%), norfloxacin (10%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracylin (7,95%), ampicillin (7,24%) Trong đó, chloramphenicol dùng cho lợn với tỉ lệ cao chiếm 17,91% cịn dùng gà chiếm 3,87% (Đinh Thiện Thuận cs., 2002) Thậm chí, chloramphenicol Chính phủ Việt Nam cấm sử dụng từ tháng 5/2002 chăn nuôi gia súc gia cầm sản xuất thực phẩm, thị trường thấy xuất tên thương mại Doc, Son, Tenicol…chuyên đặc trị tiêu chảy, E.coli, phó thương hàn mà đọc kỹ thành phần phát có chloramphenicol oxytetracyclin (Nhật Vy, 2016) Như ta biết, việc lạm dụng kháng sinh bừa bãi khiến tồn dư kháng sinh nói chung chloramphenicol nói riêng thân thịt với chủng vi khuẩn Salmonella ô nhiễm thân thịt qua nhiều nguồn khác làm xuất gen kháng thuốc dễ dàng.Bởigen kháng thuốc vi khuẩn tạo thànhbằng nhiều cách thức, đột biến, tức thuốc kháng sinh làm đột biến hệ vật chất di truyền vi khuẩn làm cho hệ vật chất bị biến đổi Sự đột biến xảy thuốc dùng với liều lượng khơng quy chuẩn vi khuẩn sống sót sau đợt điều trị Những “con” vi khuẩn sống sót nhận biết, cảm hố biến đổi DNA để chống lại tác dụng thuốc kháng sinh Như vậy, nghiên cứu hoàn toàn hợp lý với nghiên cứu kết luận trước 54 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp mẫu thịt thu thập từ số chợ tự địa bàn Hà Nội 21,67% đó, thịt lợn chiếm 20,0%, thịt gà chiếm 23,3% - Trong số 13 chủngSalmonella phân lập kiểm tra mức độ mẫn cảm với 10 loại kháng sinh thông dụng kháng cao với cephalothin (chiếm tỷ lệ 100%), streptomycine (chiếm tỷ lệ 84,6%), tetracycline (chiếm tỷ lệ 61,5%), kháng amoxicillin (53,8%), trimethoprime/sulfamethoxazol (53,8%), ampicillin (53,8%), chloramphenicol (46,2%) Ngoại trừ chủng L2, chủng lựa chọn có khả đa kháng kháng sinh với – loại kháng sinh - serovar xác định S Rissencó mặt mẫu thịt gà (G7) S Meleagridiscó mặt mẫu có nguồn gốc thịt lơn (L5) - Phát kiểu gen kháng sinh tetA, cat-1, cmlA, floR kháng tetracycline, chloramphenicol phenicol chủng Salmonella đa kháng Trong đó, tỷ lệ kiểu gen cmlA kháng chloramphenicol cao(83,7%) chủng L5(nguồn gốc thịt lợn) 5.2 KIẾN NGHỊ Với thời gian thực tập ngắn, kinh phí có hạn nên đề tài nghiên cứu dừng lại mức Để xác định đánh giá gen kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella spp đa kháng phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội cần: - Tiếp tục thu thập mẫu thịt tươi (thịt gà, thịt lợn) chợ địa bàn Hà Nội nghiên cứu tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp thân thịt - Xác định thêm chủng Salmonella spp đa kháng với loại kháng sinh thông dụng, kể kháng sinh hệ - Tiếp tục nghiên cứu xác định gen kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella spp đa kháng phân lập từ thịt tươi Để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng nhu cầu xuất sản phẩm động vật, việc kiểm soát dư lượng kháng sinh thú y đặc biệt dùng nuôi trồng thuỷ sản ngày tăng cường: 55 -Phải tuân thủ nghiêm qui định vệ sinh an toàn thực phẩm sản xuất mua bán sản phẩm Khơng sử dụng hóa chất, phụ gia danh mục cho phép phối trộn vào thức ăn chăn nuôi -Đối với người chăn nuôi, sở kinh doanh giết mổ gia súc gia cầm: cần phải nâng cao hiểu biết tiếp thu thơng tin an tồn thức ăn chăn ni; nên dùng chế phẩm sinh học thay kháng sinh thức ăn cho lợn, gà tránh tồn dư kháng sinh thịt Tuyệt đối tuân thủ thời gian ngừng sử dụng thuốc trước giết thịt theo hướng dẫn nhãn chai bao bì 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y tế (2001) Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học chất lượng VSATTP lần thứ tr 43 Bùi Thị Tho ( 2003) Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng kháng sinh chăn nuôi Nhà xuất Hà Nội Bùi Thị Tho (1996) Nghiên cứu tác dụng số thuốc hóa học trị liệu phytocid E.coli phân lập từ bệnh lợn phân trắng.Luận án phó tiến sĩ Nơng nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh Đỗ Ngọc Thuý (2000) Phân lập vi khuẩn E.coli Salmonella lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định số đặc tính sinh vật hoá học chủng vi khuẩn phân lập biện pháp phòng trị Kết nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội tr 171-176 Diệu Linh (2012) Trên 32% thịt tươi sống nhiễm khuẩn Sở y tế Hà Nội Truy cập ngày 22/08/2016 tạihttp://www.soyte.hanoi.gov.vn/Default.aspx?u=dt&id=6477 Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng Lê Ngọc Mỹ (1995) Bệnh đường tiêu hóa lợn Nhà xuất Nơng nghiệp tr 63- 96 Đỗ Đức Diên (1999) Vai trò E coli Salmonella hội chứng tiêu chảy lợn Kim Bảng (Hà Nam) thử nghiệm số giải pháp phòng trị Luận án thạc sĩ nông nghiệp Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Văn Thị Hường, Đào Thị Hảo, Nguyễn Xuân Huyên Nguyễn Bạch Huệ (2006) Đánh giá tình hình nhiễm số loại vi khuẩn gây bệnh thịt tươi địa bàn Hà Nội.Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập 13(3) tr 48-54 Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên Đỗ Thị Lan Phương (2003).Xác định số yếu tố gây bệnh Salmonella Typhimurium phân lập từ lợn bị tiêu chảy số tỉnh miền núi phía Bắc.Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y Tập tr 33-37 10 Đỗ Trung Cứ (2004) Phân lập xác định yếu tố gây bệnh Salmonella lợn số tỉnh miền núi phía Bắc biện pháp phịng trị Luận án tiến sĩ nông nghiệp Viện Thú y Quốc gia 57 11 Hoàng Hoài Phương, Nguyễn Thị Kê, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn Thị Anh Đào Trần Thị Ngọc Phương (2008) Khảo sát gen kháng kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh.Tập 12(4) 12 Laval A (2000) Dịch tễ Salmonellosis Báo cáo hội thảo bệnh lợn Viện Thú y Quốc gia Trần Thị Hạnh Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội 13 Lê Minh Sơn (2003) Nghiên cứu số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn Sông Hồng Luận án tiến sĩ nông nghiệp Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam 14 Lê Văn Tạo Nguyễn Thị Vui (1994) Phân lập định typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn Tạp chí nơng nghiệp cơng nghiệp thực phẩm Tập 11 tr 430-431 15 Minh Thùy (2016) Gần 1.400 người bị ngộ độc thực phẩm tháng đầu năm Chất lượng Việt Nam Truy cập ngày 7/9/2016 từ http://vietq.vn/ngo-docthuc-pham-gan-1400-nguoi-mac-chi-trong-4-thang-dau-nam-d90443.html 16 N.B (2012) Nghiên cứu vi khuẩn Salmonellakháng kháng sinh thịt lợn Cổng thông tin điện tử Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Truy cập ngày 23/08/2016 tạihttp://wcag.mard.gov.vn/pages/news_d etail aspx?NewsId=24565 17 Nguyễn Bá Hiên (2001) Một số vi khuẩn đường ruột thường gặp biến động chúng gia súc khỏe mạnh bị tiêu chảy nuôi vùng ngoại thành Hà Nội Luận án tiến sĩ nông nghiệp.Đại học Nông nghiệp I Hà Nội 18 Nguyễn Như Thanh (2001) Vi sinh vật Thú y Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 19 N.P.D-NASATI R (2016) Xác định chất xúc tác quan trọng cho khả kháng kháng sinh Báo điện tử Dân trí Truy cập ngày 01/12/2016 http://dantri.com.vn/khoa-hoc-cong-nghe/xac-dinh-chat-xuc-tac-quan-trong-chokha-nang-khang-khang-sinh-20161111063752321.htm 20 Nguyễn Thị Hoa Lý (1998).Một số loại vi khuẩn gây bệnh chủ yếu sữa tươi Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập (1) tr 21 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú Nguyễn Thị Sở (1989) Kết điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột số sở chăn nuôi lợn.Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1985-1989 Viện Thú y Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội tr 50-53 22 Nguyễn Thượng Chánh (2004) Hiện tượng kháng kháng sinh Trách nhiệm cá nhân tập thể Truy cập ngày http://www.advite.com/hientuongkhangkhangsinh.htm 58 25/10/2016 23 Nguyễn Văn Lãm (1968) Chế vacxin phó thương hàn lợn Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1968-1978 Nhà xuất Nông nghiệp tr 250-289 24 Nguyễn Vĩnh Phước (1970) Vi sinh vật học thú y Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội 25 Nhật Vy (2016).Sử dụng kháng sinh chăn nuôi vô tội vạ.Báo điện tử Nông nghiệp Việt Nam Truy cập ngày 30/08/2016 tạihttp://nongnghiep.vn/su-dungkhang-sinh-trong-chan-nuoi-vo-toi-va-post160040.html 26 Phạm Thị Giang (2006) Thuốc dùng cho vật ni, thủy sản có ảnh hưởng đến sức khỏe người? Báo Sức khỏe đời sống, Truy cập ngày 25/10/2016 http://www.thuoc.net.vn/mobile/Default.aspx?Mod=ViewNews&NewsID=1828 27 Phùng Thị Ánh Mai (2013) Đánh giá tình trạng nhiễm vi khuẩn điểm vệ sinh thực phẩm thịt lợn số sở giết mổ địa bàn tỉnh Vĩnh Phúc đề xuất giải pháp khắc phục Luận văn thạc sĩ Đại học Nông nghiệp Hà Nội 28 Phùng Quốc Chướng (1995) Tình hình nhiễm Salmonella lợn vùng Tây Nguyên khả phịng trị Luận án phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp.Đại học Nông nghiệp I Hà Nội 29 Tạ Thị Vịnh Đặng Khánh Vân (1996) Bước đầu thăm dò xác định E.coli Salmonella lợn bình thường lợn mắc hội chứng tiêu chảy Hà Tây Hà Nội Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y Tập tr 41-44 30 Thanh Hà (2014) Vacxin tái tổ hợp bảo vệ gà phòng chống Salmonella Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Truy cập ngày 23/08/2016 tạihttp://www.vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/trong-nuoc/2100-vacxin-taito-hop-bao-ve-ga-phong-chong-salmonella 31 Tô Liên Thu (2005) Ngiên cứu tình trạng nhiễm số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ Hà Nội số phương pháp làm giảm nhiễm khuẩn thịt Luận án tiến sĩ nông nghiệp Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội 32 Trần Thị Hạnh (1999) Tình hình nhiễm Salmonella mơi trường chăn nuôi gà công nghiệp sản phẩm chăn nuôi Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập (1) tr 6-12 33 Trần Thị Hạnh, Nguyễn Tiến Thành, Ngô Văn Bắc, Trương Thị Hương Giang Trương Thị Quý Dương (2009) Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp sở giết mổ lợn công nghiệp thủ công Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập 16 (2) tr 51-56 59 34 Trần Xuân Hạnh (1995) Phân lập giám định vi khuẩn Salmonella lợn tuổi giết thịt Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập (3) tr 89 35 Trương Hà Thái, Nguyễn Thị Lan, Takuya Hirai Ryoji Yamaguchi (2012) Antimicrobial resistance in Salmonella serovars isolated from meat shops at the markets in North Vietnam, Foodborne pathogens and disease Tập 9(11) tr 986-991 36 Võ Thành Thìn, Lưu Thị Nguyệt Minh, Lê Đinh Hải, Nguyễn Ngọc Nhiên Vũ Khắc Hùng (2011) Phân tích số gen kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập 18 (3) tr 20-25 37 Võ Thị Bích Thuỷ (2003).Nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn Salmonella spp thịt bò, thịt lợn, thịt gà Phân loại định typ vi khuẩnS.typhimurium S.enteritidis Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Đại học Nông nghiệp I Hà Nội 38 Yên Lâm Phúc (2011) Tại vi khuẩn biết kháng thuốc Báo điện tử Sức khỏe đời sống Truy cập ngày 27/09/2016 http://suckhoedoisong.vn/tai-sao-vi-khuanbiet-khang-thuoc-n41459.html Tiếng Anh: 39 Adesiji Y.O., V.K Deekshit, and I Karunasagar (2014) Antimicrobial-resistant genes associated with Salmonella spp isolated from human, poultry, and seafood sources Food Sci Nutr Vol 2(4) pp 436–442 40 Asai T., Y Otagiri, T.Osumi,T Namimatsu,H Hirai, and S Sato (2002) Isolation of Salmonella from diarrheic feces of pigs.J Vet Med Sci Vol64(2) pp.159-160 41 Barnes D.M andD.K Sorensen (1975) Salmonellosis Diseases of swine 4th ed Iowa State University press pp 12-18 42 Bauer A.W., W.M.N Kirby, and J.L Sherries (1996) Antibiotics susceptibility testing a standard disc method American Journal of Clinical Pathology Vol 45 pp 493-496 43 Blickwede M and S Schwarz (2004) Molecular analysis of florfenicol-resistant Escherichia coli isolates from pigs J Antimicrob Chemother Vol 53 pp.58-64 44 Bratu S., M Mooty, S Nichani, D Landman, C Gullans, B Pettinato, U Karumudi, P Tolaney, and J Quale (2005) Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, New York: epidemiology and recommendations for detection Antimicrob Agents Chemother Vol 49(7) pp 3018-3020 60 45 BrowkaJ.(1989) Results of slaungter animals and meat inspection Fleischwirtischaft pp 69-99 46 Bryan F L and M P Doyle (1995) Health Risks and Consequenses of Salmonella andCampylobacter jejuni in Raw Poultry Journal of Food Protection Vol 58 pp 326-344 47 Chen S., S Zhao, D.G White, C.M Schroeder, R Lu, H Yang, P.F McDermott, S Ayers, and J Meng (2004) Characterization of multiple-antimicrobial-resistant Salmonella serovars isolated from retail meats Appl environ microbiol Vol 70(1) pp 1–7 48 Chiu C.H and J.T Ou (1996) Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culturemultiplex PCR combination assay.J Clin Microbiol Vol 34(10) pp 2619–2622 49 CIRAD (2006) Training Course “Salmonella”.pp 23 – 37 50 Crosa J.H., D.J Brenner, W.H Ewing,andS Falkow (1973) Molecular relationships among the Salmonelleae J Bacteriol Vol 115(1) pp.307-315 51 Euzéby J.P (1999) Revised Salmonella nomenclature: designation of Salmonella enterica (ex Kauffmann and Edwards 1952) Le Minor and Propoff 1987 sp nov., nom rev as the neotype species of the genus Salmonella Lignieres 1900 (Approved Lists 1980), rejection of the name Salmonella choleraesuis (Smith 1894) Weldin 1927 (Approved Lists 1980), and conservation of the name Salmonella typhi (Schroeter 1886) Warren and Scott 1930 (Approvied Lists 1980) Request for an opinion Int J Sist Bacteriol Vol 49 pp.927-930 52 FAO (1992) Manual of food quality control Rew.1.1 Microbiologial analysis Published by Food an Agriculture organization of United Nations Rome Editor Dr.Andrews 53 FarmerJ.J (1995) Enterobacteriaceae: Introduction and identification pp 438-449, In P.R Murray,E.J Baron, and M.A Pfaller(ed.).Manual of Clinical Microbiology 6thed American Society for Microbiology, Washington, D C 54 FinlayB.B and Falkow (1988) Virulence factors associated with Salmonella species.Microbiological Sciences Vol 5(11) 55 Gibb A.P., C.S Lewin, and O.J Garden (1991) Development of quinolone resistance and multiple antibiotie resistance in Salmonella sp Bovis morbifucans in a panereatie abscess Journal of Antimierobiological chemothepary 28 pp 318 -321 61 56 Henrry F.J (1999) Combatting childhood diarrhoea thoungh international collaborative reseach Journal of Diarhoea Diseases Reseach.pp 165-167 57 Hendriksen R.S., Aroon Bangtrakulnonth, Chaiwat Pulsrikarn, Srirat Pornreongwong, Henrik Hasman, Si Wook Song, and F.M Aarestrup (2008) Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Salmonella Rissen from animals, food products and patients in Thailand and Denmark.Foodborne pathogens and disease pp 605-619 58 Humphrey T (2000) Public health aspects of Salmonella infection pp 245-262 Wray C and A Wray (ed.).Salmonella in Domestic Animals CABI Publishing, Wallingford,Oxon, UK 59 Khakhria R and W Johnson (1995) Prevalence of Salmonella serotypes and phage types in Canada Southeast Asian J Trop Med Public Health.Vol 26(Suppl 2) pp.42-44 60 Kim E andT Aoki (1996) Sequence analysis of the florfenicolresistance gene encoded in the transferableR-plasmid of a fish pathogen Pasteurella piscicida Microbiology and Immunology Vol pp 665–669 61 Kishima M., I Uchida, T.Namimatsu, T Osumi, S Takahashi,K Tanaka, H Aoki, K Matsuura, andK Yamamoto (2008) Nationwide surveillance of Salmonella in the faeces of pigs in Japan Zoonoses Public Health Vol 55 pp 139-144 62 Lindner E K (1986) Veterinar mikrobiologischer kurs Gustav Fischer Verlay Jena pp.148 63 Liu Y.Y., Y Wang, T R Walsh, L X Yi, R Zhang, J Spencer, Y Doi, G Tian, B Dong, X Huang, L F Yu, D Gu, H Ren, X Chen, L Lv, D He, H Zhou, Z Liang, J H Liu, and J Shen (2016) Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study Lancet Infect Dis Vol 16(2) pp 161-168 64 Ma M., H Wang, Y Yu, D Zhang,andS Liu (2007) Detection of antimicrobial resistance genes of pathogenic Salmonella from swine with DNA microarray J Vet Diagn Invest Vol 19(2) pp.161-167 65 Navon -Venezia S., A Leavitt, M J Schwaber, J K Rasheed, A Srinivasan, J B Patel, Y Carmeli; and Israeli KPC Kpn Study Group (2009) First report on a hyperepidemic clone of KPC-3-producing Klebsiella pneumoniae in Israel genetically related to a strain causing outbreaks in the United States.Antimicrob 62 Agents Chemother.Vol 53(2) pp 818-820 66 Plonait H and Bickhardt (1997) Salmonella infectionand Salmonella lehrbuchder Schweine Krankheiten Parey Buchverlag Berlin pp 334 – 338 67 Plumb D (2002) Veterinary Drug Handbook 4th ed Iowa State Press, Ames, IA 68 Pornsukarom S., P Patchanee, M Erdman, P.F Cray, T Wittum, , J Leeand W A Gebreyes (2015) Comparative phenotypic and genotypic analyses of Salmonella Rissen that originated from food animals in Thailand and United States Zoonoses Public Health Vol62(2) pp.151-158 69 Quinn P.J, M.E Carter, B.Makey and G.R Carter (2004) Clinical veterinary microbiology Wolfe Pulishing London WC1 H9LB England pp 209-236 70 Roberts M.C (2005) Update on acquired tetracycline resistance genes FEMS Microbiol Lett 245 pp 195–203 71 ScienceHowstuffworks (2001) How bacteria become resistant to antibiotics? Retrieved on December 2016 athttp://science.howstuffworks.com/environmental/life/cellularmicroscopic/question561.htm 72 Selbitz H.J (1995) Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren Berl Much, Tieruzl Wschr Vol 144 pp 428-423 73 Speer B.S., N.B Shoemaker and A.A Salyers (1992) Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance Clin Microbiol Rev Vol (4) pp 387-399 74 Stephen G.H (1991) Pullorum diseases Diseases of poultry 8th ed pp.65-79 75 Su L.H., C.H Chiu, A.J Kuo, J.H Chia, C.F Sun, H.F Leu and T.L Wu (2001) Secular trends in incidence and antimicrobial resistance among clinical isolates of Salmonella at a university hospital in Taiwan, 1983–1999 Epidemiol Infect Vol 127 pp 207-213 76 Teale C.J., S Cobb, P.K Martin and G Dr Watkin, (2002) VLA antimicrobial sensitivity report St clements House.pp 52-62 77 Thai T.H and R Yamaguchi (2012) Molecular characterization of antibioticresistant Salmonella isolates from retail meat from markets in Northern Vietnam Journal of Food Protection Vol 75(9) pp 1709-14 78 Threlfall J (1999) Advisory committee’s report on microbial antibiotic resistance 63 and food safety in the United Kingdom Euro Surveill Vol 3(35) pp.1343 Retrieved on 24 October 2016 at http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=1343 79 Threlfall E.J (2002) Antimicrobial drug resistance in Salmonella: problems and perspectives in food- and water-borne infections Retrieved on 25 October 2016 at http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6976.2002.tb00606.x 80 Timoney J.F., J.H Gillespie, J.E Baelough, Hagan and Bruner’s (1988) Microbiology and infection disease of domentic animals, Inthca and London Comstock Publising Associates A Division of cornell University press pp 209-230 81 Ventola C L (2015) The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats P T Vol 40(4) pp 277-283 82 Wilcock B.P and K Schwartz (1992) Salmonellosis Disease of swine 7th ed pp 570-583 83 Williams J.E.(1984) Psychorotrophy infection-Disease of puoltry 8th ed pp 91-129 84 Yigit H., A M Queenan, G J Anderson, A Domenech-Sanchez, J W Biddle, C D Steward, S Alberti, K Bush, and F C Tenover (2001) Novel carbapenemhydrolyzing β-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae Antimicrob Agents Chemother Vol 45(4) pp 1151–1161 85 Yong D., M A Toleman, C G Giske, H S Cho, K Sundman, K Lee, T R Walsh (2009) Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India Antimicrob Agents Chemother Vol 53 (12) pp 5046–5054 86 Zaidi M.B., P.F McDermott, Paula Fedorka-Cray, Verónica Leon, Claudia Canche, S.K Hubert, Jason Abbott, Magda León, Shaohua Zhao, Marcia Headrick and Linda Tollefson (2006) Nontyphoidal Salmonella from human clinical cases, asymptomatic children, and raw retail meats in Yucatan, Mexico Clinical Infectious Diseases Vol 42(1) pp 21-28 87 Zhao S., D.G White, B Ge, S Ayers, S Friedman, L English et al (2001) Identification and characterization of integron-mediated antibiotic resistance among Shiga toxin producing Escherichia coli isolates Appl Environ Microbiol Vol67 pp 1558–1564 64 ... lược định hướng sử dụng kháng sinh chăn ni Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: ? ?Xác định gen kháng thuốc chủng vi khuẩn Salmonella đa kháng thuốc phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội? ??... kháng sinh vi khuẩn salmonella phân lập 39 4.3 Kết định typ chủng vi khuẩn salmonella đa kháng phân lập .43 4.4 Kết phát đánh giá gen kháng thuốc chủng Salmonella đa kháng phân lập. .. TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định có mặt mức độ biểu số gen kháng thuốc chủng Salmonella gây bệnh phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội - Cảnh báo tượng kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella gây