Xác định kiểu cách cư trú và gen độc lực của staphylococcus aureus ở nhóm người làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ KHÁNH TRÂM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hà Nội - 2013 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ KHÁNH TRÂM Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 62720115 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS ĐINH HỮU DUNG PGS TS NGUYỄN VŨ TRUNG Hà Nội - 2013 Lời cám ơn Để hoàn thành luận án này, nhận nhiều giúp đỡ thày cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Hữu Dung, PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, người thày trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Văn Phủng, Trưởng Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS Nguyễn Thị Vinh, TS Phạm Hồng Nhung, TS Lê Văn Duyệt, ThS Văn Đình Tráng hướng dẫn đóng góp cho tơi ý kiến quý báu suốt trình học tập, nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn CN Nguyễn Thị Minh Thư, CN Vũ Thị Hồ Vân, KTV Lê Thị Hải, KTV Phạm Thị Vinh, người giúp đỡ tận tình trình thực nghiên cứu Tôi xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo Sau đại học, thày giáo Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội trang bị kiến thức, tạo điều kiện, giúp đỡ cho thời gian học tập trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám đốc Bệnh viện Bạch Mai, Ban Lãnh đạo tập thể Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện động viên học tập tốt Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Tập thể khoa xét nghiệm Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương, Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội, Trung tâm Y tế Quận Đống Đa, nhân viên sở dịch vụ ăn uống tham gia nghiên cứu, giúp đỡ thực nghiên cứu, thu thập số liệu phục vụ luận án Tôi vô biết ơn người thân gia đình bạn bè thân thiết động viên, hỗ trợ tinh thần vật chất suốt trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2013 Lê Khánh Trâm CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu tơi chủ trì thực hướng dẫn PGS.TS Đinh Hữu Dung PGS.TS Nguyễn Vũ Trung Các số liệu luận án trung thực kết nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Lê Khánh Trâm MỤC LỤC Lời cam đoan Mục lục Chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH THƢỜNG 1.1.1 Khái niệm vi hệ 1.1.2 Các vi hệ ngƣời 1.1.3 Vai trò vi hệ với sức khỏe 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA S AUREUS .5 1.2.1 Lịch sử phát phân loại 1.2.2 Tính chất sinh học S aureus 1.2.3 Đặc điểm di truyền S aureus 1.3 TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S AUREUS .7 1.3.1 Tỷ lệ mang 1.3.2 Đặc điểm kiểu cách cƣ trú 1.4 CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA S AUREUS 11 1.4.1 Các yếu tố độc lực thành phần cấu trúc tế bào 11 1.4.2 Các yếu tố độc lực sản phẩm ngoại tiết 12 1.4.3 Các yếu tố độc lực khác 15 1.5 CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S AUREUS 16 1.5.1 Gen mã hoá coagulase S aureus 17 1.5.2 Các gen mã hoá cho độc tố ruột S aureus 19 1.6 CÁC BỆNH DO S AUREUS GÂY RA 21 1.6.1 Nhiễm khuẩn ngồi da mơ mềm 21 1.6.2 Hội chứng da phồng rộp 21 1.6.3 Viêm tủy xƣơng 21 1.6.4 Viêm khớp 22 1.6.5 Viêm nội tâm mạc 22 1.6.6 Nhiễm khuẩn huyết 22 1.6.7 Viêm phổi 22 1.6.8 Ngộ độc thực phẩm viêm ruột cấp 23 1.6.9 Hội chứng sốc nhiễm độc 24 1.6.10 Nhiễm trùng bệnh viện S aureus 24 1.7 CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH S AUREUS TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM .24 1.7.1 Các kỹ thuật thông thƣờng xác định S aureus 24 1.7.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 26 1.8 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ VÀ GEN ĐỘC LỰC CỦA S AUREUS 32 1.8.1 Các nghiên cứu giới 32 1.8.2 Các nghiên cứu Việt Nam 35 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 38 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu tỷ lệ mang kiểu cách cƣ trú S aureus 38 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu phân bố gen độc lực S aureus 38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 38 2.2.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 38 2.2.3 Phƣơng pháp thu thập số liệu 40 2.3 VẬT LIỆU 40 2.3.1 Thiết bị 40 2.3.2 Hóa chất 41 2.4 CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU 42 2.4.1 Lấy mẫu 42 2.4.2 Phân lập, xác định S aureus 43 2.4.3 Lƣu giữ chủng 46 2.4.4 Quy trình PCR xác định gen độc lực 46 2.4.5 Kỹ thuật sequencing xác nhận kết phản ứng PCR 53 2.5 CÁCH KHỐNG CHẾ SAI SỐ 55 2.6 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ KIỂU CÁCH MANG S AUREUS 56 2.7 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 56 2.8 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 56 2.9 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 57 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.1 TỶ LỆ MANG, KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S AUREUS 58 3.1.1 Một số đặc điểm đối tƣợng nghiên cứu 58 3.1.2 Tỷ lệ mang S aureus số yếu tố liên quan 60 3.1.3 Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S aureus mũi số yếu tố liên quan 66 3.1.4 Tỷ lệ mang S aureus tay số yếu tố liên quan 69 3.1.5 Tỷ lệ mang S aureus mũi tay 72 3.1.6 Tỷ lệ mang S aureus mũi tay 73 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S AUREUS 74 3.2.1 Kết nghiên cứu gen mã hóa coagulase S aureus 75 3.2.2 Kết nghiên cứu gen mã hóa độc tố ruột S aureus 79 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 85 4.1 TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S AUREUS .85 4.1.1 Một số đặc điểm đối tƣợng nghiên cứu 85 4.1.2 Tỷ lệ mang S aureus chung số yếu tố liên quan 86 4.1.3 Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S aureus mũi số yếu tố liên quan 90 4.1.4 Tỷ lệ mang S aureus tay số yếu tố liên quan 96 4.1.5 Tỷ lệ mang S aureus mũi tay 100 4.1.6 Tỷ lệ mang S aureus mũi tay 101 4.2 CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S AUREUS 102 4.2.1 Gen mã hóa coagulase 103 4.2.2 Gen mã hóa độc tố ruột S aureus 107 KẾT LUẬN 115 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 116 ĐỀ XUẤT…………… 117 CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA NGHIÊN CỨU SINH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHỮ VIẾT TẮT A: Adenine bp: Base pair (cặp bazơ) C: Cytosine DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotid triphosphate ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzyme) EFT: Exfoliatin toxin G Guanine MLST: Multi-locus sequence typing (Giải trình tự gen nhiều locus) MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng methicillin) PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi) RFLP: Restriction fragment length polymorphism (Kỹ thuật xác định tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) SE: Staphyloccocal enterotoxin (Độc tố ruột tụ cầu) T: Thymine TNF: Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử u) TSST: Toxic shock syndrome toxin (Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc điểm các loại dung huyết tố S aureus 14 Bảng 1.2: Vị trí di truyền số gen sinh độc tố ruột S aureus 20 Bảng 2.1: Trình tự mồi gen se 51 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR dùng cho cặp mồi SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SIE, SEJ 52 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR dùng cho cặp mồi SEG 52 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ống chuẩn 53 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng ống chứa mẫu 54 Bảng 2.6: Chu trình nhiệt phản ứng PCR sequence 55 Bảng 2.7: Tiêu chuẩn xác định kiểu cách cƣ trú S aureus 56 Bảng 3.1: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới 58 Bảng 3.2: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo nhóm tuổi 58 Bảng 3.3: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo vị trí làm việc 59 Bảng 3.4: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo thâm niên công tác 59 Bảng 3.5 Phân bố chủng S aureus theo lần vị trí lấy mẫu 53 nhân viên có mẫu dƣơng tính 60 Bảng 3.6: Phân bố tỷ lệ mang S aureus theo số lần lấy mẫu 62 Bảng 3.7: Phân bố tỷ lệ mang S aureus lần lấy mẫu 62 Bảng 3.8: Tỷ lệ mang S aureus theo giới 63 Bảng 3.9: Tỷ lệ mang S aureus theo nhóm tuổi 64 Bảng 3.10: Tỷ lệ mang S aureus theo vị trí làm việc 64 Bảng 3.11: Tỷ lệ mang S aureus theo thâm niên công tác 65 Bảng 3.12: Tỷ lệ mang kiểu cách cƣ trú S aureus mũi theo nhóm tuổi 67 Bảng 3.13: Tỷ lệ mang kiểu cách cƣ trú S aureus mũi theo thâm niên công tác 69 Phụ lục 1b DANH SÁCH NHÂN VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Họ tên STT Tuổi Phạm Hữu T 18 Nguyễn Thị T 20 Nguyễn Trọng B 20 Nguyễn Thị M 19 Phạm Đức M 27 Lê Tất T 32 Hà Quốc V 23 Thái Duy H 18 Đinh Thúy H 18 10 Phạm Văn K 18 11 Nguyễn Văn L 22 12 Nguyễn Thị T 18 13 Phạm Thị X 19 14 Bùi Thế K 18 15 Hoàng Văn Q 18 16 Nguyễn Thế D 26 17 Trần Văn H 22 18 Đinh Quang T 22 19 Hà Văn D 26 20 Đào Ngọc D 27 21 Trần Bích T 25 22 Nguyễn Thị H 22 23 Hồng Thị Đ 26 24 Cù Diệu L 29 Họ tên STT Tuổi 25 Phạm Thanh T 30 26 Nguyễn Anh T 29 27 Nguyễn Danh Q 26 28 Vũ Ngọc H 26 29 Dƣơng Tuấn M 31 30 Nguyễn Thị H 43 31 Đỗ Duy H 20 32 Đỗ Hà T 36 33 Phƣơng Văn P 43 34 Phạm Thanh H 25 35 Tạ Thị T 45 36 Nhâm Văn H 53 37 Huỳnh Tuyết N 40 38 Trần Thị Lan A 37 39 Lê Thị L 22 40 Nguyễn Diệu C 26 41 Nguyễn Thị H 24 42 Trần Vân A 33 43 Đinh Thị H 28 44 Trƣơng Thế M 21 45 Lê Hồng H 26 46 Nguyễn Thanh P 22 47 Cao Sơn L 24 48 Đặng Thị O 28 49 Đào Thị H 22 50 Nguyễn Thị H 20 51 Trịnh Thị M 24 52 Đào Thị T 27 Họ tên STT Tuổi 53 Trần Văn H 19 54 Hà Thị H 29 55 Trần Xuân H 22 56 Đỗ Văn H 22 57 Nguyễn Thị M 20 58 Vũ Thị M 20 59 Nguyễn Thị H 22 60 Ngơ Hồng C 18 61 Nguyễn Thị Lan A 19 62 Hoàng Thị X 19 63 Dƣơng Thị H 25 64 Trần Thị X 23 65 Lƣơng Trọng Đ 21 66 Hoàng Hồng H 23 67 Nguyễn Văn Đ 21 68 Nguyễn Thị T 19 69 Nguyễn Trọng T 29 70 Phạm Văn Đ 30 71 Phạm Khắc Đ 25 72 Đoàn Thị U 18 73 Trần H 24 74 Đào Thị T 22 75 Khang Văn T 23 76 Lê H 23 77 Nguyễn Văn T 21 78 Lê Thị H 21 79 Nguyễn Thị P 23 80 Nguyễn Văn H 18 Họ tên STT Tuổi 81 Nguyễn Thị H 19 82 Phạm Thị H 22 83 Nguyễn Thị N 22 84 Hoàng Thị T 22 85 Nguyễn Thị T 23 86 Bùi Thị H 22 87 Phạm Thị H 25 88 Dƣơng Thị H 24 89 Nguyễn Thị M 20 90 Nguyễn Thị H 23 91 Lê Văn T 19 92 Trƣơng Bảo T 28 93 Nguyễn Thị H 32 94 Vũ Kiều A 22 95 Lê Thị H 37 96 Phạm Thanh H 23 97 Từ Hữu T 22 98 Phạm Trung H 24 99 Nguyễn Quang P 18 100 Bùi Văn H 24 101 Lê Văn C 21 102 Vũ Văn N 19 103 Đào Thị N 24 104 Nguyễn Thị V 20 105 Nguyễn Văn D 24 106 Nguyễn Thị X 18 107 Mai Thế T 21 108 Lâm Quang V 29 Họ tên STT Tuổi 109 Nguyễn Văn T 22 110 Mai Ngọc H 28 111 Mai Thị K 40 112 Mạc Thị H 38 113 Phạm Thị S 50 114 Nguyễn Khắc V 18 115 Lê Thị H 22 116 Nguyễn Văn Q 20 117 Nguyễn Viết Q 20 118 Nguyễn Văn T 18 119 Nguyễn Văn C 24 120 Quách Văn P 20 121 Phạm Thanh T 19 122 Trần Nam Q 27 123 Phạm Thị C 27 124 Hoàng Phƣơng T 21 125 Phạm Thị L 50 126 Nguyễn Thị T 23 127 Nguyễn Thị N 20 128 Phạm Văn H 23 129 Lê Thanh T 19 130 Nguyễn Thế A 18 131 Nguyễn Phúc L 23 132 Phạm Minh Đ 30 133 Dƣơng Đình A 21 134 Nguyễn Thị H 31 135 Trần Văn T 21 136 Trần Thị H 26 Họ tên STT Tuổi 137 Viên Đình T 21 138 Ngơ Văn T 26 139 Nguyễn Thị K 44 140 Bùi Tiến N 24 141 Nguyễn Chí H 21 142 Trần Thị T 21 143 Hoàng Quốc V 30 144 Lê Văn H 40 145 Nguyễn Thành T 20 146 Nguyễn Văn H 22 147 Phùng Thị H 24 148 Phạm Thị H 23 149 Nguyễn Văn D 25 150 Nguyễn Thị T 25 151 Thái Minh T 22 152 Lý Văn X 28 153 Phạm Tiến T 22 154 Nguyễn Xuân V 24 155 Phạm Mạnh C 18 156 Vũ Thị H 18 157 Trần Thị T 18 158 Phùng Xuân M 20 159 Nguyễn Tiến Đ 21 160 Vũ Cơng K 30 161 Hồng Gia V 34 162 Nguyễn Thị H 23 163 Nguyễn Thị N 19 164 Lƣu Văn H 20 Họ tên STT Tuổi 165 Hoàng Duy T 20 166 Vũ Đức C 20 167 Trần Sỹ Đ 19 168 Nguyễn Công N 19 169 Nguyễn Văn L 18 170 Nguyễn Thị H 22 171 Nguyễn Văn H 18 172 Nguyễn Thị O 20 173 Nguyễn Thị V 20 174 Vũ Thị H 18 175 Hoàng Văn Q 20 176 Nguyễn Thị L 21 177 Phùng Văn L 23 178 Trần Thị Đ 19 179 Lê Quang G 26 180 Lê Văn T 20 181 Mầu Tiến T 27 182 Hoàng Thị T 20 183 Tào Văn T 24 184 Nông Hồng H 34 185 Lê Thị N 19 186 Lƣu Thị Q 28 187 Trần Thị T 48 188 Nguyễn Thị C 23 189 Đỗ Văn L 37 190 Dƣơng Thị H 25 191 Phạm Xuân T 45 192 Phạm Ngọc A 50 Họ tên STT Tuổi 193 Đinh Hải N 18 194 Vũ Văn T 18 195 Nguyễn Bá Đ 18 196 Phạm Văn K 23 197 Nguyễn Thị V 23 198 Nguyễn Thị T 24 199 Trần Ngọc H 22 200 Giang Thị H 27 201 Phùng Duy C 28 202 Lê Thị T 19 203 Lê Ngọc H 23 204 Phan Thị H 19 205 Nguyễn Đăng T 18 206 Phạm Thanh H 27 207 Nguyễn Thị H 23 208 Vũ Thị H 25 209 Nguyễn Thị L 20 210 Nguyễn Văn L 27 211 Nguyễn Văn K 21 212 Nguyễn Văn N 21 PHỤ LỤC PHIẾU ĐIỀU TRA NHÂN VIÊN LÀM VIỆC TẠI CÁC CƠ SỞ ĂN UỐNG Tên sở: I Thông tin chung Mã số: Họ tên: Tuổi: Nơi làm việc: Thâm niên làm việc sở ăn uống Vị trí lấy mẫu: Mũi Tay Lần lấy mẫu: Lần Lần Giới: Nam Lần Nữ Lần II Công việc đảm nhiệm cụ thể Chế biến thức ăn có  khơng  Phân phát thức ăn có  khơng  Phục vụ bàn ăn có  khơng  Rửa, vệ sinh đồ dùng ăn uống có  khơng  Khác: (nêu cụ thể)………………………………………………………… III Tình trạng sức khoẻ Sử dụng kháng sinh vịng ngày có  khơng  Hiện sử dụng thuốc có  khơng  Nếu có nêu cụ thể: …………………………………………………… Tình trạng viêm nhiễm mũi - Chảy nƣớc mũi: có  - Hắt hơi: có  khơng  khơng  - Ngạt mũi: có  khơng  - Thở khị khè: có  khơng  - Thở rít: có  khơng  - Mất mùi: có  khơng  - Đau: có  khơng  - Ngứa: có  khơng  - Rát: có  khơng   Tình trạng viêm nhiễm họng - Sốt: có  khơng  - Ho: có  khơng  - Khạc đờm: có  khơng  - Đau: có  khơng  - Ngứa: có  khơng  - Rát: có  khơng  Tình trạng nhiễm trùng ngồi da (bàn tay) - Mụn, nhọt: có  khơng  - Áp xe, mủ: có  khơng  - Đỏ, thay đổi mầu: có  khơng  - Ngứa: có  khơng  - Đau: có  khơng  - Rát: có  khơng  - Biến dạng móng tay: có  khơng  Bệnh mạn tính có  khơng  Nếu có nêu cụ thể: …………………………………………………… Bệnh khác: (nêu cụ thể)…………………………………………………… Hà Nội, ngày tháng Điều tra viên năm ... cách cƣ trú nghiên cứu gen độc lực vi khuẩn Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài „? ?Xác định kiểu cách cƣ trú gen độc lực Staphylococcus aureus nhóm ngƣời làm việc số sở dịch vụ ăn uống? ?? với... sau: Xác định tỷ lệ mang, kiểu cách cư trú S aureus mũi tay nhóm người làm việc số sở dịch vụ ăn uống Hà Nội Xác định phân bố, tính đa hình gen mã hóa coagulase gen mã hóa độc tố ruột chủng S aureus. .. [61] Tình trạng mang S aureus nhân viên nhà hàng, ngƣời làm sở dịch vụ ăn uống, chế biến tiếp xúc với thức ăn nguy tiềm ẩn gây nên vụ dịch ngộ độc thức ăn S aureus nhiễm thức ăn nhƣ thịt, trứng,