Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại việt nam qua khảo sát các gen ul5 ul32 và dna polymerase

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Hán Thị Hƣơng Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam qua khảo sát gen UL5, UL32 DNA-polymerase Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Lê Thanh Hòa Hà Nội – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Lê Thanh Hòa - Trƣởng phòng Miễn dịch học - Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình học tập hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn TS.Lê Thị Kim Xuyến - phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn NCS.Tạ Hoàng Long - Giám đốc trung tâm kiểm nghiêm thuốc thú y trung ƣơng tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình học tập hồn thành luận văn Em xin cảm ơn hỗ chợ kinh phí đề tài nhánh “Giải mã gen đặc trƣng xây dựng liệu sinh học phân tử chủng virus gia cầm quốc gia” PGS.TS Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dụng danh mục giống virus gia cầm quốc gia” năm 2011 Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y chủ trì nằm “Chƣơng trình công nghệ sinh học Nông nghiệp” Nông nghiệp Phát triển nông thôn Em xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật thầy cô tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tất chú, anh chị phịng Miễn dịch học, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ q trình tiến hành thí nghiệm nhƣ tạo điều kiện để luận văn đƣợc hồn thiện Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ngƣời thân, gia đình bạn bè ln khuyến khích, động viên nhƣ chia sẻ khó khăn với em suốt q trình học tập hồn thành nghiên cứu Học viên Hán Thị Hƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cảm ơn…………………………………………………………………….…….i Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ……………………………… ….…iv Danh mục bảng…………………………………………………………… …v Danh mục hình…………………………………………………………… …vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu bệnh dịch tả vịt virus gây bệnh 1.1.1 Lịch sử địa dƣ bệnh 1.1.2 Đƣờng xâm nhập, cách lây lan chế gây bệnh 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng 1.1.4 Bệnh tích 1.1.5 Vaccine phòng bệnh 1.2 Sinh học phân tử virus dịch tả vịt 11 1.2.1 Cấu trúc hệ gen virus dịch tả vịt 11 1.2.2 Sự nhân lên virus 16 1.3 Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt giới Việt Nam 18 CHƢƠNG 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phƣơng pháp tiếp truyền 21 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 22 2.2.3 Kỹ thuật PCR 23 2.2.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 24 2.2.5 Phƣơng pháp giải trình tự 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu sử dụng phần mềm tin-sinh học 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tiếp truyền virus 28 3.2 Kết thu nhận chuỗi gen nghiên cứu 30 3.2.1 Kết thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase giải trình tự 30 3.2.2 Kết thu nhận chuỗi gen helicase (UL5) giải trình tự 32 3.2.3 Kết thu nhận chuỗi gen kháng nguyên (UL32) giải trình tự 35 3.3 Kết phân tích, so sánh thành phần gen chủng virus dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen UL5 UL32 39 3.3.1 Kết phân tích gen UL5 40 3.3.2 Kết phân tích gen UL32 46 3.4 Bàn luận chung 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC……………………………………………… ………………… 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt bp base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung Da dalton DEV Duck Enteritis Virus Virus gây bệnh dịch tả vịt DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic kDa kilo dalton nm nanometer ORF Open Reading Frame Khung đọc mở RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen UL Unique long Vùng dài US Unique short Vùng ngắn UTR Untranslated region Vùng khơng mã hóa IRS short internal repeat vùng lặp ngắn TRS short terminal repeat vùng lặp ngắn cuối Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR chu trình nhiệt nghiên cứu sinh học phân tử virus dịch tả vịt Bảng 2.2 Các cặp mồi (primer) đƣợc sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Kết tiếp truyền virus cƣờng độc dịch tả vịt vịt 27 Bảng 3.2 Danh sách chủng Dịch tả vịt Việt Nam giới sử dụng phân tích so sánh Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đƣờng chéo) tƣơng đồng amino acid (dƣới đƣờng chéo) gen UL5 Bảng 3.3 chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) 07 chủng DTV giới Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đƣờng chéo) Bảng 3.4 tƣơng đồng amino acid (dƣới đƣờng chéo) gen UL32 chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) 07 chủng DEV giới Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 23 39 44 50 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Triệu chứng vịt bị bệnh dịch tả Hình 1.2 Bệnh tích vịt bị bệnh dịch tả vịt Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian Herpesviruses 11 Hình 1.4 Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt 12 Hình 1.5 Chu trình nhân lên Herpesvirus tế bào vật chủ 18 Hình 3.1 Triệu chứng bệnh tích vịt bệnh dịch tả vịt 28 29 Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thạch agarrose 1% Trình tự gen DNA-polymerase chủng DTVCDKN Hình 3.4 Trình tự gen DNA-polymerase chủng DTVVXKN 31 32 Hình 3.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thạch agarrose 1% Trình tự gen UL5 chủng DTVCDKN Hình 3.7 Trình tự gen UL5 chủng DTVVXKN 34 35 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thạch agarrose 1% Trình tự gen UL32 chủng DTVCĐKN Hình 3.10 Trình tự gen UL32 chủng DTVVXKN 37 Hình 3.2 Hình 3.5 Hình 3.8 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Kết so sánh thành phần nucleotide chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen Helicase (UL5) Kết so sánh thành phần amino acid chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen Helicase (UL5) Kết so sánh thành phần nucleotide chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen kháng nguyên (UL32) Kết so sánh thành phần amino acid chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen kháng nguyên (UL32) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 33 36 42 43 48 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch tả vịt (duck plague) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, gây bệnh cho nhiều loài thuỷ cầm, trƣớc hết loài vịt, ngỗng, ngan, thiên nga, hầu hết lứa tuổi từ vài ngày vài tháng tuổi, chí vịt giống ni hàng năm (Wobeser, 1997), gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi giới nhƣ Việt Nam Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) thành viên họ Herpesviridae, có hệ gen DNA sợi đơi có độ dài khoảng 150-170kb giống nhƣ nhiều loại virus thuộc họ Herpesviridae khác Phân bố thành phần nucleotide hệ gen thiên G+C (Guanine Cytosine), chiếm tỷ lệ 64,3%, cao nhiều so với Herpesvirus khác gia cầm (Gardner cs., 1993) Mặc dù nay, virus gây bệnh dịch tả vịt đƣợc phân nhóm vào dƣới họ Alphaherpesvirinae (Shawky Schat, 2002) nhƣng đặc tính sinh học phân loại học loại virus gặp nhiều vấn đề, nên Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) tạm thời xếp vào nhóm virus chƣa xác định cụ thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet cs., 2005; Liu cs., 2008) Về cấu trúc phân tử, hệ gen DEV chia làm hai vùng gen quan trọng hay gọi vùng độc (unique region, U), bao gồm UL (vùng dài) US (vùng ngắn), bao bọc hai đầu vùng ngắn hai vùng lặp ký hiệu IRS TRS Vì hệ gen virus dịch tả vịt tƣơng đối lớn nên đến có vài hệ gen đƣợc giải mã (Wang cs., 2011), nhiên số hợp phần gen quan trọng đƣợc giải mã phân tích Trong số gen hệ gen virus dịch tả vịt, ngƣời ta thƣờng sử dụng số gen đặc thù để làm thị phân tử chẩn đoán, giám định xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trƣớc hết gen DNA-polymerase (DNA-pol), gen UL32 mã hố cho glycoprotein vỏ hay cịn đƣợc coi gen kháng nguyên (Hansen cs., 2000) gen UL5 (Pan cs., 2008) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cho đến virus dịch tả vịt diễn biến phức tạp gây nhiều ổ dịch khắp địa phƣơng nƣớc Tuy nhiên, Việt Nam lại chƣa có nghiên cứu đầy đủ đặc tính phân tử, nguồn gốc phả hệ, tính tƣơng đồng chủng virus cƣờng độc chủng virus vaccine Xuất phát từ u cầu thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam qua khảo sát gen UL5, UL32 DNA-polymerase” - Đối tƣợng nghiên cứu: - Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu DTVCDKN - Chủng virus nhƣợc độc vaccine Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu DTVVXKN - Mục tiêu đề tài là: Giải mã gen UL5, UL32 DNA-polymerase chủng virus cƣờng độc nhƣợc độc vaccine Việt Nam; phân tích so sánh đặc điểm sinh học phân tử với chủng giới Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn EF417996-U : EF643561-U : 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620 DTVCDKN-UL : GGTCTATTTGATTGCATAGCACCAGTTATAGACACTTGGTCTGAAGGCGAATACGAAGAAATCGCCGACGGCGGTAGGTTTGTAGCCATG DTVVXKN-UL : EU082088-U : JF999965-U : JQ647509-U : NC013036-U : EF203708-U : EF417996-U : EF643561-U : * 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * DTVCDKN-UL : GTAAAAGCTGCCGGCGCAGAAGCAGTTTATAAACATCTTTTTTGCGATCCAATGTGCGCTCTTTGCGAATTGCAGACCAATCCGCGTGTA DTVVXKN-UL : EU082088-U : JF999965-U : JQ647509-U : NC013036-U : EF203708-U : A EF417996-U : EF643561-U : 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 DTVCDKN-UL : TTATTTGACCATCCAACCAAATCGGATCCAGATGCTCTGAACCTATATAAGGCGCATTTGGCGAGCGAAAACCGTTTTGAGGGGCGGATA DTVVXKN-UL : EU082088-U : JF999965-U : JQ647509-U : NC013036-U : EF203708-U : EF417996-U : EF643561-U : * 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * DTVCDKN-UL : TGCGCAGGTTTATGGGCCCTGGCTTATACTTTTAAGACTTATCAGATATTCCCGCCCAAGCCCACCGCATTGGCCTCGTTTATAAGGGAT DTVVXKN-UL : EU082088-U : JF999965-U : JQ647509-U : NC013036-U : EF203708-U : EF417996-U : EF643561-U : 1900 * 1920 * 1940 * 1960 DTVCDKN-UL : GCTGGTCTCCTATTAAGGAAGCATTCAATTTCGCTCGTCTCATTAGAGCACACACTCGGCACCTATGTCTGA : 1962 DTVVXKN-UL : : 1962 EU082088-U : : 1962 JF999965-U : : 1962 JQ647509-U : : 1962 NC013036-U : : 1962 EF203708-U : : 1962 EF417996-U : : 1962 EF643561-U : : 1962 : 1530 : 1530 : : : : : : : : : 1620 1620 1620 1620 1620 1620 1620 1620 1620 : : : : : : : : : 1710 1710 1710 1710 1710 1710 1710 1710 1710 : : : : : : : : : 1800 1800 1800 1800 1800 1800 1800 1800 1800 : : : : : : : : : 1890 1890 1890 1890 1890 1890 1890 1890 1890 Hình 3.13 Kết so sánh thành phần nucleotide chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen kháng nguyên (UL32) Ghi chú: Dấu (.) biểu thị giống với nucleotide chủng DTVCDKN (dịch tả vịt cƣờng độc Việt Nam); sai khác chủng so với chủng DTVCDKN biểu thị ký hiệu nuleotide (1 chữ cái) chúng DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : * 20 * 40 * 60 * 80 * MASRSLHVDSTRSMARFAEEVPSTDGEGWTSGALDADYCAFDPSLLATNERLCDELMFAAHLMSVPNETATEVRDENRDDINPASDNLLV 100 * 120 * 140 * 160 * 180 PDLAAFVEASADAFALDRSCLVCRLIDTYKKKFGLTSQWIADYAMLCNKCLAAPPCATTTFIAAFELVYIMDKHFLATHRTTLTGSFARR * 200 * 220 * 240 * 260 * Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên : : : : : : : : : 90 90 90 90 90 90 90 90 90 : : : : : : : : : 180 180 180 180 180 180 180 180 180 http://www.lrc-tnu.edu.vn DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : DTVCDKN-UL DTVVXKN-UL EF082088-U JF999965-U JQ647509-U NC013036-U EF203708-U EF417996-U EF643561-U : : : : : : : : : VLTLNDVQRHFFLHGCCRTDGGIPGSTSSMNQPLESTNTRITSPMVQARTSRSTKVLFSNYSFLAQTAIRTMLMTLADNSSNDVQNNGTQ : T : T : T : T : T : T : : T : 280 * 300 * 320 * 340 * 360 RTNYYSSGHHSTLTALPGQPSLAAALAGWKECAKHVECHGSAASRSGVGQKDSCATLAYVDDDAFEMHEELRLERERERAKSHSMYARPK : : : : : : : : : * 380 * 400 * 420 * 440 * RLATRSKPARDENGATRVHGTGPSEQAHREDWAYADLTLLLLVGTGAIWELNDTTNTVLLARRNAVARYWRDHKRALARETAPKFSRFAE : : : : : : : : : 460 * 480 * 500 * 520 * 540 NDAEPVTSLGPVLATTLKHTRCKSRTGGECILCNLLPIRTYWLAIRRLKRDIVAHSANNLGLFDCIAPVIDTWSEGEYEEIADGGRFVAM : : : : : : : : : * 560 * 580 * 600 * 620 * VKAAGAEAVYKHLFCDPMCALCELQTNPRVLFDHPTKSDPDALNLYKAHLASENRFEGRICAGLWALAYTFKTYQIFPPKPTALASFIRD : : : : : : .Y : : : 640 * AGLLLRKHSISLVSLEHTLGTYV : 653 : 653 : 653 : 653 : 653 : 653 : 653 : 653 : 653 270 270 270 270 270 270 270 270 270 360 360 360 360 360 360 360 360 360 450 450 450 450 450 450 450 450 450 540 540 540 540 540 540 540 540 540 630 630 630 630 630 630 630 630 630 Hình 3.14 Kết so sánh thành phần amino acid chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen kháng nguyên (UL32) Ghi chú: Dấu (.) biểu thị giống với nucleotide chủng DTVCDKN (dịch tả vịt cƣờng độc Việt Nam); sai khác chủng so với chủng DTVCDKN biểu thị ký hiệu amino acid (1 chữ cái) chúng Kết phân tích cho thấy chủng so sánh có vị trí sai khác thành phần nucleotide: vị trí 746 (T-C); 1044 (G-A); 1685 (G-A) (Hình 3.13) Trong có vị trí sai khác (vị trí 746 1685) dẫn đến vị trí sai khác amino acid: vị trí 249 (I-T) 562 (C-Y) (Hình 3.14) Hai chủng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn virus cƣờng độc vaccine Việt Nam sai khác nucleotide, vị trí 746 (T-C) dẫn đến vị trí sai khác amino acid: vị trí 249 (I-T) 3.3.2.2 Kết phân tích đồng (về nucleotide) tương đồng (về amino acid) gen UL32 chủng virus dịch tả vịt (Việt Nam) với chủng giới Trình tự 1962 nucleotide 09 chủng virus đƣợc đƣa vào chƣơng trình GeneDoc2.5 (Nicholas, Nicholas, 1997) để phân tích mức độ đồng (identity) thành phần nucleotide tƣơng đồng (homology) amino acid Kết đƣợc trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đƣờng chéo) tƣơng đồng amino acid (dƣới đƣờng chéo) gen UL32 chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) 07 chủng DEV giới Chủng 1 99 99 99 99 99 99 100 99 100 99 100 100 99 99 100 99 100 100 99 99 100 99 99 99 99 99 100 99 99 100 99 99 100 99 99 99 99 100 99 100 100 99 100 100 100 99 100 100 100 100 99 99 99 99 99 99 100 99 99 99 99 99 99 99 100 100 100 100 100 99 99 99 Ghi Các chủng DTVCDKN (Việt Nam), DTVVXKN (Việt Nam), 3.EU082088 (Trung Quốc), JF999965 (Đức), JQ647509 (Trung Quốc), NC013036 (Trung Quốc), EF203708 (Trung Quốc), EF417996 (Trung Quốc), EF643561 (Trung Quốc) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Hai chủng virus dịch tả vịt cƣờng độc DTVCDKN chủng virus vaccine DTVVXKN Việt Nam sử dụng nghiên cứu có mức độ đồng nucleotide tƣơng đồng amino acid 99% - So sánh với chủng JF999965 Đức, chủng virus cƣờng độc Việt Nam có mức độ đồng nucleotide tƣơng đồng amino acid 99% chủng virus vaccine 100% So sánh với chủng Trung Quốc, hai chủng virus nghiên cứu Việt Nam có mức độ tƣơng đồng cao, từ 99-100% - Giữa chủng giới có tỷ lệ đồng nucleotide tƣơng đồng amino acid từ 99-100% 3.4 Bàn luận chung Hiện Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) tạm thời xếp virus dịch tả vịt vào nhóm virus chƣa xác định cụ thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet cs., 2005; Liu cs., 2008) đặc tính sinh học phân loại học loại virus chƣa hồn tồn sáng tỏ Chính việc nghiên cứu sâu sinh hoc phân tử gen/hệ gen nhƣ dịch tễ học phân tử virus dịch tả vịt nhiều quốc gia điều vô cần thiết Kể từ phát bệnh dịch tả vịt lần năm 1923 Hà Lan, bệnh liên tiếp lây lan đƣợc phát nhiều quốc gia toàn giới, gây thiệt hại nặng nề kinh tế cho ngành chăn nuôi Trƣớc virus dịch tả vịt đƣợc nghiên cứu dịch tễ, triệu chứng lâm sàng bệnh tích Từ năm 2007 trở lại đây, có nhiều cơng trình nghiên cứu sinh học phân tử virus dịch tả vịt đƣợc công bố Các công bố chủ yếu tập trung Trung Quốc Cho đến nay, có hệ gen virus dịch tả vịt đƣợc giải mã toàn hệ gen, bao gồm chủng vaccine (số NHG EU082088, JF999965, NC013036) chủng cƣờng độc (số NHG JQ647509) (Wu cs., 2012) Các nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chứng minh virus dịch tả vịt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thành viên họ Herpesviridae, mang đặc điểm đặc trƣng họ Tuy nhiên mang nhiều đặc trƣng riêng mà cần tiếp tục nghiên cứu sâu Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát lần Cao Bằng vào năm 1963 Từ đến nay, bệnh tiếp tục lan rộng có mặt hầu khắp tỉnh thành nƣớc Virus gây bệnh dịch tả vịt gồm serotype, nhƣng có nhiều chủng có độc lực khác tồn tự nhiên (Nguyễn Nhƣ Thanh cs., 2001) Tuy nhiên, nghiên cứu virus dịch tả vịt chƣa nhiều tập trung việc công bố tình hình dịch bệnh biểu bệnh tích, triệu chứng lâm sàng (Nguyễn Ngọc Điềm, 2005), chƣa có nghiên cứu đầy đủ đặc tính phân tử, nguồn gốc phả hệ, tính tƣơng đồng chủng virus cƣờng độc chủng virus vaccine Hai chủng virus cƣờng độc vaccine đƣợc sử dụng cho nghiên cứu hai chủng virus Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ƣơng cung cấp - nằm hồ sơ giống quốc gia Các vấn đề đƣợc đặt cho nghiên cứu là: (i) Xác định chắn hai giống virus lƣu giữ virus dịch tả vịt sinh học phân tử; (ii) Khảo sát tƣơng đồng nucleotide amino acid hai chủng virus lƣu giữ; (iii) So sánh với chủng giới Kết nghiên cứu khẳng định hai chủng virus nghiên cứu virus dịch tả vịt qua khảo sát ba gen DNA-polymerase; UL-5 UL-32 Kết kiểm tra độc lực virus cách tiếp truyền vịt mẫn cảm cho thấy: chủng virus cƣờng độc gây chết 100% vịt thí nghiệm với biểu triệu chứng bệnh tích đặc trƣng; chủng virus vaccine hồn tồn không gây bệnh cho vịt Điều khẳng định hai chủng virus nghiên cứu chủng virus cƣờng độc chủng virus vaccine Kết khảo sát sinh học phân tử cho thấy: hai chủng virus cƣờng độc vaccine Việt Nam hoàn toàn đồng nucleotide amino acid Điều chứng tỏ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chủng virus vaccine nghiên cứu có khả bảo hộ cao cho vịt bị nhiễm chủng virus dịch tả vịt cƣờng độc DTVCDKN Tuy nhiên, kết nghiên cứu đầu tiên, cần phải tiếp tục phân lập phân tích thêm chủng virus cƣờng độc nhiều địa phƣơng khác nƣớc; nhƣ chủng virus vaccine sử dụng Từ đánh giá đƣợc dịch tễ học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam khả bảo hộ vaccine Việc nghiên cứu sâu sinh học phân tử để xác định vùng gen biến đổi, có vai trị định tính độc lực virus điều cần thiết Theo nghiên cứu công bố Wu cs 2012, gen UL32 có vai trị gen kháng nguyên, nhƣng lại có độ bảo tồn cao Các gen đƣợc chứng minh vùng có nhiều thay đổi định tính độc lực virus bao gồm gen UL2, UL12, US10, UL47 UL41 Tuy nhiên công bố giới, cần có thêm chứng sinh học phân tử từ chủng virus dịch tả vịt quốc gia khác để làm sáng tỏ nhận xét nhƣ có thêm hiểu biết sâu sắc virus dịch tả vịt KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Chuỗi nucleotide gen DNA-polymerase, UL5, UL32 từ virus cƣờng độc virus vaccine dịch tả vịt Việt Nam đƣợc thu nhận phân tích Hai chủng virus lƣu giữ hồ sơ giống quốc gia nghiên cứu xác chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt chủng virus vaccine dịch tả vịt qua kiểm tra tiếp truyền động vật mẫn cảm sinh học phân tử Hai chủng virus cƣờng độc nhƣợc độc dịch tả vịt Việt Nam hoàn toàn đồng nucleotide tƣơng đồng amino acid Các chủng virus Việt Nam có mức độ đồng nhất/tƣơng đồng gần với chủng Trung Quốc (99%) Đức (99%) KIẾN NGHỊ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cần giám định sàng lọc thêm nhiều chủng virus dịch tả vịt phân lập Việt Nam, chủng virus vaccine sử dụng để phân tích nhằm làm sáng tỏ dịch tễ học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam Cần phân tích thêm gen/hệ gen virus dịch tả vịt để bổ sung làm sáng tỏ hiểu biết sinh học phân tử virus dịch tả vịt giới Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Kim Anh (2004) Kỹ thuật chăn nuôi vịt ngan nông hộ NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Xn Bình (2004) Bệnh vịt biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Trần Minh Châu (1980) Chủng vius cƣờng độc 769 sử dụng vaccine để phòng bệnh Luận án PTS khoa học Nông nghiệp Trần Minh Châu (1987) Bệnh dịch tả vịt Nhà xuất Nụng nghip, H Ni Trần Minh Châu (1996), 100 câu hỏi bệnh chăn nuôi gia súc, gia cầm, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyn Th Chớnh, Ngô Tiến Hiển (2001) Vius học, Nhà xuất Đại học quốc gia, Hà Nội Nguyễn Ngọc Điểm (2005) “Tình hình bệnh dịch tả vịt đàn vịt ni ngoại thành Hà Nội số tỉnh lân cận, phân lập khảo sát đặc tính sinh học chủng virus cƣờng độc”, Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Đức Hiền (1999) Nghiên cứu hiệu lực miễn dịch phòng bệnh vaccine dịch tả vịt áp dụng tiêm chủng khác điều kiện sản xuất Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 5, Hội Thú y Việt Nam, tr 37 – 41 Lê Thanh Hoà (2006a) Y-Sinh học phân tử Nhà Xuất Y học, Hà Nội 10 Lê Quang Huấn (2007) Tiến hóa phân tử Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ (280 trang) 11 Phạm Quang Hùng (2003) Con vịt với ngƣời nông dân Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 12 Lê Văn Lãnh (1991) Khảo sát số đặc tính sinh học giống vius vaccine Jansen chế vaccine phịng bệnh dịch tả vịt”, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu KHKT Nông nghiệp 1986 – 1991 Nhà xuất Nơng nghiệp, tr 120 -121 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 Nguyễn Nhƣ Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hƣơng (2001) Vi sinh vật thú y, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội TIẾNG ANH 14 An R, Li H, Han Z, Shao Y, Liu S, Kong X (2008) The ul31 to ul35 gene sequences of duck enteritis virus correspond to their homologs in herpes simplex virus Acta Virol 52 (1): 23-30 15 Asai R, Ohno T, Kato A, Kawaguchi Y (2007) Identification of proteins directly phosphorylated by UL13 protein kinase from herpes simplex virus Microbes Infect (12–13): 1434–1438 16 Baudet A.E.R.F (1923), “Mortality in ducks in the Netherland caused by a filtertable virus, fowl plague”, Tijdschr Diergeneeskd 50, pp 455-459 17 Biswas N and Weller K (2001) The Journal of Biological Chemistry, 276, 17610-17619 The UL5 and UL52 Subunits of the Herpes Simplex Virus Type Helicase-Primase Subcomplex Exhibit a Complex Interdependence for DNA Binding 18 Boss A (1943), “Some new cases of duck plague”, Tijdschr Diergeneeskd 69, pp 372381 19 Brand C.J., and D.E Docherty (1984), “A survay of North American migratory waterfowl for duck plague virus”, J Wildl Dis 20, pp 261-266 20 Burgess E.C and T.M Yuill (1981), “Increased cell culture incubation temperatures for duck plague virus isolation” Avian Dis 25, pp 222-224 21 Chang H, Cheng AC, Wang MS, Guo YF, Xie W, Lou KP (2009) Complete nucleotide sequence of the duck plague virus gE gene Arch virol 154:163165 22 Cheng A (2006) Construction of duck enteritis virus gene libraries and discovery, cloning and identification of viral nucleocapsid protein gene High Technol Lett 16: 948 –953 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 23 Dardini A.H and W.R Hess (1968), “A plague assay for duck plague virus”, Can J Comp Med Sci 32, pp 505-510 24 Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (2005) Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Elsevier Academic Press, California 25 Friend M and Franson JC (1999) (Eds.) Field Manual of Wildlife Diseases US Department of the Interior, US Geological Survey (0-607-88096-1): 141-152 26 Gardner R, Wilkerson J, Johnson JC (1993) Molecular characterization of the DNA of Anatid herpesvirus Inter virology, 36: 99-112 27 Grauer D and Li WH (2000) Fundamentals of molecular evolution (second edition) Sinauer Associates, Inc Sunderland, MA, USA (481 pp) 28 Hansen WR, Nashold SW, Docherty DE, Brown SE and Knudson DL (2000) Diagnosis of duck plague in waterfowl by polymerase chain reaction Avian Dis 44: 266–274 29 He Q, Yang Q, Cheng A, Wang M, Xiang J, Zhu D, Jia R, Luo Q, Chen Z, Zhou Y, Chen X(2011).Expression and characterization of UL16 gene from duck enteritis virus.Virol J 24;8:413 30 Hwang J, Edward TM, Ronard EY (1968) Occurrence of Duck Enteritis Virus (Duck Plague) in Pennsylvania, 1968-74 Avian Dis 19: 31 Jansen J (1964) “Duck plague (a concise survey)”, Indian Vet J 41, pp 309-316 32 Jansen J (1968), “Duck plague”, J Am Vet Med Assoc 152, pp 1009-1016 33 Jarosinski K, Hunt H, Osterrieder N (2010) Down-regulation of MHC class I by the Marek’s disease virus (MDV) UL49.5 gene product mildly affects virulence in a haplotype-specific fashion Virology 405 (2): 457–463 34 Jarosinski K and Osterrieder N (2010) Further analysis of Marek’s disease virus hori- zontal transmission confirms that U(L)44 (gC) and U(L)13 protein kinase activity are essential, while U(S)2 is nonessential J Virol 84 (15): 7911–7916 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 35 Jia R, Cheng A, Wang M, Xin H, Guo Y, Zhu D, Qi X, Zhao L, Ge H, Chen X (2009) Analysis of synonymous codon usage in the UL24 gene of duck enteritis virus.Virus Genes.38(1):96-103 36 Lee L, Silva R, Cui X, Zhang H, Heidari M, Reddy S (2007) Characterization of LORF11, a unique gene common to the three Marek’s disease virus serotypes Avian Dis 51 (4): 851–857 37 Leibovitz L Hwang J (1967), Duck plague on the American continent Proc 39th Ann Mtg Northeasthern Conj Avian disease State Univer NewYork Stony, N.Y.Yune 1967 38 Li Y, Huang B, Ma X, Wu J, Li F, Ai W, Song M, Yang H (2009) Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus Virology 391 (2): 151– 161 39 Lian B, Xu C, Cheng A, Wang M, Zhu D, Luo Q, Jia R., Bi F, Chen Z, Zhou Y, Yang Z, Chen X (2010) Identification and characterization of duck plague virus glycoprotein C gene and gene product Virol J 7: 349 40 Liu S, Chen S, Li H, Kong X (2007) Molecular characterization of the herpes simplex virus (HSV-1) homologues, UL25 to UL30, in duck enteritis virus (DEV) Gene 401(1-2): 88-96 41 Liu S, Li H, Li Y, Han Z, Shao Y, An R, Kong X (2008) Phylogeny of Duck Enteritis Virus: Evolutionary Relationship in the Family Herpesviridae Intervirology 51(3): 151-165 42 Liu X, Han Z, Shao Y, Yu D, Li H, Wang Y, Kong X, Liu S (2010) Identification of a novel linear B-cell epitope in the UL26 and UL26.5 proteins of Duck Enteritis Virus Virol J 7: 223 43 Marintcheva B and Weller SK (2001) A tale of two HSV-1 helicases: roles of phage and animal virus helicases in DNA Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 70: 77-118 44 McGeoch DJ, Dalrymple MA, Davison AJ, Dolan A, Frame MC, McNab D, Perry LJ, Scott JE and Taylor P (1988) The complete DNA sequence of the Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn long unique region in the genome of herpes simplex virus type J Gen Virol 69 (7): 1531-1574 45 Nellissery J, Szczepaniak R, Lamberti C, Weller S (2007) A putative leucine zipper within the herpes simplex virus type UL6 protein is required for portal ring formation J Virol 81 (17): 8868–8877 46 Neubauer A, Rudolph J, Brandmüller C, Just F, Osterrieder N (2002) The equine herpesvirus UL34 gene product is involved in an early step in virus egress and can be efficiently replaced by a UL34-GFP fusion protein Virology 300 (2): 189–204 47 Nicole LR and Keith AC (2009) Evolution of Picornaviridae: An examination of phylogenetic relationships and cophylogeny Mol Phylogenet Evol 54: 9951005 48 Nicholas KB and Nicholas HB (1997) Genedoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments Distributed by the author 49 OIE (2000), Manual of Standards for diagnostic test and vaccines, http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00111.htm 50 OIE (2006), Annua animal diseases status http://www.oie.int/hs2/report.asp 51 Olsson M, Tang K, Persson C, Wilhelmsson L, Billeter M, Elias P (2009) Stepwise evolution of the herpes simplex virus origin binding protein and origin of replication J Biol Chem 284 (24): 16246–16255 52 Osterrieder N (1999) Construction and characterization of an equine herpesvirus glycoprotein C negative mutant Virus Res 59 (2): 165–177 53 Pan H, Cao R, Liu L, Niu M, Zhou B, Chen P, Hu J (2008) Molecular cloning and sequence analysis of the duck enteritis virus UL5 gene Virus Res.136: 152-156 54 Pritchard LI, Morrissy C, Van Phuc K, Daniels PW and Westbury HA (1999) Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis Vet Microbiol 68: 149–156 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 Richard GF, Kerrest A, Dujon B (2008) Comparative genomics and molecular dynamics of DNA repeats in eukaryotes Microbiol Mol Biol Rev 72: 686 – 727 56 Sandhu T and Shawky S (2003) Duck virus enteritis (duck plague) Dis Poultry 11: 354 –363 57 Schnee M, Ruzsics Z, Bubeck A, Koszinowski U (2006) Commonand specific prop- erties of herpesvirus UL34/UL31 protein family members revealed by protein complementation assay J Virol 80 (23): 11658–11666 58 Shawky S and Schat K (2002) Latency sites and reactivation of duck enteritis virus Avian Dis 46 (2): 308–313 59 Shen C, Guo Y, Cheng A, Wang M, Zhou Y, Lin D, Xin H, Zhang N (2009) Identification and characterization of the duck enteritis virus UL51 gene Arch Virol 154: 1061-1069 60 Spatz S, Zhao Y, Petherbridge L, Smith L, Baigent S, Nair V (2007) Comparative sequence analysis of a highly oncogenic but horizontal spreaddefective clone of Marek’s disease virus Virus Genes 35 (3): 753–766 61 Voxapeer Suwathanaviroij (1978), Report at Poultry disease workshop in Kualalumpur Malaysia 62 Wang J, Hoper D, Beer M, Osterrieder N (2011) Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains Virus Res 160 (1-2): 316325 63 Wiley G, Macmil S, Qu C, Wang P, Xing Y, White D, Li J, White JD, Domingo A, Roe BA (2009) Methods for generating shotgun and mixed shotgun/pairedend libraries for the 454 DNA sequencer Curr Protoc Hum Genet (Chapter 18, Unit 18.1) 64 Wobeser GA (1997) Duck plague, in Diseases of wild waterfowl (2nd ed): New York, N.Y., Plenum Press 15–27 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 Wu Y, Cheng A, Wang M, Yang Q, Zhu D, Jia R, Chen S, Zhou Y, Wang X, Chen X (2012) Complete genomic sequence of Chinese Virulent Duck enteritis virus J Virol 86(10): 5965 66 Xiang J, Zhang S, Cheng A, Wang M, Chang H, Shen C, Zhu D Jia R, Luo Q, Chen Z, Chen X (2011) Expression and characterization of recombinant VP19c protein and N-terminal from duck enteritis virus Virol J 8: 82 67 Zhang S, Ma G, Xiang J, Cheng A, Wang M, Zhu D, Jia R, Luo Q, Chen Z, Chen X (2010) Expressing gK gene of duck enteritis virus guided by bioinformatics and its applied prospect in diagnosis Virol J 7: 168 68 Zhang S, Xiang J, Cheng A, Wang M, Wu Y, Yang X, Zhu D, Jia R, Luo Q, Chen Z, Chen X (2011) Characterization of duck enteritis virus UL53 gene and glycoprotein K Virol J 8: 235 69 Zhao Y and Wang J (2010): Characterization of duck enteritis virus US6, US7 and US8 gene Intervirology, 53:141-145 70 Zhu H, Li H, Han Z, Shao Y, Wang Y, Kong X (2011) Identification of a spliced gene from duck enteritis virus encoding a protein homologous to UL15 of herpes simplex virus Virol J (1): 156 71 Zhu LA and Weller SK (1992) The six conserved helicase motifs of the UL5 gene product, a component of the herpes simplex virus type helicaseprimase, are essential for its function J Virol 66: 469-479 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC BẢNG MÃ DI TRUYỀN Tên tên viết tắt 20 loại amino acid Số TT Tên amino acid Tên viết tắt (3 ký tự) Tên viết tắt (1 ký tự) Số TT Tên amino acid Tên viết tắt (3 ký tự) Tên viết tắt (1 ký tự) Alanine Ala A 11 Leucine Leu L Arginine Arg R 12 Lysine Lys K Asparagine Asn N 13 Methionine Met M Aspartic acid Asp D 14 Phenylalanine Phe F Cysteine Cys C 15 Proline Pro P Glutamine Gln Q 16 Serine Ser S Glutamic acid Glu E 17 Threonine Thr T Glycine Gly G 18 Tryptophan Trp W Histidine His H 19 Tyrosine Tyr Y 10 Isoleucine Ile I 20 Valine Val V Bảng mã di truyền (Bacterial Genetic Code) AAs = FFLLSSSSYY**CC*WLLLLPPPPHHQQRRRRIIIMTTTTNNKKSSRRVVVVAAAADDEEGGGG Starts = -M -M MMMM -M -Base1 = TTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGG Base2 = TTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGG Base3 = TCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAG TTT TTC TTA TTG Phe Phe Leu Leu F F L L TCT TCC TCA TCG Ser Ser Ser Ser S S S S TAT TAC TAA TAG Tyr Tyr Stop Stop Y Y * * TGT TGC TGA TGG Cys Cys stop Trp C C * W CTT CTC CTA Leu Leu Leu L L L CCT CCC CCA Pro Pro Pro P P P CAT CAC CAA His His Gln H H Q CGT CGC CGA Arg Arg Arg R R R CTG Leu L CCG Pro P CAG Gln Q CGG Arg R ATT ATC ATA Ile Ile Ile I I I ACT ACC ACA Thr Thr Thr T T T AAT AAC AAA Asn Asn Lys N N K Ser Ser Arg S S R ATG Met M ACG Thr T AAG Lys K AGT AGC AGA AGG Arg R GTT GTC GTA Val Val Val V V V GCT GCC GCA Ala Ala Ala A A A GAT GAC GAA Asp Asp Glu D D E GGT GGC GGA Gly Gly Gly G G G GTG Val V GCG Ala A GAG Glu E GGG Gly G Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam qua khảo sát gen UL5, UL32 DNA- polymerase? ?? - Đối tƣợng nghiên cứu: - Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt Trung... sánh phân tích gen UL32 chủng virus dịch tả vịt Việt Nam cần thiết để cung cấp thêm liệu sinh học phân tử cho việc nghiên cứu virus dịch tả vịt giới Danh sách chủng virus dịch tả vịt Việt Nam. .. Hiền, 1999) Đặc biệt chƣa có cơng bố sinh học phân tử virus dịch tả vịt mức độ gen so sánh phân tích hệ gen Việt Nam Chính mà việc bắt đầu đẩy mạnh nghiên cứu virus dịch tả vịt Việt Nam điều cần