SEMINAR CHUYÊN đề cải TIẾN sản LƯỢNG CEPHALOSPORIN c BẰNG ADN tái tổ hợp được hợp NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM

CHUYÊN ĐỀ: CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM «CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM» Đặt vấn đề Tổng quan Nội dung phương pháp Kết luận I ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh nhóm thuốc sử dụng phổ biến y học điều trị bệnh viêm nhiễm vi sinh vật gây Cephalosporin C (CPC) thuộc nhóm βlactam, kháng sinh bán tổng hợp sử dụng rộng rãi CPC sản xuất quy trình lên men truyền thống quy mô công nghiệp nhờ chủng nấm mốc Acremonium chrysogenum tự nhiên suất chưa cao Áp dụng kĩ thuật di truyền cải thiện quy trình tìm kiếm chủng cho sản lượng cao Từ cho phép tạo chủng nấm Acremonium chrysogenum mang ADN tái tổ hợp cho sản lượng kháng sinh cao quy trình sản xuất Các gen hợp chủng Acremonium chrysogenum gen quan trọng đường sinh tổng hợp CPC: cefEF, cefG ,vgb II TỔNG QUAN Sơ lược phát kháng sinh Nấm mốc Acremonium chrysogenum Con đường sinh tổng hợp CPC SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG SINH Hiện tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis (Pasteur Joubert, 1877) 1 chế phẩm tách từ nấm mốc dùng để điều trị bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn gây (Gratia đồng nghiệp, 1925) SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG SINH 1929, Fleming mô tả chi tiết chất kháng sinh báo cáo Penicillin Trong chiến tranh giới thứ II, kháng sinh dùng để điều trị bệnh cho người bị thương với số lượng lớn Các nhà khoa học nhận thấy không vi sinh vật mà thực vật, động vật có khả sinh kháng sinh SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG SINH  Từ thực tế đó, Glasby(1976) đưa định nghĩa chất kháng sinh: “ Một chất kháng sinh hợp chất tổng hợp ta từ thể sống ức chế trình sống vi sinh vật nồng độ thấp”  Trong số kháng sinh nhóm β-lactam sử dụng nhiều phổ biến  Các Cephalosporin C kháng sinh bán tổng hợp thuộc nhóm β-lactam sử dụng rộng rãi phổ kháng khuẩn rộng độc với người SƠ LƯỢC VỀ KHÁNG SINH Cephalosporin C gồm hệ 1,2,3,4 Trong sử dụng nhiều CPC hệ 1,2,3 hệ sử dụng hạn chế Chủng vi nấm sử dụng để sản xuất CPC công nghiệp Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium) NẤM MỐC ACREMONIUM CHRYSOGENUM  Acremonium chrysogenum dùng chủ yếu để sản xuất CPC quy mô công nghiệp  Cephalosporium chi thuộc nấm bất toàn (Deuteromycetes)  Căn vào đặc điểm sinh sản hữu tính, thấy nấm thuộc chi Emericellopis chi nấm túi (Ascomycetes).Chi cịn có tên khác Peyronellula Saturnomycetes III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Tạo chủng Acremonium chrysogenum mang ADN tái tổ hợp Quy trình sản xuất CPC Tối ưu hóa điều kiện lên men chủng A.chrysogenum mang gen tái tổ hợp TẠO CHỦNG ACREMONIUM CHRYSOGENUM MANG ADN TÁI TỔ HỢP  Bước 1: Tách ADN tổng số từ khuẩn ty nấm Acremonium chrysogenum phương pháp tách chiết ADN  Bước 2: Nhân dòng cefEF, cefG kĩ thuật PCR  Bước 3: Tạo chủng Acremonium chrysogenum tái tổ hợp  Bước 4: Kiểm tra chủng biến nạp kĩ thuật lai Southern QUY TRÌNH SẢN XUẤT CPC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG  Thu nhận mẫu từ đất, nước, bùn  Sử dụng YPS môi trường thạch – glucose – khoai tây bổ sung Cephalosporin C (CPC) nhằm ức chế chủng nấm vi khuẩn khác khơng có khả kháng lại kháng sinh  Mơi trường có mọc khuẩn lạc nấm mốc dạng Cephalosporium tách  Kiểm tra hoạt tính phương pháp cục thạch nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng có hoạt tính 2.BẢO QUẢN VÀ HOẠT HÓA GIỐNG  Giống bảo quản glycerin vơ trùng, dung ống nghiệm bảo quản để nhân giống gốc sản xuất CPC chủng  Để bảo quản lâu dài sử dụng phương pháp đông khô tốt  Giống hoạt hóa máy lắc 3-4 ngày (28oC, 200vịng) trước đưa vào mơi trường lên men LÊN MEN SẢN XUẤT Tiến hành lên men theo pha:  Pha đầu: nuôi thu sinh khối – ngày, nhiệt độ: 20 – 300C, pH: 6,5 – 6,8  Pha sau: lên men thu sản phẩm, nhiệt độ: 22 – 250C, pH thường thấp pha đầu tạo pha đầu acid, thời gian lên men từ – ngày, chất phá bọt thường sử dụng: mỡ lợn, dầu thực vật… TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CHỦNG A.CHRYSOGENUM MANG GEN TÁI TỔ HỢP Phải đảm bảo yếu tố môi trường như: Nguồn Carbon: nguồn glucose rỉ đường nguồn cacbon tốt cho trình nhân giống chủng A.chrysogenum Lượng sinh khối hình thành sau 96h điều kiện nuôi cấy lắc đạt 8,35-8,50mg/ml Nguồn Nitơ:casein thủy phân, muối amoni sunphat amoni clorua có tác dụng tốt tới trình lên men sinh tổng hợp CPC Ngồi cịn có bột đậu tương nguồn nitơ có giá trị cao, acid gluctamic: 19,46%, acid aspartic: 3,89%, cystein: 1,12%, gluxit:2235,5% , số vitamin muối khống MƠI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG  (NH4)2SO4: g/l sucrose  glucose  Methionin   CaCO3 :35g/l : 5g/l : 0,5 g/l :5 g/l :10 g/l Bean oli  PH = 6,5 Ủ 3ngày 28oC, tốc độ lắc 230vịng/phút  MƠI TRƯỜNG LÊN MEN + Cao ngô :100g/l  + Tinh bột :30 g/l  + Dextrin : 60 g/l  + Glucose : g/l  + Methionin : g/l  + Urine : g/l  + KH2PO4 : g/l  + MgSO4 : g/l  + (NH4)2SO4 : 13 g/l  + CaCO3 : 10 g/l  + Vi lượng : 10g/l  + Bean oil : 20 g/l  Nuôi ngày, 25oC, tốc độ lắc 230vịng/phút   Ngồi cịn cần ý đến điều kiện khác như:  Thời gian nhân giống thích hợp cho lên men CPC 96h  Độ thơng khí: A.chrysogenum sinh vật hiếu khí bắt buộc nên lượng mơi trường bình lên men thích hợp 10% thể tích bình lên men IV.KẾT LUẬN  Bằng việc gen cefG, cefEF, vgb hợp nhiễm sắc thể A.chrysogenum mà sản lượng sinh tổng hợp CPC tăng lên 86-116,3%  Việc tìm thấy điều kiện lên men tối ưu cho chủng nấm Acremonium chrysogenum mang ADN tái tổ hợp có vai trị lớn quy trình sản xuất CPC phương pháp lên men chìm KẾT LUẬN  CPC điều chế phương pháp lên men sinh tổng hợp chủng Acremonium chrysogenum nhiên hoạt tính kháng khuẩn khơng cao CPC bán tổng hợp Để sản xuất CPC bán tổng hợp có giá trị chữa bệnh cao phải chuyển hóa kháng sinh thành “nhân” 7-ACA từ bán tổng hợp thành kháng sinh  Quá trình sinh tổng hợp CPC bán tổng hợp đường enzym đường hóa học Q trình mô tả qua sơ đồ sau: ...? ?C? ??I TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯ? ?C HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM? ? Đặt vấn đề Tổng quan Nội dung phương pháp Kết luận I ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh nhóm thu? ?c sử... hạn chế Chủng vi nấm sử dụng để sản xuất CPC c? ?ng nghiệp Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium) NẤM M? ?C ACREMONIUM CHRYSOGENUM  Acremonium chrysogenum dùng chủ yếu để sản xuất CPC... mang ADN tái tổ hợp Quy trình sản xuất CPC Tối ưu hóa điều kiện lên men chủng A .chrysogenum mang gen tái tổ hợp TẠO CHỦNG ACREMONIUM CHRYSOGENUM MANG ADN TÁI TỔ HỢP  Bư? ?c 1: Tách ADN tổng