khảo sát đột biến c 1799ta của gen braf trong ung thư đại – trực tràng bằng kỹ thuật aso pcr

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Khảo sát đột biến c.1799T>A gen BRAF ung thư đại – trực tràng kỹ thuật ASO-PCR Mã số: ……… Chủ nhiệm đề tài: TS.BS HỒNG ANH VŨ Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Hoàng Anh Vũ Nguyễn Thế Vinh Dương Bích Trâm Nguyễn Huỳnh Minh Quân Đoàn Thị Phương Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG: I.2 CÁC CƠ CHẾ PHÂN TỬ GÂY UTĐTT I.3 NHỮNG GEN LIÊN QUAN ĐẾN TIÊN LƯỢNG VÀ ĐIỀU TRỊ UTĐTT I.4 KỸ THUẬT ASO-PCR CHƯƠNG II: Đ I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 11 II.1 Đ i tư ng nghi n c u 11 II.2 Phương há nghi n c u 11 CHƯƠNG 3: KẾT QU VÀ BÀN LUẬN 13 III.1 Phát đột biến c.1799T>A giải trình tự Sanger 13 III.2 Chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR 14 III.3 Kết khảo sát đột biến tr n mẫu bệnh nhân 15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 17 TÀI LIỆU THAM KH O 18 DANH MỤC BẢNG BIỂU, DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Adenomatous polyposis coli EGFR Epidermal Growth Factor Receptor MEPK Mitogen-activated protein kinases PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha PTEN Phosphatase and tensin homolog TGFBR2 Transforming growth factor beta receptor TP53 Tumor protein p53 UTĐTT Ung thư đại trực tràng Hình 1.1 Nguy n tắc hương há ASO-PCR Hình 3.1 Đột biến c.1799T>A gen BRAF đư c hát giải trình tự DNA theo kỹ thuật Sanger Hình 3.2 Kết điện di sản hẩm ASO-PCR THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: - T n đề tài: Khảo sát đột biến c.1799T>A gen BRAF ung thư đại – trực tràng kỹ thuật ASO-PCR - Mã s : …… - Chủ nhiệm đề tài: Hoàng Anh Vũ (Điện thoại: 0122.2993537, Email: hoanganhvu@ump.edu.vn) - Đơn vị quản lý chuy n môn: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: 06/2016 – 11/2017 Mục tiêu: - Mục ti u chung: Xác định đư c tỷ lệ đột biến c.1799T>A gen BRAF ung thư đại trực tràng tr n bệnh nhân Việt Nam - Mục ti u cụ thể: 1) Xây dựng đư c quy trình ASO-PCR để xác định đột biến c.1799T>A gen BRAF 2) ng dụng đư c kỹ thuật ASO-PCR vào chẩn đoán tr n lâm sàng cho bệnh nhân Nội dung chính: - Ly trích genomic DNA từ mẫu mơ vùi nến - Giải trình tự DNA exon 15 gen BRAF để tìm mẫu mang đột biến c.1799T>A, dùng làm khuôn mẫu cho xây dựng điều kiện ASO-PCR - Thiết kế cặ mồi cho ASO-PCR - Thử nghiệm điều kiện PCR để khuếch đại đặc hiệu alen mang đột biến c.1799T>A - Tiến hành khảo sát đột biến c.1799T>A tr n 86 mẫu ung thư đại trực tràng ASO-PCR Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ng dụng, ):  Về đào tạo (s lư ng, chuy n ngành: trình độ BS/DS/CN, ThS, NCS…): khơng tham gia đào tạo  Công b tr n tạ chí nước qu c tế (t n báo, t n tạ chí, năm xuất bản): 01 báo tr n Tạ chí Y học TPHCM  Sách/chương sách (T n sách/chương sách, năm xuất bản): không  Patent, Giải há hữu ích (t n; trình trạng nộ đơn đ i với giải há chưa đăng ký sở hữu trí tuệ; mã s , ngày cấ , thời gian bảo hộ đ i với atent giải há đăng ký sở hữu trí tuệ): khơng Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại:  Kết nghi n c u đư c chuyển giao (T n sản hẩm, t n đơn vị nhận chuyển giao, giá trị chuyển giao): không  Phạm vi địa ng dụng kết nghi n c u (t n đơn vị ng dụng kết nghi n c u/t n giảng đư c trích dẫn kết NC sử dụng giảng dạy đại học sau đại học): góp hần chẩn đốn hân tử bệnh ung thư MỞ ĐẦU Các gen sinh ung mã hóa cho rotein có ch c kiểm soát tăng sinh tế bào và/hoặc chết tế bào theo chương trình Sản hẩm gen yếu t hi n mã, yếu t tăng trưởng, thụ thể yếu t tăng trưởng, yếu t dẫn truyền tín hiệu yếu t điều hịa chết tế bào theo chương trình Rất nhiều gen sinh ung bị đột biến ung thư Các đột biến nhóm gen thường gây tăng hoạt tính protein (activating mutation) Con đường truyền tín hiệu RAS/RAF/MAPK quan trọng cho hình thành ung thư đại trực tràng (UTĐTT) Các đột biến KRAS NRAS xuất khoảng 50% trường h UTĐTT ý nghĩa chúng việc ti n đoán đá ng với điều trị kháng thể đơn dòng ch ng EGFR đư c xác định rõ ràng Đột biến KRAS/NRAS dẫn đến kích hoạt li n tục đường RAS/RAF/MAPK, hạ nguồn thụ thể yếu t tăng trưởng biểu mô (EGFR), làm cho tế bào ung thư kháng lại liệu há ch ng EGFR(2,10) Vì thế, tình trạng đột biến KRAS/NRAS cần đư c xác định tr n lâm sàng trình đánh giá điều trị UTĐTT, đồng thời đường RAS/RAF/MAPK trở thành mục ti u để hát triển thu c cho điều trị UTĐTT(3,6) BRAF rotein khác đường RAS/RAF/MAPK, gần l n dấu ấn sinh học có ý nghĩa ti n lư ng đích hân tử h a hẹn điều trị UTĐTT Các đột biến gen BRAF xuất khoảng 10% UTĐTT; người mang đột biến BRAF có đặc điểm lâm sàng ti n lư ng khác biệt(15) Hơn nữa, tình trạng đột biến BRAF đư c cho gây khoảng 12 - 15% trường hơ bệnh nhân thất bại với liệu há ch ng EGFR (17) Bởi tầm quan trọng ngày tăng nó, hướng dẫn Mạng lưới Ung thư Qu c gia Mỹ (the National Com rehensive Cancer Network) khuyến cáo n n xét nghiệm đột biến BRAF cho bệnh nhân UTĐTT di Gen sinh ung BRAF mã hóa cho kinase serine/threonine hoạt động hía hạ nguồn KRAS đường RAS/RAF/MAPK BRAF hoạt động thơng qua việc kích hoạt MAPKK MEK, thúc đẩy tăng sinh tế bào Trong s đột biến gen BRAF c.1799T>A (BRAFV600E) dạng hổ biến nhất, chiếm khoảng 90% tất đột biến BRAF đư c tìm thấy UTĐTT(1,14) Đây đột biến chuyển đổi thymidine thành adenine vị trí nucleotide 1799, gây thay valine thành glutamate hoạt hoá li n tục MEK, dẫn đến tế bào tăng sinh q m c khơng cịn hụ thuộc tín hiệu từ EGFR Nghi n c u nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật ASO-PCR (Allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction) để hát đột biến c.1799T>A gen BRAF ng dụng kỹ thuật vào khảo sát đột biến tr n bệnh nhân UTĐTT CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG: Theo Tổ ch c Y tế giới, bệnh ung thư gây tử vong nhiều bệnh tim - mạch vành đột quỵ Ung thư nguy n nhân gây tử vong hàng đầu nước kinh tế hát triển lẫn hát triển; gánh nặng ung thư dự kiến tăng l n tr n toàn giới tăng trưởng lão hóa dân s , đặc biệt nước hát triển Ước tính có khoảng 14,1 triệu trường h 8,2 triệu trường h ung thư đư c hát tử vong ung thư xảy vào năm 2012 tr n toàn giới Ung thư hổi ung thư vú bệnh ung thư thường gặ gây tử vong hàng đầu ung thư, tương ng nam giới nữ giới Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thư đư c chẩn đoán hổ biến th ba nam giới th hai nữ giới, với ước tính 1,4 triệu trường h bệnh hát 0,7 triệu bệnh nhân tử vong năm 2012 Tỷ lệ nam giới cao nữ giới hầu hết nghi n c u tr n toàn cầu UTĐTT nguyên phát phần lớn ung thư biểu mơ tuyến (adenocarcinơm), chiếm khoảng 90-95% Ngồi loại sarcơm gặp: phát sinh từ mơ trơn (leiomyosarcoma), mô mỡ (liposarcoma), mạch máu (hemangiosarcoma), bạch mạch (lymphangio-sarcoma), mơ lưới (reticulosarcoma), mơ lâm ba (lymphosarcoma) Có nhiều s liệu khác phân b ung thư biểu mô tuyến tr n khung đại tràng theo qu c qua chủng tộc Nhìn chung s liệu th ng UTĐTT xảy bên trái nhiều b n hải, nhiều trực tràng Về mặt đại thể có dạng chồi sùi, thể loét, thể thâm nhiễm dạng vòng nhẫn Tuy nhiên, kết h p thể với thường gặ Trong đó, thể loét dạng thường gặp Phần lớn UTĐTT thể bệnh ngẫu nhi n đơn lẻ (s oradic), khơng có ch ng rõ ràng r i loạn có tính di truyền Khoảng 25% bệnh nhân cịn lại có bệnh sử UTĐTT gia đình, cho thấy có đóng gó nguy n nhân di truyền, nhiễm với yếu t nguy chung thành vi n gia đình, kết h hai Các đột biến gen di truyền đư c xác định nguy n nhân gây nguy ung thư di truyền s gia đình UTĐTT; đột biến gây bệnh chiếm khoảng 5% đến 6% tổng s trường h khác, kết h UTĐTT Rất gen chưa đư c hát với yếu t nguy không di truyền, đóng gó vào hát sinh UTĐTT gia đình Bệnh sử gia đình yếu t nguy UTĐTT: Nhiều nghi n c u ch ng minh nguy UTĐTT thân nhân có quan hệ huyết th ng bậc I với bệnh nhân UTĐTT tăng l n gấ đến lần Càng có nhiều người thân bị UTĐTT, khởi hát sớm nguy gia tăng: có thân nhân đư c chẩn đốn trước 45 tuổi nguy tăng cao đến 3,8 lần, so với nguy 2,2 lần chẩn đoán khoảng 45 – 59 tuổi nguy 1,8 lần chẩn đoán sau 60 tuổi Các yếu t nguy khác UTĐTT: Các yếu t nguy khác ảnh hưởng đến phát sinh polyp tuyến UTĐTT bao gồm chế độ ăn u ng, sử dụng thu c kháng viêm không steroid, hút thu c lá, soi đại tràng với việc cắt bỏ polyp tuyến hoạt động thể chất Ngay hội ch ng Lynch, dạng UTĐTT, hút thu c đư c xác định yếu t nguy cho phát triển u tuyến đại trực tràng I.2 CÁC CƠ CHẾ PHÂN TỬ GÂY UTĐTT Phần lớn hiểu biết bệnh học hân tử UTĐTT xuất hát từ hội ch ng UTĐTT di truyền, cho thấy có khơng đồng UTĐTT hân tử lâm sàng Hầu hết UTĐTT hát triển từ u tuyến (adenomas) Sự biến đổi từ biểu mơ bình thường thành u tuyến đến ung thư biểu mơ có li n quan đến biến c hân tử mắc hải Hiện nay, UTĐTT đư c chia thành ba loại dựa tr n đặc điểm di truyền hân tử, g i ý đường khác hát triển kh i u: Sự bất ổn định nhiễm sắc thể (CIN: Chromosomal instability), bất ổn định vi vệ tinh (MSI: microsatellite instability) kiểu hình methyl hóa đảo C G Con đường bất ổn định NST (CIN): Phần lớn UTĐTT hát triển qua đường CIN Những thay đổi quan trọng loại ung thư CIN bao gồm thay đổi s lư ng NST (aneu loidy), hần NST (mất dị h tử) 5q, 18q, 17 biến thể gây bệnh gen sinh ung KRAS Các gen chủ yếu li n quan đến đoạn NST APC (5q), DCC/MADH2/MADH4 (18q) TP53 (17 ) Những đoạn NST bộc lộ không ổn định di truyền m c độ hân tử NST Trong s biến c đầu ti n hổ biến đường tiến triển kh i u đại trực tràng bất hoạt APC đoạn NST ch a gen APC xuất đột biến gây bệnh gen APC Sự bất hoạt APC đột biến gây bệnh đầu ti n đư c mơ tả bệnh đa oly tuyến gia đình Các đột biến gây bệnh mắc hải di truyền gen sửa chữa tổn thương DNA sửa chữa cắt bỏ base, sửa chữa cắt bỏ nucleotide, sửa chữa mạch đôi, sửa chữa lỗi bắt cặ sai (MMR: mismatch re air) đóng vai trị quan trọng việc làm cho tế bào biểu mô đại trực tràng sễ trở thành tế bào ung thư Con đường bất ổn định vi vệ tinh (MSI): Khoảng10% -15% UTĐTT có ổn định NST thể bất thường trình tự lặ lại vi vệ tinh, đặc điểm kh i u bệnh nhân có hội ch ng Lynch Q trình methyl hóa m c romoter gen MLH1 gây n n trường h UTĐTT ngẫu nhi n đơn lẻ có MSI Đột biến mầm gen MMR đư c hát hội ch ng Lynch, v n thường xuy n biểu tình trạng MSI Các đặc điểm ung thư MSI chúng có thành hần NST tương đ i nguy n vẹn lại mang nhiều đột biến gây bệnh gen ung thư quan trọng Các loại ung thư đư c hát m c độ hân tử thay đổi đơn vị DNA lặ lại gen, đư c gọi vi vệ tinh DNA Ở kh i u có bất ổn định vi vệ tinh, t c độ tiến triển từ u tuyến đến ung thư biểu mô thường nhanh so với kh i u ổn định vi vệ tinh Kiểu hình methyl hóa đảo CpG (CIMP: CpG island methylator phenotype) đường đa polyp cưa: Đầu năm 1980, nghi n c u bắt đầu báo cáo nguy tăng cao UTĐTT bệnh nhân mắc hội ch ng đa oly tăng sản (HPS: hy er lastic oly osis syndrome), đư c gọi hội ch ng đa oly cưa (SPS: serrated oly osis syndrome) Chỉ có s SPS xuất có tính gia đình, khơng có đột biến dịng mầm hổ biến đư c xác định gia đình So sánh oly tăng sản (HPs) đư c tìm thấy bệnh nhân SPS nhóm đ i ch ng cho thấy oly SPS có đặc điểm mô học khác biệt Các u tuyến cưa khơng cu ng (SSA: sessile serrated adenomas) có khuynh hướng xuất đại tràng b n hải, thường lớn khơng cu ng, tăng sinh nhanh chóng khơng bị loạn sản Các oly cưa với loạn sản biểu MSI với methyl hóa m c vùng khởi động gen MLH1 Các oly cưa lớn (> 1cm) có nguy ung thư cao so với oly tăng sản thông thường, hát triển thành ung thư thường biểu MSI Biểu MSI UTĐTT không di truyền methyl hóa m c vùng khởi động gen MLH1, làm bất hoạt gen Có khoảng 20% - 30% UTĐTT biểu CIMP, đư c định nghĩa methyl hóa m c nhiều đảo CpG Methylated In Tumor (MINT1), MINT2, MINT31, CDKN2A (p16) MLH1 Đột biến BRAF V600E đư c tìm thấy phổ biến UTĐTT có MSI oly cưa Đột biến BRAF khơng có UTĐTT hội ch ng Lynch gặp polyp tuyến đại trực tràng đơn lẻ, diện phần lớn oly cưa, đặc biệt SSAs I.3 NHỮNG GEN LIÊN QUAN ĐẾN TIÊN LƯỢNG VÀ ĐIỀU TRỊ UTĐTT Với đời nhiều lựa chọn hóa trị liệu với sẵn có liệu há sinh học, tỷ lệ tử vong bệnh nhân UTĐTT giảm Trong 20 năm qua, thời gian s ng th m UTĐTT di tăng gấ đôi Tuy nhi n, ung thư đại trực tràng nguy n nhân th hai gây tử vong li n quan đến ung thư Mỹ, cần có chiến lư c điều trị Một s đột biến sinh dưỡng dấu ấn sinh học giú ti n lư ng ti n đoán đá ng với liệu há điều trị chuy n biệt UTĐTT Những đột biến li n quan đến gen KRAS, BRAF, PIK3CA, AKT1, SMAD4, PTEN, NRAS, TP53 TGFBR2 Hơn nữa, s sản hẩm gen đột biến mục ti u cho hát triển thu c điều trị tương lai Các đột biến gen PTEN xảy – 14% UTĐTT PTEN gen c chế kh i u, ch c PTEN khiến tăng cường tín hiệu đường PI3K/AKT Mất biểu PTEN kèm với đột biến KRAS, BRAF PIK3CA Các đột biến sinh dưỡng PTEN dấu hiệu ti n lư ng bệnh nhân UTĐTT giai đoạn IV Vai trò ch c PTEN đá ng với chất c chế PI3K mTOR đư c nghi n c u thử nghiệm lâm sàng Các nghi n c u tiền lâm sàng cho thấy chất c chế 110α-PI3K đặc hiệu cần thiết để điều trị bệnh ung thư khiếm khuyết PTEN chất c chế an-PI3K PX866 có hiệu loại ung thư đột biến PIK3CA ung thư có ch c PTEN Các đột biến ch c gen PTEN nhạy cảm với chất c chế PI3K-mTOR chất c chế FRAP/mTOR Trong nghi n c u hồi c u, biểu PTEN có li n quan đến giảm độ nhạy cảm UTĐTT với kháng thể kháng EGFR, cetuximab Đột biến gen KRAS gặ khoảng 36 - 40% UTĐTT Phần lớn đột biến xảy codon 12, 13 61 gen KRAS Các đột biến tạo n n tình trạng kích hoạt li n tục đường dẫn truyền tín hiệu KRAS Đột biến KRAS làm cho tế bào kháng với điều trị kháng thể đơn dòng ch ng EGFR Khoảng - 15% UTĐTT có mang đột biến BRAF Đột biến BRAF có liên quan với UTĐTT bên phải làm giảm tỷ lệ s ng toàn Bệnh nhân UTĐTT mang đột biến BRAF khơng đá ng với thu c kháng thể đơn dịng ch ng EGFR cetuximab anitumumab Đột biến BRAF đư c báo cáo nhiều đột biến V600E Các đột biến gen NRAS xảy khoảng - 6% UTĐTT NRAS bình thường, với BRAF KRAS bình thường, có li n quan đến đá ng với liệu há kháng thể ch ng EGFR Một s nghi n c u cho thấy bệnh nhân có kh i u bị đột biến NRAS dường đá ng với cetuximab anitumumab Các đột biến sinh dưỡng gen PIK3CA đư c phát 10 - 30% UTĐTT Những đột biến thường xảy exon exon 20, gây kháng với điều trị kháng thể đơn dòng ch ng EGFR I.4 KỸ THUẬT ASO-PCR Khái niệm ASO (Allel specific oligonucleotide) Một ASO đoạn ngắn DNA đư c tổng h p hố học từ trình tự DNA xác định Nó hoạt động probe với có mặt DNA mục tiêu thí nghiệm Southern blot, phổ biến hơn, thí nghiệm Dot blot Nó cơng cụ phổ biến đư c sử dụng thử nghiệm di truyền, pháp y, nghiên c u sinh học phân tử Một ASO thường oligonucleotide dài từ 15-21 nucleotide Nó đư c thiết kế sử dụng cho đặc hiệu với allele DNA đư c thử nghiệm Chiều dài ASO đư c chọn lọc quy định theo khả gắn đặc hiệu với DNA mục ti u, có nghĩa trình tự ASO phải đủ dài để đặc hiệu với đoạn gen đư c phân tích, chiều dài tỷ lệ GC:AT ASO yếu t quan trọng nhiệt độ lai đư c thực gần với Tm chúng, Tm lại phụ thuộc vào chiều dài tỷ lệ GC:AT Các probe ASO thường đư c thiết kế để phát khác biệt nhỏ, đến m c base trình tự mục ti u, khả thí nghiệm hân tích đa hình đơn nucleotide (SNP), quan trọng phân tích kiểu gen dự án nghiên c u Genome người Để đư c phát sau gắn với trình tự mục tiêu, ASO phải đư c đánh dấu với với phóng xạ, enzym, huỳnh quang (ví dụ: nhóm phosphate mang ph t phóng xạ đư c gắn vào đầu 5’) Kỹ thuật phân tích Methyl hóa Illumina sử dụng ưu điểm ASO phát khác biệt m c base pair (cytosine so với thymine) để đo methyl hóa vùng C G đặc hiệu Lịch sử đời ASO-PCR Việc sử dụng oligonucleotide tổng h p robe đặc hiệu cho biến đổi trình tự gen đư c thực tiên phong R Bruce Wallace, làm việc trung tâm y tế qu c gia City of Hope Duarte, California Năm 1979, Wallace đồng nghiệ báo cáo việc sử dụng robe ASO để phát biến thể loại virus vi khuẩn s i đơn, sau dụng kỹ thuật để phân tích gen người Trong năm 1983 1985, hịng thí nghiệm Wallace báo cáo việc phát đột biến bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm mẫu ch a DNA toàn bộ gen, thời điểm kỹ thuật sử dụng lư ng nhỏ chất đánh dấu đư c gắn ASO Cùng thời điểm đó, PCR - phương pháp khuếch đại lớn đoạn gen đặc hiệu DNA, đư c báo cáo vào năm 1985 Kỹ thuật PCR thân phát tính đa hình di truyền, ASO PCR Tuy nhiên, đơn giản tính linh hoạt kết h p phương há PCR / ASO dẫn đến việc người ta bắt đầu sử dụng Trong vịng chưa đầy năm sau, kỹ thuật PCR đư c kết h p với kỹ thuật phân tích ASO, kết h giải đư c vấn đề đánh dấu ASO với s lư ng DNA mục tiêu đư c khuếch đại triệu lần Vì vậy, khả khuếch đại quy trình PCR đư c kết h p với probe ASO, giú giảm thiểu vấn đề gắn sai ASO với trình tự mục tiêu Sự kết h đủ đặc hiệu để đư c sử dụng thí nghiệm Dot blot đơn giản, tránh phương pháp Southern blot thời gian không hiệu Sau đó, lần lư t probe ASO khơng gắn phóng xạ đư c sử dụng để phát đột biến gen người đư c thực năm 1992 nghi n c u xơ gan (cystic fibrosis), năm 1994 bệnh thiếu máu dạng beta-thalassemia Nguyên tắc ASO-PCR Dựa nguyên tắc hương há PCR bình thường khác chỗ bổ sung vào phản ng tổng h p mồi xi khác có nucletide đầu 3’ tương ng với đột biến tạo nên allele gene, gene có allele có nhiêu mồi xi tương ng cịn mồi ngư c gi ng tất phản ng Phản ng PCR xảy đầu 3’-OH mồi đư c bắt cặp cách hồn chỉnh vào mạch khn, dựa vào nguyên tắc ta xác định mẫu có xuất đột biến điểm biết trước hay không hương há ASO-PCR DNA olymerase đư c sử dụng polymerase khơng có hoạt tính 3’ exonuclease Vì thế, với điều kiện đư c thiết lập thích h p, phản ng PCR cho phép khuếch đại trình tự mục tiêu có bắt cặp bổ sung xác với mồi đư c thiết kế Ưu nhược điểm phương pháp ASO PCR Kỹ thuật ASO-PCR lần đầu ti n đư c mô tả nghiên c u tế bào ác tính bệnh nhân đa u tủy[5] Đây kỹ thuật nhạy, cho phép phát bất thường gen tế bào ác tính quần thể 104-105 tế bào bình thường Ưu điểm hương há nhanh chóng, đơn giản, khơng sử dụng phóng xạ đảm bảo độ xác cao Vì vậy, khơng đòi hỏi khoa xét nghiệm sinh học phân tử hay khoa giải phẫu bệnh phải đư c trang bị đại Trong hạn chế hương há bỏ sót đột biến mới, đặc biệt nghiên c u vùng, dân s Hình 1.1 Nguy n tắc hương há ASO-PCR CHƯƠNG II: Đ I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Bệnh nhân UTĐTT đư c xét nghiệm tìm đột biến gen KRAS NRAS để giú lựa chọn đ i tư ng hù h cho điều trị kháng thể đơn dịng ch ng EGFR Chúng tơi tiến hành khảo sát đột biến gen BRAF tr n bệnh nhân đư c xác định khơng có đột biến gen KRAS NRAS II.2 Nghi n c u đư c thực Trung tâm Y Sinh học Phân tử – Đại học Y Dư c TP.HCM Tách chi t genomic NA t m u m v i n n: Thu hoạch tế bào ung thư từ mơ vùi nến sau đư c chẩn đốn giải hẫu bệnh cho vào tube 1,5 ml Tách chiết genomic DNA Wi ard Genomic DNA Purification Kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Thi t m i cho PCR se uencing: Cặ mồi nhân vùng exon 15 gen BRAF đư c thiết kế hần mềm CLC Main Workbench v5.5 Mồi xuôi BRAF600F (5’- ACTCTTCATAATGCTTGCTC-3’) mồi ngư c BRAF-600R (5’CCACAAAATGGATCCAGACA-3’) Thi t l p điều iện PCR: Mỗi hản ng (20 l) bao gồm thành hần: 0,2 l Taq DNA olymerase (5U) Takara; l đệm 10X; l dNTPs (2,5mM); l loại mồi (10 M); 1,5 l genomic DNA (100 ng/ l) 12,3 l H 2O Kỹ thuật PCR đư c tiến hành tr n máy luân nhiệt Mastercycler Pro S (E endorf, Đ c) với chu trình nhiệt sau: khởi đầu hản ng 98oC hút, theo sau 40 chu kỳ (98oC 10 giây, 58oC 20 giây, 72oC 40 giây) kết thúc 72 oC hút Các hản ng kèm theo ch ng âm khơng ch a DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Kiểm tra sản ph m PCR b ng điện di: Sản hẩm PCR đư c hát điện di tr n thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide quan sát hệ th ng chụ gel GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ) Tinh s ch sản ph m PCR: Sản hẩm PCR đư c tinh kit ExoSAPIT® PCR Product Cleanup (Thermo Scientific) theo hướng dẫn nhà sản xuất Th c giải trình t : Sản hẩm PCR đư c tinh đư c thực hản ng cycle sequencing với BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (A lied Biosystems, Mỹ), theo chiều xuôi ngư c cho đoạn cần đọc Sản hẩm sau đư c kết tủa ethanol, hịa tan Hi-Di foemamide, biến tính 95oC hút trước làm lành đột ngột Trình tự DNA đư c đọc máy ABI PRISM 3500 Genetic Analy er (A lied Biosystems, Mỹ) Kết đư c hân tích hần mềm CLC Main Workbench v5.5 Thi t m i cho ASO-PCR: Chúng thiết kế đoạn mồi xuôi BRAF-ASOF đặc hiệu cho alen mang đột biến c.1799T>A gen BRAF sau: 5’GATTTTGGTCTAGCTACGGA-3’ Trong mồi BRAF-ASOF, vị trí nucleotide đầu ti n đầu tận 3’ đư c thay từ T sang A Đồng thời, để tăng tính đặc hiệu mồi, vị trí nucleotide th đầu tận 3’ đư c thay từ A sang G(12) Mồi ngư c cho hản ng ASO-PCR BRAF-R (5’- GTAACTCAGCAGCATCTCAG3’) Các đoạn mồi đư c tổng h Integrated DNA Technologies (Mỹ) CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN III.1 ệ độ b ế 1799T>A bằ ả rì ự Sa er Phương há en yme đư c Sanger cộng há minh vào năm 1977 Trước hết, chèn đoạn DNA cần hải xác định trình tự vào vector phage hay lasmid vị trí mà trình tự chuỗi vị trí đư c xác định rõ Biến nạ vecto vào tế bào vi khuẩn để nhân vecto thành nhiều sao, sau tách chiết tinh vecto từ vi khuẩn thành vecto tự Dùng đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vecto vị trí chèn đoạn DNA Th m vào ng hản ng en yme DNA olymerase loại nucleotide tự (gọi dNTP) lư ng giới hạn dideoxynucleotide (ddNTP) Cũng dNTP, ddNTP cần có loại tương ng với base A, T, G, C Phản ng đư c thực ng, ng với loại ddNTP khác Bắt đầu từ mồi, en yme DNA olymerase kéo dNTP vào để tổng h tổng h h mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn tr n vecto, mạch đơn dừng lại vị trí mà ddNTP đư c gắn vào Lí tổng bị dừng lại ddNTP có cấu trúc hóa học bị g c OH vị trí carbon th đường deoxyribose, mà g c OH vị trí nơi để dNTP kế tiế gắn vào Nhờ vậy, ng hản ng có mạch đơn DNA có chiều dài khác tương ng với vị trí trình tự nucleotide tr n đoạn DNA g c Để thực đư c giải trình tự máy tự động mạch DNA đơn sản sinh ng hản ng giải trình tự hải đư c đánh dấu huỳnh quang để vạch điện di mạch đơn hát sáng qua chùm tia sáng laser Cấu tạo máy tự động giải trình tự gồm hai hần Phần điện di polyacrylamide gel ng mao quản ch a gel Phần hát vạch điện di mắt cảm quang chùm tia laser qua trước Nguy n tắc hoạt động máy su t trình điện di, có vạch điện di qua chùm tia laser vạch điện di hát sáng, hát sáng đư c mắt cảm quang ghi nhận lưu lại thành đỉnh cường độ sáng biểu đồ Từ biểu đồ đỉnh sáng này, máy so dòng đỉnh tương ng với màu để cu i hân tích thành trình tự đoạn DNA Với hệ máy sau này, người ta dùng màu huỳnh quang khác để đánh dấu loại ddNTP, nhờ hản ng giải trình tự đư c thực ng nghiệm giải trình tự cần điện di tr n hàng mà không hải tr n hàng khác trước Nếu dùng điện di mao quản tuỳ thuộc vào s mao quản mà người làm thí nghiệm chạy s mẫu nhiều hay Các đột biến BRAF KRAS/NRAS có tính loại trừ lẫn UTĐTT, nghĩa không xuất tế bào ung thư (8,14) Điều ủng hộ BRAF nhân t tác động chủ yếu KRAS/NRAS đường RAS/RAF/MAPK hai đột biến có ảnh hưởng tương đương với hình thành kh i u Để thiết kế chuẩn hóa đư c hản ng ASO-PCR giúp phát đột biến BRAF, trước ti n tiến hành tìm kiếm mẫu ch ng dương có mang đột biến c.1799T>A gen BRAF cách giải trình tự DNA theo kỹ thuật Sanger Dùng cặ mồi BRAF-600F BRAF-600R, khuếch đại hần exon 15 gen BRAF từ DNA đư c tách chiết từ mẫu bệnh hẩm Hình 3.1 minh họa kết hát đột biến c.1799T>A Hình 3.1 Đột bi n c.1799T>A gen BRAF phát b ng giải trình t NA theo ỹ thu t Sanger III.2 C ẩ óa đ ề k ệ ASO-PCR Sau có ch ng dương mang đột biến c.1799T>A, tiến hành chuẩn hoá điều kiện ASO-PCR để hát đột biến Trong hản ng ASO-PCR sử dụng lúc cặ mồi Cặ mồi th dùng để kiểm tra chất lư ng DNA hiệu hản ng PCR cho lần chạy: cặ mồi khuếch đại exon 13 gen RB1 (394 b ), với mồi xuôi 5’-CAGTAGTTGTGGTTACCTAG3’ mồi ngư c 5’-CAGCAGGGATATAGTATCTG-3’ Cặ mồi tr n có nhiệt độ bắt cặ tương tự cặ mồi BRAF-ASOF BRAF-R (143 b ) dùng để hát đặc hiệu alen có mang đột biến c.1799T>A gen BRAF Thơng qua q trình chuẩn hóa điều kiện, chúng tơi thiết lậ đư c điều kiện nhiệt độ bắt cặ thích h 540C Hình 3.2 minh họa kết ASO-PCR thực tr n mẫu có khơng có đột biến c.1799T>A Hình 3.2 K t uả điện di sản ph m ASO-PCR Gi ng 1: chứng âm, h ng mang đột bi n c.1799T>A gen BRAF Gi ng 3: m u có đột bi n c.1799T>A gen BRAF Gi ng 4: nước Gi ng 5: b Plus NA ladder III.3 Kế q ả k ảo s độ b ế r mẫ bệ â ng dụng kỹ thuật ASO-PCR đư c xây dựng tr n, tiến hành khảo sát đột biến tr n 86 bệnh hẩm UTĐTT: bao gồm 57 bệnh nhân nam 29 nữ Kết hát 17 trường h có đột biến, chiếm 19,8% Có nhiều đường dẫn đến hát sinh UTĐTT Con đường điển hình từ u tuyến đến carcinôm thường kèm với ch c gen c chế kh i u APC và/hoặc P53, dẫn đến bất ổn định nhiễm sắc thể Con đường th hai li n quan đến ch c gen sửa lỗi bắt cặ sai DNA, đư c minh họa đột biến dòng mầm hội ch ng Lynch BRAF dường tác động thông qua đường th ba: đường tăng methyl hoá Các kh i u mang đột biến BRAF đư c xem thể bệnh ri ng biệt Ung thư có mang đột biến BRAF thường có tình trạng methyl hóa cao so với ung thư khơng có đột biến BRAF Ngồi ra, đột biến BRAF li n quan chặt chẽ với bất ổn định vi vệ tinh Trong UTĐTT không di truyền, đột biến BRAF đư c tìm thấy khoảng 60% kh i u có bất ổn định vi vệ tinh cao gặ – 10% kh i u ổn định vi vệ tinh(4,7,14) Điều đột biến BRAFV600E gây methyl hóa m c vùng khởi động gen MLH1, dẫn đến ch c c chế kh i u khiếm khuyết sửa sai bắt cặ DNA(8,19) Về kiểu hình, UTĐTT có đột biến BRAF thể đặc điểm khác với UTĐTT có BRAF bình thường Các kh i u có đột biến BRAF thường gặ bệnh nhân nữ bệnh nhân cao tuổi, >70 tuổi (9,11,17) Ung thư khơng có đột biến BRAF hân b khắ nơi đại tràng trực tràng; đó, ung thư với BRAF đột biến xảy đại tràng trái trực tràng, thay vào chủ yếu nằm đại tràng gần(9,18) Bệnh nhân UTĐTT có đột biến BRAF thường đá ng đ i với liệu há quy ước có thời gian s ng cịn tồn ngắn Samowit cộng (16) khảo sát 911 bệnh nhân giai đoạn từ I đến IV ung thư đại tràng Đột biến BRAF đư c tìm thấy 9,3% tất kh i u 52% kh i u có bất ổn định vi vệ tinh cao Thời gian s ng cịn tồn năm bệnh nhân UTĐTT có đột biến BRAF thấ đáng kể so với nhóm khơng có đột biến (47,5% so với 60,7%) Đột biến KRAS dấu ấn sinh học đư c xác định rõ giú ti n đoán đề kháng với liệu há ch ng EGFR UTĐTT Gen sinh ung KRAS làm cho kh i u đại trực tràng kháng lại liệu há ch ng EGFR cách hoạt hóa đường RAS/RAF/MAPK hạ nguồn EGFR Một s nghi n c u cho thấy đột biến BRAF mang lại kết với liệu há ch ng EGFR thông qua chế tương tự(5,13) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kỹ thuật ASO-PCR giú hát đột biến c.1799T>A gen BRAF cách nhanh chóng xác Trong nhóm bệnh nhân UTĐTT khơng bị đột biến gen KRAS NRAS, có đến 19,8% mang đột biến c.1799T>A gen BRAF N n ng dụng kỹ thuật vào chẩn đoán đột biến cho bệnh nhân ung thư, gó hần vào việc ti n lư ng lựa chọn điều trị hù h cho b nh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO Beeram M, Patnaik A, Rowinsky EK (2005) Raf: a strategic target for therapeutic development against cancer J Clin Oncol;23(27):6771-90 Chang DZ, Kumar V, Ma Y, Li K, Kopetz S (2009) Individualized therapies in colorectal cancer: KRAS as a marker for response to EGFR-targeted therapy J Hematol Oncol;2:18 Cohen SJ, Cohen RB, Meropol NJ (2005) Targeting signal transduction pathways in colorectal cancer-more than skin deep J Clin Oncol;23(23):537485 Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, et al (2002) Mutations of the BRAF gene in human cancer Nature;417(6892):949-54 Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, Arena S, et al (2008) Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer J Clin Oncol;26(35):5705-12 Fang JY, Richardson BC (2005) The MAPK signalling pathways and colorectal cancer Lancet Oncol;6(5):322-7 Fransén K, Klintenäs M, Osterström A, Dimberg J, Monstein HJ, Söderkvist P (2004) Mutation analysis of the BRAF, ARAF and RAF-1 genes in human colorectal adenocarcinomas Carcinogenesis;25(4):527-33 French AJ, Sargent DJ, Burgart LJ, et al (2008) Prognostic significance of defective mismatch repair and BRAF V600E in patients with colon cancer Clin Cancer Res;14(11):3408-15 Kalady MF, Dejulius KL, Sanchez JA, et al (2012) BRAF mutations in colorectal cancer are associated with distinct clinical characteristics and worse prognosis Dis Colon Rectum;55(2):128-33 10 Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al (2008) K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer N Engl J Med;359(17):1757-65 11 Li WQ, Kawakami K, Ruszkiewicz A, et al (2006) BRAF mutations are associated with distinctive clinical, pathological and molecular features of colorectal cancer independently of microsatellite instability status Mol Cancer;5:2 12 Liu J, Huang S, Sun M, Liu S, Liu Y, et al (2012) An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application Plant Methods;8(1):34 13 Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, Vincenzi B, Salvatore L, et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer Br J Cancer;101(4):715-21 14 Rajagopalan H, Bardelli A, Lengauer C, et al (2002) Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status Nature;418(6901):934 15 Safaee Ardekani G, Jafarnejad SM, Tan L, Saeedi A, Li G (2012) The prognostic value of BRAF mutation in colorectal cancer and melanoma: a systematic review and meta-analysis PLoS One;7(10):e47054 16 Samowitz WS, Sweeney C, Herrick J, et al (2005) Poor survival associated with the BRAF V600E mutation in microsatellite-stable colon cancers Cancer Res;65(14):6063-9 17 Tie J, Gibbs P, Lipton L, Christie M, Jorissen RN, et al (2011) Optimizing targeted therapeutic development: analysis of a colorectal cancer patient population with the BRAF(V600E) mutation Int J Cancer;128(9):2075-84 18 Tran B, Kopetz S, Tie J, et al (2011) Impact of BRAF mutation and microsatellite instability on the pattern of metastatic spread and prognosis in metastatic colorectal cancer Cancer;117(20):4623-32 19 Wang L, Cunningham JM, Winters JL, et al (2003) BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair Cancer Res;63(17):5209-12  ... an-PI3K PX866 c? ? hiệu loại ung thư đột biến PIK3CA ung thư c? ? ch c PTEN C? ?c đột biến ch c gen PTEN nhạy c? ??m với chất c chế PI3K-mTOR chất c chế FRAP/mTOR Trong nghi n c u hồi c u, biểu PTEN c? ? li n... hẩm ASO- PCR THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN C? ??U ĐỀ TÀI KHOA H? ?C VÀ C? ?NG NGHỆ C? ??P TRƯỜNG Thông tin chung: - T n đề tài: Khảo sát đột biến c. 1799T>A gen BRAF ung thư đại – tr? ?c tràng kỹ thuật ASO- PCR. .. - M? ?c ti u chung: X? ?c định đư c tỷ lệ đột biến c. 1799T>A gen BRAF ung thư đại tr? ?c tràng tr n bệnh nhân Việt Nam - M? ?c ti u c? ?? thể: 1) Xây dựng đư c quy trình ASO- PCR để x? ?c định đột biến c. 1799T>A