Phân lập và tuyển chọn các chủng azotobacter để ứng dụng trong nông nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI h ọ c k h o a h ọ c tịt n h i ê n _ ***** _ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG AZOTOBACTER ĐỂ ÚNG DỰNG TRONG NƠNG NGHIỆP M ã sơ' Q T - - Chù trì đề tài: TS Ngơ Tự Thành Hà nội, 2003 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự N H Ể N ***** PHẢN LẶP VÁ TUYÊN CHỌN CÀC CHUNG AZOTOBACTER ĐỂ ÚNG DỤNG TRONG NƠNG NGHIỆP M ã sơ' OT - - C hủ trì đ ề tà i : TS Ngô Tự Thành C c cán th a m gia: Ths Vũ Thị Minh Đức CN Hoàng Thị Lan Anh Ths Nguyễn Thu Hà TS Nguyễn Ngọc Quyên -?A !— J O C G 'M T P i j N G ’ i-r/ TH ' Õ N G t in ~ ' D T ? ' o ị Hà nội, 2003 Th V u BÁO CÁO TÓM TẮT a Tên đề tài Phần lập tuyển chọn chủng Azotobacter để ứng dụng nịng nghiệp Mã sơ : QT - 02 - 17 b Chủ trì để tài: TS Ngơ Tự Thành c Các cán tham gia: - Ths Vũ Thị Minh Đức, khoa Sinh học, ĐHKHTN - CN Hoàng Thị Lan Anh, Khoa Sinh học, ĐHKHTN - Ths Nguyễn Thu Hà, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Văn Điển, Thanh Trì, Hà nội - TS Nguyễn Ngọc Quyên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Vãn Điển, Thanh Trì, Hà nội d Muc tièu nội dung nghiên cứu: Phàn lập tuyển chọn chủng Azotobacter có số hoạt tính sinh học q nhằm sử dụng việc sản xuất phàn vi sinh vật e Các kết đạt được: - Từ 50 mẫu đất canh tác thu thập địa phương phân lập 18 chùng Azotobacter Tuy khỏng phải tất mảu đất có mật loại vi khuẩn Chúng chi phân lập Azotobacter từ mẫu đất có pH khống 5.15 đến 7,15 Những mẫu đất có pH tháp khơng phàn lập loại vi líhn Việc hong khơ đất làm tâng tính chọn lọc phàn lâp Aiotobacỉer phần loại trừ Azomonas loại vi khuấn 2Íống Azotobacter không tạo thành bào nang - Trong số chủng phân lâp, chọn đươc 03 chủna (ký hiệu 86.2 76.6, 20.2) có hoạt tính khử axetylen - etylen (acetylene reduction assay - ARA) 181.58 ; 141.9 : 167,55 nM C:Hj/mi/h Cả chủng đểu hình thành axit indol axetic (indole - 3- acetic acid - IAA) hocmon sinh trướng thưc vật thuộc nhóm auxin, với hàm lương 7,57 ; 9,50 ; 5,73 Lig/ml dịch nuôi cấy Cá hai hoạt tính ARA IAA chủng nàv cao hoạt tính biểu chùng Azorobacter chroococcum A T I9 nhập nội dùng đế sản xuất phân VI sinh vàt - Chúng 86.2 có khả náng phàn giái chất dièt cò 2,4D Tuy hoạt tính chưa cao đặc điểm đáng ý - Các thừ nghiệm sinh hoc cho thấy chùng phàn làp kích thích nảy mầm hạt ngổ té p l l lên 5,71% Đãc biệt với ngỏ lai ĐK888 (loai hat khó nảy mầm), dịch ni vi khuẩn làm tâng ti lệ nảv mầm từ 8,57 - 14,29% so với đối chứng ngâm ù bảng nước - Các công thức bón thêm chủng 86.2 ; 76.6 ; 20.2 qui mô châu vại cụ xuân hè thu cho náng suất rau cao công thức đối chứng Hơn nữa, chất lượng rau cải tráng thí nghièm cải thiện: hàm lượng đường tổng số, vitamin c cao đối chứng Hàm lượng N O ; giảm rõ rệt rau lơ thí nghiêm - Chúng tòi cho chủns Azotobacter chùn? phân lâp tu y ế n c h ọ n đ ể u sử d u n g để sản x u ất ph ân bón VI sinh vật cán trực tiếp đánh giá trẽn quv mỏ đổna ruónợ C- - Bài báo: 01 Đào tạo: 01 Cử nhân f Tình hình kinh phí cùa đề tài - Tổng số kinh phí phàn bổ: 8.000.000 đ (Tám triệu đồng) Đã chi khoản sau: • Quản lí phí 320.000đ • Điện nước 160.000đ • Th khốn chun mơn 4.800.000đ • Vật tư 2.720.000 đ Cộng 8.000.000đ Đã toán xong nãm 2002 Xác nhận BCN khoa (Kí ghi rõ họ tên) Chủ trì đề tài (Kí ghi rõ họ tên) 7^ Cơ quan chủ trì đề tài o h ỏ m iê u TRU Ô N G /T ỷ * * 77,: LIST OF THE SCIENTIFIC PROJECT IN THE YEAR 2002 OF UNU LEVER Branch: Biology P ro je c t: Screening Azotobacter for agriculture purposes Num erical code: QT - 02 - 17 Supervising agency: VNU R esponsible agency: Hanoi University of Science Com bined agency: M ain responsible person: Dr Ngo Tu Thanh Com bined responsible: - MS Vu Thi M inh Due, Hanoi University of Science - BS Hoang Thi Lan Anh, Hanoi University of Science - MS Nguyen Thu Ha, Vietnam Agricultural Science (VASI) - Dr Nguyen Ngoe Quyen, VASI Im plem enting period: from 2002 to 2003 10 T h e ta rg e t of p ro ject: Screening Azotobacter for agriculture purposes 11 Abstract of the content and the result: - Result of Science and Technology: From 50 soil samples, 18 Azotobacter strains were isolated All of them were isolated from soil samples having pH values from 5.15 to 7.75 In the soils having lower pH A zotobacter was not found Drying soil samples seemed to be a sood improvement of the isolation: perhaps the selectivity of the soil was increased, a benificial result to Azotobacter while Azotomonas was killed because of lacking in cysts Among the isolated strains, strains (N° 86.2, 76.6 and 20.2) were selected because of their good properties: having activity of acetvlene reduction assay (ARA) and activity o f producing indol - acetic acid (IAA) - a plant hormone of auxin group The first activity of these strains was of 181.58 141.90 and 167.55 mVl C:H / ml/ h respectively The second one was of 7.57, 9.50 and 5.73 u s/ ml, respsectively Both activities ARA and IAA of these strains were greater than those of Azotobacter chroococcum AT 19 - a imported strain used in microbial inoculant production The strain 86.2 was able to decompose the herbicide 2.4 dichlorophenoxy acetate (2.4D) It is interesting, although its activity was not very high The bio - assay showed that the culture supernatant liquor of all isolated strains stimulated the germination of maize grains The grain gem in atio n proportion of the maize race PI was increased by 5.71%, and of the maize hvbrid race DK888 (difficult to be germinated) - by 8.57 - 14.29% in comparison with the control (grains incubated with water) On pot - scale, in both harvests (spring and summer), in all the soil formulae for inoculation with above strains, the celery cabbage (Brassica chinensis) productivity was higher than that of control without inoculation The quality of this vegetable was clearly improved: the contents of total sugar and vitamin c were higher than those of control, while the NO-,' amount was decreased With the above properties, all the selected strains were considered suitable for production of microbial inoculant It is necessarv to evaluate the effectiveness of these strains on vegetable yields on field - scale Result of training: 01 Bachelor Degree To contract the material and technical bases Practical application possibility Publication: 01 paper (printing) Danh mục chữ viết tát - ARA : Acetylene reduction assay - AND : Axit dezoxiribonucleic - CHQ : Chlorohydroxyquinol - 2.4D : 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid - DHQ : Dihydroxvquinol - IAA : Indol acetic acid - N2 - aza : Nitrogenaza - TCP : 2.4.6 Trichlorophenol MỤC LỤC Trang Lời m đ ầ u 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Đặc điểm chi họ A zotobacteraceae 1.1.1 M ột sô' đặc điểm chi Azotobacter 1.1.2 M ột số đặc điểm chi A zom onas 1.2 Sự phãn bố cùa Azotobacter loại đ ất 1.3 Chế phấm phân bón sinh học chứa Azotobacter hiệu trona trồng trọt nghiên cứu ban đầu 1.4 Khả hình thành axit indol axetic (IA A ) 1.5 Độc tính 2.4D khả nãng phân giái số hợp chất có chứa nhãn thơm cùa Azotobacter 1.5.1 Độc tính cùa 2.4D 1.5.2 Khả nâng phân giải hợp chất có chứa vịng thơm cúa A zotobacter 8 Vật liệu phương pháp 10 2.1 Vật l i ệ u 10 2.1.1 M ẫu đất vi sinh vật 10 2.1.2 Các hoá chất chất thử 10 2.1.3 Các máv m ó c 10 2.1.4 Các mỏi trường 11 2.2 Phưcma pháp 11 2.2.1 Phân lập Azorobacter 11 2.2.2 Cách đo pH cùa mảu đ ất 11 2.2.3 Xác định đặc điểm tế bào Azotobacter 11 2.2.4 Khả nãng cô' định ni tơ 12 2.2.5 Xác định IAA 12 2.2.6 Khả nãng phân giải 2.4D 12 2.2.7 Tác động cùa dịch nuôi vi sinh vật tới nảy m ầm hạt ngô 13 2.2.8 Thí nghiệm qui mơ chậu vại với rau cải trắng 14 2.2.9 Cách làm tiêu để quan sát hình dạng tế bào A iotobacter kính hiển vi điện tử quét 14 Kết thảo luận 15 3.1 Phân lập A zotobacter spp Từ mẫu đất có pH khác 16 3.2 Một số đặc tính sinh học chùng A zotobacter sử dụng nghièn cứu 16 3.3 Phản ứng khử axetylen - etylen 19 3.4 Sự chuyển hoá trytophan thành IAA chủng A zotobacter 19 3.5 Sự phân giải 2,4D 20 3.6 Ảnh hường dịch nuôi đến nảy mầm hạt ngô 26 3.7 Năng suất chất lượng rau cải tráng bón thèm A zotobacter 27 Kết l u ậ n 29 Tài liệu tham k h áo 30 LỜI M Ở ĐẦU Khai thác sử dụng vi sinh vật có ích phục vụ cho nơng nghiệp hướng đại góp phán tâng nâng suất cày trồng làm giảm ô nhiễm môi truờng A zotobacter vi khuẩn hiếu khí, sống tự đất có nâng cố định nitơ phân tử Khả biết tới từ lâu Chế phẩm sinh học có chứa Azotobacter đật tẽn Azotobacterin mang lại thay đổi tích cực nãng suất chất lượng càv trồng Trước đâv, người ta lầm tường hiệu mà chế phám mang lại cố dinh nitơ cùa vi khuấn Tuv nhiên, thực tế cho thấy q trình cố định nitơ khơng diễn mơi trường có chứa amon dù mỏt lượng nhó Có lẽ hiệu quà mà chế phẩm Azotobactenn mang lại Azotobacter tiềm tàns khả khác Các nahièn cứu sau khầnợ định: hiệu tót việc xử lý hạt với dịch huyén phù Azotobacter trước 2ieo trổna phim lớn Azotobacter có khả tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật (axit indol axetic axit sibberellic), vitamin (B l B2 nicotinic, piridoxyl ) khả nãna tiết axit amin mỏi trường [7], Những khả nãns xem đặc tính tốt cần khai thác Gán mỏt số nhà khoa hoc nshiẽn cứu tháo luận nănợ phân giai mòt số hợp chát vòng thơm (nhữna chất độc người mỏi trườnă) cùa vi khuán Đây đặc tính q cịn biết tới Vì vậy, việc phân lặp tuvển chọn chúnơ Azotobacter có đặc tính quí ổn định sử dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh dùng cho nỏna nghiệp lả cần thiết, bời lẽ chế phám góp phán giãi quvết vấn đé ỏ nhiẻm mỏi trườna đam bảo an toàn thực phấm Wavelength Ịnm.Ị Hình 7d Độ hấp phụ 2,4D mẫu ni cấy có bổ sung glucoza 20g/l (hàm lượng 2,4D lại 156.9mg/l) Qua kết nhận thấy chùng 86.2 có khả phân giải 2,4D K hi 10 g/1 glucoza thêm vào mơi trường, lượng 2,4D cịn sót lại thấp Tuy hoạt tính khịng mạnh chi Pseudomonas, A lcaligenes m ột đặc tính quý chùng Azotobacter mà chúng tõi phân lập Để chứng minh có mật chất kích thích sinh trưởng thực vật có dịch ni Azotobacter, chúng tơi tiến hành thử nghiệm sinh học (biotest) Viện Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam Kết trình bàv mục đây: 3.6 Ánh hường dịch nuôi đèn nẩy mầm hạt ngỏ Sau xử lý ngâm ủ với dịch nuôi cấy pha lỗng 5%, chúns tơi nhặn thấv dịch nuỏi chủng 86.2 76.1 20.2 đểu kích thích nảy mầm hạt ngơ (bána hình 8) Với ngị lai ĐK.888 tý lệ náy mẩm tâng từ 8,57 đến 14,29% so với đối chứng không ngâm ù với dịch vi khuẩn Tỷ lệ nảv mầm nsô tẻ p l l tăng 5.71% Đặc biệt chủng 86.2 làm tảng náy mầm hạt n2ô lai ĐK.888 lên 2.86% so với chủng AT 19 Bàng Ánh hường dich nuòi Azotobacter spp đến nàv mám hạt ngò Tý lệ nảy mầm (%) Chủng Ngỏ lai ĐK.888 N 2Ỏ té P 1 Đối chứng (H ị O) 48.57 94.29 86.2 62.86 100 76.1 57.14 100 20.2 60.00 100 AT 19 60.00 100 26 86.2 Đối chứng AT 19 Hình Anh hường cùa Azotobacter lên nảy mầm cùa hat nsô lai ĐK 888 3.7 N ăng suất chát lượng rau cài tráng bón thèm Azotobacter sp Thí nghiệm tiến hành qui mô châu vại Viện khoa học kĩ thuật nịng nghiệp Việt Nam Ngồi phàn NPK châu đươc bón thèm 107 CFU A zotobacter sp Sau 45 ngày, suất chất lượna rau trắng đươc kiếm tra Kết nẽư bảna hình Bảng Năng suất rau cải tráng bón thèm Azotobacter sp Vụ đơng xuân S6 lá/chậu Chủna Vụ hè thu Tích Sớ Cao Khối lương Tích luỹ tươi thân luỹ chất lá/chậu cày tươi thân chát khô (g/chậu) khỏ (%) (cm) (g/chậu) ’ Khối lượn a (%) Đối chứng 49,0 90.2 5.86 33.3 22.5 108.3 5.81 86.2 53,7 121,9 6.63 34.7 23.3 126.7 6.33 76.1 49.0 141.5 6.33 35.3 22.4 110.0 6.25 20.2 49.7 110.0 5,98 33,0 22.6 120.0 AT 19 50.3 121.9 6.32 33.7 23.6 108.7 6.02 6.55 hai vụ đông xuân hè thu, công thức bón chủng 86.2 76.1 20.2 cho nãng suất cao cõng thức đối chứng (khơng bón Azotobacter) tương đương với cơng thức bón chùng AT 19 (chủng đối chứng) Chất lượng rau cải trắng bón thêm Azotobacter sp trình bày bảng Bảng Chất lượng rau cải tráng bón thèm Azotobacter sp Vụ đông xuân Chủng Vụ hè thu Đuờng Vitamin c N 3- Đường Vitamin c N 3- tổng (mg/100g) (mg/kg) tổng sò' (mg/100g) (mg/kg) số(%) (%) Đối chứng 0.92 70.37 2.745 0.96 62.91 2,270 86.2 1.04 78,17 2.095 1.36 64.52 1.908 76.1 1.16 72.47 2.106 1.28 69.50 1.741 20.2 1.02 70.64 2.609 1.24 63.45 AT 19 1.06 72.65 2.132 1.20 62.24 ’ 2.332 1.784 Theo kết phân tích Trung tâm kiểm tra tiêu chuẩn hố chất lượng nồng sản thuộc Viện sau thu hoạch, chất lượnă rau cịng thức bón 86.2 76.1 20.2 tốt Đạc biệt hàm lượng nitrat cơng thức bón chủng 86.2 76.1 thấp rau đối chứng Hình Thí nshiém ảnh hướng rau cai trắng cúa A:otobacter K ẾT LUẬN Việc hong khơ đất làm tăng tính chọn lọc phàn lập Azotobacter Loại vi khuẩn phát mẫu đất có pH từ 5,15 đến 7,75 Ba chủng Azotobacter kí hiệu 86.2, 76.1, 20.2 sinh trường tốt trẽn mơi trường nhân tạo có hoạt tính ARA cao so với chủng đối chứng A chroococcum AT 19 từ 17,0 - 56,78 nM C2H4/ml/h Sinh tổng hợp IAA ba chùng nàv cao chủng nhập nội A.chroococcum AT 19 từ 0,44 đến 2.37 us/ml Chủng 86.2 có khả phàn giải chất diệt cị 2.4D Hoạt tính chưa cao m ột điểm đáng ý Cả chủng thí nghiệm kích thích mầm cúa hạt ngô lai ĐK.888 n2ỏ té p l làm tăng suất cải thiện chất lượns rau cải trắng Có thể sử dụng chúng đê’ sản xuất phàn bón vi sinh vật sau đươc đánh giá hoạt tính qui mô lớn 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Hài, Trần Qúi Hiển (2001), Nghê làm vườn, tái lần thứ nhất, Nxb Giáo dục, tr 82 - 85 Trần Quang Hùng (1991), Thuốc trừ dịch hại bảo vệ câv trổng, Cục trổnơ trọt bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp CiNTP , tr 128 - 142 Vũ Văn Vụ, Hoàng Đức Cự, Vũ Thanh Tâm Trần Vãn Lài (1997) Sinh lý học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh Cox c (1999) "2.4D: Toxicoloav” J pesticide reform / spring, 19 pp - 19 Diab A Gounain M Y (1984) ’‘Distribution of Azotobacter Actinomyceres Cellulose - desradina Acid - producing and Phosphate dissolving bacteria in desert and salt march soil of Kuvvaite", Zbl Mikrobiol 139, pp - 3 Essavvy El A A Saved El M., Mohamed Y A H Shanshourv El A (1984) "'Effect of combined nitrogen in the production of plant growth regulation bv A zotobacter chroococcum " Zbl M ikrobiolo, 139, pp 327 333 Gonzles Lopez J Salmerson V Monero J., Cormenaza - Kamoz A (1983), “Amino acids and vitamins produced by Azotobacter vinelandii ATCC 12837 in chemically - defined media and dialycsed soil media" Soil Biol Biochem 15, pp 711 - 713 Ishizawa s., Suzuki T Araragi A (1975) “Effect of soil on Nitrogen fixation by Azotobacter vinelandii" Nitrogen fixation and Nitrogen cycle 12 pp 61 -6 30 K laasen c D., W atkins m J B (1999), Casarett and Doull's toxicology - the basic science ofpoision, 5th Me Graw - Hill pp 561 - 564 10 Latus M „ Seitz H J., Eberspacher J V., Lingen R (1995), "Purification and Characterization of Hydroxyquinol 1,2 - dioxygenase from Azotobacter sp Strain GP 1", Appl, Environ M i c r o b i o l61 pp 2453 - 2460 11 Lee M , Breckenridge c Knowles R (1970) “Effect of some culture conditions on the production of indol - - acetic acid and gibberellin - like - substance by Azotobacter vinelandii" Can J Microbiol., 16 pp 1325 - 1330 12 Li D Y Eberspacher J W agner B., Kuntzer J Linaens F (1991) " Degradation of 2,4,6 - trichlorophenol by Azotobacter sp Strain GP 1", Appl Environ M icrobiol 57, pp 1920 - 1928 13 M ishustin E N., Shilnikova V K (1969), “Free - living nitrogen - fixing bacteria of the genus Azotobacter", Soil Biology UNESCO, pp.72 - 124 14 M isra s., Kaushink B D (1989), Growth promoting subtances o f Cyanobacteria II Detections o f amino acids, sugars and auxins Proc Indian nant Sci Acad, 55, pp 499 - 504 15 R udnick p Meletzus D Green A., He L Kennedy c (1997), "Regulation of nitrogen fixation by ammonium in diazotrophic species of proteobacteria" Soil biol Biochem., 29 pp 831-841 16 Sharma p K Chahal V p s (1985 ) "The effect of amino group acceptors on the production of indolyl acetic acid from trvptophan by Azotobacter", M ic ro b io l 55, pp 1041 - 1043 17 Sưbba Rao N s (1980), Azotobacter inoculant” Bioffertilizers in Agricultures, 2Ih Oxford and TBH publishing Co pp 77-79 18.Tchan Y T Peter D (1984), “Genus Azotobacter" , Bergey's manual o f system atic BũCteriology W illiams W ilkins - Baltimore - London, pp 221 — 231 31 Đ Ạ I H ỌC Q U Ố C G IA H À NỘI TR U Ồ N G Đ Ạ I 11ỌC K H O A Ỉ1ỌC T Ự N H 1Ê N K H O A SIN H HỌC H oàng T h ị Lan A n il PH ÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG AZOTOBACTER CĨ ĐẶC TÍNH SINH HỌC Q K H O Á LUẬN T Ố T N G H IỆ P HỆ ĐẠI H Ọ C C H ÍN H Q U Y N gành: Công ngliệ sinh học C án hướng dẫn: T S N gó T ự T h àn h H Nội - 2003 TẠP CHÍ DI TRUYỀN HỌC & ÚNG DỤNG GENETICS AND APPLICATIONS ISSN : 0866-8566 144 Xuân Thuỷ, Hà Nội Tel: 7540602, 7680747; Fax: 7540602 GIẤY BIÊN NHẬN Nhận ồng fail.) Cơ quan : fCfarz &K& Số tiền : 7^ 7» Bằng chữ: V ề khoản : b c t' : t -6 ẹ c c tã m ọ + ề * 'c f j y ' Hà Nôi, ngàyVé tháng A5năm 2(xx3 Tổng biên tập A / Ổ _ /„ * ‘p ĐẬC TỈNH SINH HỌC CỦA MỘT s ố CHỦNG AZOTOBACTER NGÔ T ự THÀNH , v ũ THỊ MINH ĐỨC _ Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên H N ội NGUYỄN THU HÀ, NGUYỄN NGỌC QUYÊN V iện Khoa học K ĩ thuật Nông nghiệp Việt N am H iệu tốt việc xử lý hạt huyền dịch Azotobacter trước gieo trổng ohi nhận từ lâu [8] Sở đ ĩ Azotobacter có khả cố định nitơ, tiết vào mòi ưường vitamin axit arain chất kích thích sinh trường thực vật (axit indol axetic, gibberelic) [5 8] G ần m ột số tác giả [4, 6] phàn lập' tinh c h ế mò tả so đạc tính cua enzim từ Azotobacter sp G D I.có khả nãng phản giải 2,4, - trichlorophenol (một hợp chất độc,