TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC VÀ CÁC TRƯỜNG KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)
Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ sinh học dược, ngành công nghệ sinh học chuyên sản xuất phân tử sinh học chủ yếu đường tái tổ hợp ngày phát triển việc sản xuất protein trị liệu người Ngành mang lại lợi nhuận khổng lồ cho nhà sản xuất, với mặt hàng thuốc chữa bệnh thiếu máu suy thận, chất erythropoietin tái tổ hợp sản xuất từ tế bào CHO thu lợi nhuận trung bình hàng năm 6,5 tỉ USD cho nhà sản xuất Tuy nhiên, vài năm trở lại nhu cầu thị trường ngày gia tăng nên khả cung cấp mặt hàng chưa đáp ứng đủ nhu cầu người tiêu dùng Erythropoietin (EPO) nhân tố tăng trưởng máu, chịu trách nhiệm cho việc kích thích điều hịa sản xuất hồng cầu động vật có vú EPO kích thích sản xuất hồng cầu cách gia tăng số lượng tế bào có khả biệt hóa thành hồng cầu, đẩy mạnh tỷ lệ biệt hóa tế bào đó, gia tăng tỷ lệ tổng hợp haemoglobin tế bào phát triển EPO sử dụng trị liệu vào năm 1989 để điều trị bệnh thiếu máu liên quan đến suy thận mãn tính Ở Việt Nam việc chuyển gen EPO chưa thực rộng rãi, nghiên cứu tế bào động vật chuyển gen ổn định sản xuất protein tái tổ hợp tế bào động vật chưa tiến hành nghiên cứu nhiều Erythropoietin (EPO) glycoprotein 30,400 dalton có nhiệm vụ điều hịa sản xuất hồng huyết cầu ( 90% mô ống thận, 10% gan, bào thai ) Erythropoietin (EPO )có nhiệm vụ : - Cứu mô hồng cầu khỏi tự hủy (apoptosis) để kéo sống dài thêm cho mô máu - Hỗ trợ với nhiều yếu tố tăng trưởng (SCF, GM-CSF, 1L- 3, IGF- 1) tạo nên mô hồng cầu trưởng thàn Chức thận là: điều chỉnh chất điện phân, trì ổn định axitbazơ, điề chỉnh huyết áp Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli Người suy thận, thận không làm tốt chức này, nên thiếu erythropoietin dẫn tới thiếu hồng cầu Người suy thận dù đến tình trạng phải lọc máu hay chưa thiếu hồng cầu Tuy nhiên, vào giai đoạn cần phải lọc máu bị máu trình lọc, thiếu sắt (một thành phần hồng cầu) nên việc thiếu hồng cầu trở nên nghiêm trọng Trước đây, trường hợp thiếu máu suy thận, giai đoạn phải lọc máu thường phải truyền máu Từ phát vai trị erythropoietin kích thích tạo hồng cầu, chế erythropoietin- người tái tổ hợp thường thay truyền máu giảm bớt số lượng máu truyền cách dùng EPO Điều làm cho người bệnh đỡ phiền phức tốn kém, giá EPO cao Ngồi trường hợp này, EPO cịn dùng trường hợp thiếu máu khác (do viêm khớp dạng thấp, AIDS, đẻ non, hóa trị liệu, cần phải giảm bớt lượng máu truyền phẫu thuật) Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli PHẦN TỔNG QUAN PROTEIN ERYTHROPOIETIN Cấu trúc chức Erythropoietin (EPO) Erythropoietin thận sản xuất dạng chưa hoạt động gọi erythogenin Nhờ kết hợp với globulin (do gan sản xuất) erythogenin chuyển thành erythropoietin hoạt động Erythropoietin (EPO) glycoprotein có trọng lượng 30,400 dalton có nhiệm vụ điều hịa sản xuất hồng huyết cầu (EPO chiếm 90% dược tạo nên mô ống thận, 10% gan, bào thai ) Erythropoietin (EPO ) có vai trị: + Kích thích tạo tế bào tiền nguyên hồng cầu từ tế bào gốc + Kích thích tổng hợp hemoglobin + Kích thích vận chuyển hồng cầu lưới từ tủy xương máu ngoại vi Erythropoietin (EPO )có nhiệm vụ : - Cứu mơ hồng cầu khỏi tự hủy (apoptosis) để kéo sống dài thêm cho mô máu - Hỗ trợ với nhiều yếu tố tăng trưởng (SCF, GM-CSF, 1L- 3, IGF- 1) tạo nên mô hồng cầu trưởng thành Erythropoietin người tái tổ hợp chế phẩm sinh học gồm 165 acid amin, có cấu trúc khơng gian chiều, với nhiều đồng phân khác Dạng alpha dạng beta erythropoietin(chỉ khác vị trí nhóm glycolsyl) • Erythropoietin tái tổ hợp có tính sinh học giống erythropoietin nội sinh: kích thích phân chia tế bào dòng hồng cầu tế bào tiền nguyên hồng cầu, đồng thời làm biệt hóa đơn vị tạo quần thể hồng cầu thành tiền nguyên hồng cầu Như vậy, erythopoietin lúc tác dụng dòng tế bào hồng cầu dịng tế bào tủy • Erythropoietin - người tái tổ hợp, viết tắt EPO, có nhiều biệt dược (procrid, epopen, epokin, eprex,epogen, neorecormon, arannepsp) Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli • EPO chế phẩm sinh học, hạn dùng thường 18 tháng, phải bảo quản 2-80C , tránh ánh sáng Nếu khơng bảo quản thế, EPO khơng có hiệu lực • EPO kích thích tạo hồng cầu Cần có yếu tố tạo hồng cầu khác sắt, protein Khi dùng EPO, phải chủ động bổ sung sắt (muốn tạo 30g hồng cầu phải bổ sung 400-500mg sắt), phải có chế độ dinh dưỡng tốt, chống bệnh viêm nhiễm Phương pháp Mẫu Tách mRNA cDNA liên kết cDNA với plasmid Ni cấy Phát dịng biểu Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli PHẦN HỆ THỐNG BIỂU HIỆN ESCHERICHIA COLI 3.1 Escherichia coli Vector biểu vector mang gen ngoại lai mong muốn cho phép thực phiên mã tạo dòng dịch mã mRNA chúng Escherichia coli Để biểu tất gen ngoại lai E coli phải bắt đầu việc gắn đoạn gen ngoại lai vào vector biểu (thường plasmid) Vector phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: - Trình tự khởi đầu chép (ori) để tạo nhiều tế bào vật chủ - Các trình tự mã hóa gen thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào - Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp tac) cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dòng - Các trình tự kiểm sốt dịch mã trình tự liên kết ribosome bố trí thích hợp codon khởi đầu AUG - Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào hướng xác với promoter Chỉ cấu trúc đầy đủ thế, vector biểu mang gen ngoại lai biến nạp vào chủng E coli thích hợp Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát protein dung hợp tiến hành sau: Nuôi cấy qua đêm 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩn lạc môi trường LB có chứa ampicillin Sau đó, cảm ứng ni cấy cách bổ sung thêm isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR tiếp tục nuôi 37oC, vector pEX chuyển ni cấy 37oC lên nhiệt độ 40oC tiếp tục ni cấy (có sục khí) Các khoảng thời gian nuôi cấy khác (1, 2, giờ…), lấy mL dịch nuôi cấy ly tâm nhanh để thu tiểu thể, tái huyền phù chúng đệm 1´ SDS, biến Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli tính 100oC phút, ly tâm 12.000 g phút nhiệt độ phòng Tiến hành điện di SDS polyacrylamide gel 6% Dùng dịch huyền phù tế bào mang vector làm đối chứng Protein dung hợp xuất băng dịch chuyển chậm băng βgalactosidase đối chứng 3.2 Plasmid vector 3.2 Đặc điểm plasmid Plasmid thơng tin di truyền ngồi nhân, tìm thấy nhiều lồi vi khuẩn khác Chúng phân tử DNA mạch vịng, sợi đơi, kích thước từ 1- ³ 200 kb, có khả tự chép để tồn độc lập tế bào Các plasmid mang số gen vi khuẩn gen biểu protein Một số kiểu hình khác plasmid như: Một loại vi khuẩn vật chủ thường chứa hai nhiều loại plasmid tồn Chúng plasmid tương hợp (compatible plasmid) không tương hợp (incompatible plasmid) Người ta chia plasmid làm hai loại dựa đặc điểm sinh sản phương thức sống chúng, là: plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid) plasmid không tiếp hợp (non-conjugative plasmid) Trong tự nhiên, plasmid xâm nhập vào tế bào vật chủ nhờ tiếp hợp (conjugation) vi khuẩn, nghiên cứu thực nghiệm plasmid chuyển nạp vào vi khuẩn quy trình nhân tạo gọi biến nạp gen (gene transformation) Kiểu hình thể nhận (recipient) plasmid đem đến (Ví dụ: plasmid kháng kháng sinh) cho phép chọn lọc xác định nhân tố biến nạp trì plasmid quần thể vi khuẩn Ở vị trí cắt hạn chế plasmid, DNA ngoại lai (foreign DNA) chèn vào xác định với gen mã hóa cho marker chọn lọc Một v ector hay sử dụng trước pBR 322 mang hai gen kháng ampicillin (Ampr) tetracycline (Tetr) số vị trí cắt hạn chế thuận lợi Có hai dạng phân chia từ pBR 322 thích hợp cho tái vector pAT 153 pXf Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli Đến nay, plasmid cải tiến để ngày thuận tiện cho kỹ thuật tái tổ hợp DNA, trải qua ba hệ: - Thế hệ Là plasmid tự nhiên đến khơng cịn sử dụng - Thế hệ thứ hai Là plasmid cấu tạo phức tạp Một plasmid thường sử dụng pBR 322 (Hình 4.1) có nguồn gốc từ plasmid nhỏ ColE1 Nó thiết kế từ nhiều đoạn plasmid khác để vừa có gen kháng thuốc (Ampr Tetr), trình tự khởi đầu chép (ori), vừa có vị trí nhận biết cho enzyme hạn chế Eco RI , Hin dIII , Bam HI , Sal I , Ở đoạn gen Amp r có bốn điểm nhận biết, gen Tet r có tám điểm nhận biết, điểm giúp dễ phát plasmid có gen ngoại lai gắn vào Ví dụ: cắt plasmid enzyme BamHI (375) gắn DNA ngoại lai vào chỗ cắt gen Tetr bị phân đơi chèn đoạn DNA lạ, tế bào khả kháng tetracycline kháng ampicillin Plasmid có khả chép độc lập với tế bào E coli tồn với số lượng trung bình 20-30 cho tế bào Trong điều kiện nuôi cấy định khuếch đại có chọn lọc làm tăng số plasmid đến 1.000 cho tế bào Hình 3.1 Plasmid vector pBR 322 Apr (hay Ampr) Tetr: gen kháng ampicillin tetracycline, ori: trình tự khởi đầu chép, số vị trí nhận biết cho RE Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli - Thế hệ thứ ba L plasmid đa (polycloning plasmid) chuyên dụng Để tiện cho việc sử dụng nhiều lo ại RE khác nhau, nhiều trình tự nhận biết chúng xếp nối tiếp thành đoạn dài gọi polylinkers (vùng đa nối) hay multiple cloning sites (các vị trí tạo dịng) Các plasmid vi khuẩn chứa đoạn DNA ngoại lai khoảng 3-10 kb 3.2.2 Tạo dòng định hướng (directional cloning) Hầu hết plasmid vector mang hai nhiều vị trí nhận biết enzyme hạn chế, ví dụ: vector pBR322 chứa vị trí nhận biết đơn HindIII BamHI sau cắt hai enzyme hạn chế tương ứng, đoạn DNA plasmid lớn tinh điện di agarose gel gắn với đoạn DNA ngoại lai mang đầu kết dính tương đồng với cắt BamHI HindIII Kết quả, thể tái tổ hợp dạng vòng mang tính kháng Amp sau dùng để biến nạp vào E coli Do thiếu bổ trợ đầu lồi HindIII BamHI nên đoạn vector lớn khơng thể tái tạo lại vịng cách hiệu biến nạp vào E coli Dĩ nhiên, tổ hợp khác enzyme sử dụng tùy thuộc vào vị trí nhận biết (RS-recognition sites) vector đoạn DNA ngoại lai Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli Hính 3.2 Tạo dịng theo phương thức khử hoạt tính chèn đoạn Amp r: gen kháng ampicillin, lacZ: gen mã hóa enzyme β -galactosidase 3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn tế bào vật chủ Sau tạo vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc biến nạp vào tế bào vật chủ Trong trường hợp tế bào vật chủ thường sử dụng vi khuẩn E coli để khuếch đại lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho phân tích sau Hai phương pháp dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli điện biến nạp (electroporation transformantion) hóa biến nạp (chemical transformation) a Điện biến nạp Đây kỹ thuật hiệu để biến nạp vi khuẩn Hai thông số quan trọng phương thức làloại tế bào vi khuẩn tần số xung điện cần thiết Thể tích dung dịch tế bào thường dùng 30μL (tương ứng với nồng độ 1010 tế Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli bào E coli/mL) có bổ sung ng plasmid cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm Hiệu suất biến nạp phương thức lớn 1×109 thể biến nạp/μg plasmid siêu xoắn khoảng 1×108 thể biến nạp/μg plasmid dùng phản ứng gắn Tần số biến nạp khoảng 0,02 cho hai loại plasmid Tần số biến nạp thấp ngăn cản đồng biến nạp (co-transformation) vào vi khuẩn hai nhiều phân tử plasmid Phương pháp điện biến nạp có số ưu điểm sau: - Hiệu suất biến nạp cao - Có thể dùng thể tích dịch tế bào nhỏ Thể tích dịch tế bào khoảng 20 μL cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp - Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp đơn giản, không sử dụng kỹ thuật phức tạp tốn thời gian Hơn nữa, tế bào dùng để biến nạp chuẩn bị trước bảo quản vô hạn định mà không tính khả biến - Tần số điện biến nạp với DNA siêu xoắn DNA mạch vòng giống Do đó, khơng cần thiết phải dùng vector tinh cao phản ứng gắn - Hiệu suất biến nạp phân tử cho DNA mạch vòng cao plasmid có kích thước lên đến50 kb Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp địi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền b Hóa biến nạp Đây phương thức kinh điển để biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli Các tế bào ủ dung dịch CaCl để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận DNA plasmid DNA plasmid đưa vào cách shock nhiệt nhanh (40-50 giây), tế bào biến nạp sau chọn lọc phương pháp chọn lọc dương tính đĩa agar chứa mơi trường LB với kháng sinh thích hợp Mỗi khuẩnlạc đĩa kháng sinh đại diện cho thể biến nạp đơn Các tế bào chứa plasmid mang DNA ngoại lai xác định mắt đĩa mơi trường có bổ sung thêm chất nhiễm sắc thể cho β-galactosidase (X-gal) chúng 10 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli khuẩn lạc khơng màu khử hoạt tính enzyme cách chèn đoạn DNA ngoại lai Phương pháp chuẩn bị bảo quản tế bào khả biến hóa biến nạp đơn giản Hiệu suất biến nạp phương pháp khoảng 104-106 thể biến nạp/μg plasmid, tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA chèn (insert DNA) chủng vi khuẩn sử dụng Hiệu suất thích hợp cho phương thức tạo dòng truyền thống Đối với phương thức cần hiệu suất biến nạp cao (ví dụ: xây dựng thư viện cDNA, xây dựng thư viện phân tích trình tự DNA ) tốt hết dùng phương pháp điện biến nạp Tuy nhiên, khơng có sẵn thiết bị biến nạp điện thu hiệu suất biến nạp cao cách dùng chủng vi khuẩn thích hợp cho mục đích thu hiệu suất 109 thể biến nạp/μg plasmid 3.3 Xác định mức độ biểu gen tạo dịng Nói chung có ba cách thường dùng để đánh giá mức độ biểu protein ngoại lai gen tạo dòng: - Điện di polyacrylamide gel để xác định protein có kích thước thích hợp sản xuất mức độ cao tế bào mang vector biểu Thông thường, protein quan tâm quan sát cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm bạc Nếu không thấy có băng protein dùng thuốc nhuộm này, đánh dấu trao đổi chất với 100 μCi [35S]Met [35S]Cys mL dịch nuôi cấy phút Điện di SDS-polyacrylamide gel thực phóng xạ tự ghi cho phép phát protein quan tâm - Phân tích Western blot cách dùng kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm thẩm tích lên màng nitrocellulose sau thực diện di SDS-PAGE (xem chương 2) - Nếu mức độ biểu thấp nên đặt gen lacZ hướng với gen biểu Như vậy, phiên mã dịch mã hạn chế biểu gen thay đổi hệ thống biểu kiểm sốt thay đổi hoạt tính β-galactosidase 11 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli 3.3.1 Western blot Phản ứng liên kết kháng ngun-kháng thể có tính đặc hiệu cao Vì vậy, áp dụng phản ứng để phát có mặt tinh protein Kháng thể (antibody) sản xuất đưa kháng nguyên vào thỏ tinh từ máu thỏ sau gây nhiễm Những kháng thể tạo cách kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do tế bào lympho khác tiết ra), chúng có khả nhận biết số kháng nguyên Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) tương tác với kháng nguyên định Hình 3.3 Sơ đồ kỹ thuật Western blo Kháng thể đánh dấu bằng enzyme (hoặc chất phát huỳnh quang) để phát protein đặc hiệu (thường thẩm tích lên màng nitrocellulose sau chạy điện di SDS-PAGE, cố định đó) thơng qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 7.9) Cơ chế phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể trình bày hình 7.10 Sau protein màng lai gắn với kháng thể thứ đặc hiệu tiếp đến kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) phức hợp liên kết 12 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli với chất để tạo màu Sự diện protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã gen ngoại lai chuyển vào tế bào vật chủ) phát nhờ xuất màu phản ứng lai 3.3.2 ELISA ELISA kỹ thuật hóa sinh, dựa phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể, dùng chủ yếu miễn dịch học để phát có mặt kháng thể kháng nguyên mẫu Tương tự kỹ thuật Western blot, ELISA người thường dùng hai loại kháng thể Một kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên protein (kháng thể thứ nhất) Một kháng thể khác, phản ứng với phức hợp kháng thể-kháng nguyên, kết hợp với enzyme (kháng thể thứ hai) Kháng thể thứ hai nhờ có liên kết với enzyme (như tên kỹ thuật xét nghiệm) nên bắt màu với chất để tạo tín hiệu (Hình 3.4) 13 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli 14 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli Hình 3.4 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Do ELISA thực để đánh giá có mặt kháng nguyên kháng thể mẫu phương pháp quang phổ (đo độ hấp thụ quang), cơng cụ hữu ích để xác định nồng độ (định lượng) kháng nguyên kháng thể PHẦN TINH SẠCH PROTEIN ERYTHROPOIETIN 4.1 Tinh protein 4.1.1 Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi 4.1.1.1 Thể vùi Protein có mức độ biểu cao E coli thường tạo hạt nhỏ khơng hịa tan tế bào chất (thể vùi), quan sát kính hiển ngược pha tách khỏi dịch tan tế bào sống phương pháp ly tâm Các tế bào biểu mức độ cao protein ngoại lai cô lại ly tâm phá vỡ kỹ thuật học, siêu âm, dùng lysozyme kết hợp với chất tẩy Các thể vùi (inclusion) tạo tiểu thể ly tâm rửa với Triston X-100 EDTA urea Để thu chất hòa tan, protein hoạt động, thể vùi rửa phải hịa tan sau phải tái cuộn xoắn Mỗi protein cần phương pháp hịa 15 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli tan khác thường xác định theo kinh nghiệm Các điều kiện khác (ví dụ: guanidine HCl [5-8 M], urea [6-8 M], SDS, alkaline pH, acetonitrile/propanol) sử dụng để hịa tan thể vùi Trong nhiều trường hợp, cần pha lỗng đơn giản dịch chiết hịa tan đệm thích hợp đủ Nếu protein chứa cầu nối disulfide, người ta cần phải tiến hành oxy hóa khử glutathione Một cần bổ sung đồng dung môi (cosolvent) PEG, chất tẩy rửa Triton X-100, Tween 20 Zwittergent 3-16 Sau hòa tan thành cơng, thử nghiệm phương pháp tái cuộn xoắn khác bao gồm pha loãng thẩm tách Hiệu suất tạo protein hoạt động protein có liên kết disulfite giống protein gốc phụ thuộc vào nồng độ, độ tinh kích thước chuỗi polypeptide; độ pH cường lực ion dung môi; tỷ lệ tái cuộn xoắn chúng Các nhân tố khác bao gồm số lượng liên kết disulfite chất protein Trong số trường hợp, protein hòa tan khó tái cuộn xoắn người ta thấy việc bổ sung chaperonins giúp ích cho trình Chaperonins protein cần để đảm bảo cuộn xoắn xác in vivo protein, với khả thuận lợi chaperonin tái tổ hợp chúng dùng để xúc tác cho trình tái cuộn xoắn xác in vitro protein Nguyên nhân tạo thành thể vùi chưa biết đầy đủ, khơng phải tất protein biểu mức độ cao tạo thành thể vùi Tế bào vật chủ thể vai trò quan trọng Cấu trúc xác protein tái tổ hợp ảnh hưởng tạo thành thể vùi Một nghiên cứu thực với g-interferon người tái tổ hợp cho thấy vài thay đổi amino acid ảnh hưởng đến chuyển hóa biểu protein hịa tan khơng hịa tan E coli 4.1.1.2 Phương pháp hòa tan thể vùi a Làm tan tế bào Ly tâm thu tiểu thể tế bào E coli, tái huyền phù tiểu thể phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) lysozyme, đặt nhiệt độ phịng (RT) 16 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli khoảng 20 phút (thỉnh thoảng khuấy) Sau đó, bổ sung deoxycholic acid, đặt 37oC khuấy dịch tan trở nên sền sệt, bổ sung DNase I để 30 phút RT b Tinh rửa thể vùi - Phương pháp Ly tâm dịch tan thu bước trên, tái huyền phù tiểu thể Triston X-100 EDTA, giữ RT phút Ly tâm 15 phút lấy tiểu thể tái huyền phù nước Trộn dung dịch với đệm 2´ SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định protein quan tâm có tiểu thể không - Phương pháp Ly tâm dịch tan, tái huyền phù tiểu thể nước Sau đó, ly tâm lại tái huyền phù tiểu thể Tris.HCl có bổ sung urea Ly tâm tái huyền phù tiểu thể nước Trộn dung dịch với đệm 2´ SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định điều kiện rửa thích hợp cho protein c Hòa tan thể vùi Treo tiểu thể rửa đệm dung ly chứa PMSF urea, để RT Bổ sung dung dịch có KH2PO4, EDTA NaCl để 30 phút RT, trì pH 10,7 KOH Điều chỉnh pH tới 8,0 HCl để 30 RT Ly tâm thu tiểu thể tái huyền phù đệm 1´ SDS gel-loading dye Phân tích điện di để xác định mức độ hịa tan 4.1.2 Các lực Khái niệm đuôi lực xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho protein hiệu Gen protein quan tâm dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho số trình tự amino tinh enzyme 17 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli acid đơn giản hóa q trình tinh protein, cách biến đổi tính chất kiểu dự đốn Một trường hợp dung hợp di truyền số gốc arginine với C-terminus urogastrone Gen sản xuất protein liên kết mạnh với khuôn trao đổi ion cho cation Đuôi polyarginine sau loại bỏ cách dùng enzyme bất động carboxypeptidase A Hình 4.5 Tinh protein đích sắc ký lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp qua cột sắc ký có chứa phối tử liên kết đặc hiệu với protein mang đuôi lực (ví dụ: His, Histidine GST, glutathione-S-transferase) Các chất bẩn rửa trôi khỏi cột, protein liên kết cột sau rửa giải dạng tinh Đi lực có nhiều ưu điểm tinh protein Trong IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), His liên kết chọn lọc cao với Ni2+ kim loại chuyển tiếp khác bất động phối tử, protein có gắn lực rửa giải chọn lọc imidazole Protein gắn đuôi GST liên kết với glutathione phối tử, rửa giải với dung dịch glutathione Các protein có dung hợp GST mang hoạt tính enzyme tinh điều kiện 18 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli tự nhiên Ngược lại, protein gắn đuôi His tinh điều kiện tự nhiên biến tính Hình 4.6 Phân tích SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue sản phẩm protein sau tinh sắc ký lực 1: Chuẩn khối lượng phân tử protein 2: Protein hòa tan tổng số 3: Protein dung hợp (protein đích GST) rửa giải khỏi cột glutathione sepharose 4: Protein dung hợp cắt PresCission Protease cho băng GST protein đích 5: Protein đích tinh sau cho qua IMAC Khó khăn chủ yếu dung hợp lực để tinh protein phải loại bỏ thành công đuôi lực tác nhân sử dụng Vấn đề giải phần biến nạp di truyền điểm đặc hiệu cao cho protease cho cắt bỏ liên kết acid không bền chỗ nối protein tái tổ hợp đuôi lực Nhiều phương pháp phân cắt gợi ý Sử dụng protease đặc hiệu thích hợp cả, ứng dụng điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu thrombin, enterokinase Factor Xa Tất protein hoạt động 37oC phân cắt vị trí bên protein quan tâm, tính đặc hiệu từ nhiễm bẩn protease Cuối cùng, bước sắc ký yêu cầu để loại bỏ đuôi lực phân cắt protease 19 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli PHẦN ƯU ĐI ỂM VÀ NH ỰƠC ĐI ỂM Sản phẩm protein tái tổ hợp độc tế bào chủ nên promoter thiết phải điều hịa chặt chẽ protein mục tiêu biểu thời điểm thích hợp nhờ vào điều kiện stress thay đổi chất, thay đổi trạng thái sinh lý giúp biểu (11,13) Khi biểu khơng kiểm sốt hồn tồn, plasmid khơng ổn định làm cho tốc độ phát triển tế bào giảm xuống, kết giảm mức độ biểu protein mục tiêu Để biểu thời điểm, đòi hỏi promoter phải cảm ứng nhanh, yêu cầu 20 Công Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli promoter phải kiểm soát chặt chẽ cảm ứng cách dễ dàng với việc thêm vào chất cảm ứng (inducer) vào thời gian thích hợp để biểu Về mặt lịch sử vector thường sử dụng lactose tryptophan promoter Hai promoter sử dụng để tạo promoter lai (hybrid promoter) tac (17) trc (18) sử dụng rộng rãi Các promoter thông dụng khác sử dụng phage lambda promoter (19) phage T7 promoter (T7), alkaline phosphatase promoter (phoA) Đặc điểm promoter phổ biến thường sử dụng vector biểu E coli liệt kê bảng PHẦN K ẾT LUẬN Escherichia coli vi sinh vật thường sử dụng tiêu biểu để biểu (expression) protein ngoại lai (foreign protein) protein nội (nonforeign protein) E coli Việc sử dụng rộng E coli dựa vào ưu điểm bật là: thao tác vật liệu di truyền dễ, biểu protein lạ lên đến mức 50% protein tổng tế bào, biểu nhanh mức độ cao tốc độ tăng trưởng tế bào đạt cao mật độ tế bào đủ lớn, môi trường nuôi cấy đơn giản rẻ tiền có khả định vị (location) protein mục tiêu Thêm vào có 21 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E.coli nhiều chủng chủ (host strain) đột biến nhờ cải tiến việc biểu protein tái tổ hợp 22 ... Erythropoietin từ E. coli PHẦN TỔNG QUAN PROTEIN ERYTHROPOIETIN Cấu trúc chức Erythropoietin (EPO) Erythropoietin thận sản xuất dạng chưa hoạt động gọi erythogenin Nhờ kết hợp với globulin (do gan sản. .. (Hình 3.4) 13 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E. coli 14 Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E. coli Hình 3.4 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Do ELISA thực để đánh giá có mặt kháng nguyên kháng thể mẫu... cDNA với plasmid Nuôi c? ?y Phát dịng biểu Cơng Nghệ Sản Xuất Erythropoietin từ E. coli PHẦN HỆ THỐNG BIỂU HIỆN ESCHERICHIA COLI 3.1 Escherichia coli Vector biểu vector mang gen ngoại lai mong muốn