Nghiên cứu tạo cơ chất đặc hiệu cho protease của virus gây suy giảm miễn dịch ở người hiv

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT KÉT QUẢ THỤC HIỆN ĐÈ TÀI KH&CN CÁP ĐẠI h ọ c QUÓC g i a Tên đề tài: N go h iê n u tạ• o CO’ c h ấ t đ ặ• c h iệu • ch o p r o te a se củ a v iru s g ây su y g iả m m iễn dịch ỏ' n g i (H IV ) M ã số đề tài: K L E P T 14.03 Chủ nhiệm đề tài: TS N guyễn T hị H ồng Loan PHÀN I TH Ô N G TIN C H U N G 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chất đặc hiệu cho protease virus gây suy giảm miễn dịch người (HIV) 1.2 M ã số: K L PE T 14.03 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT 10 11 Chức danh, học vị, họ tên TS Nguyên Thị Hông Loan GS.TS Phan Tuân Nơhĩa PGS.TS Bùi Phương Thuận TS Đinh Nho Thái ThS Nguyền văn Minh Ths Trân Thị Thu Huyên CN Đặng Thị Liêu CN Phan Thị Lam Hông CN Phạm Ngọc Sơn NCS Nguyên Văn Dũng sv Đô Linh Chi Đ on vị công tác Trường Trường Trường Trường Trường Trường ĐHKHTN ĐHKHTN ĐHKHTN ĐHKHTN ĐHKHTN ĐHKHTN T rư ng Đ H K H T N Trường ĐHKHTN Trường ĐHKHTN Trường ĐHKHTN Trường ĐHKHTN Vai trò thực đề tài Chủ nhiêm đê tài Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên Thành viên 1.4 D on vị• chủ trì: T rườngo Đại K hoa học T ự• nhiên • học • • 1.5 Thịi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2016 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm 2017 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2017 1.6 N hũng thay đối so vói thuyết m inh ban đầu (nếu có): (Vê mục tiêu, nội dung, p h n g pháp, kết nghiên cứu tô chức thực hiện; N guvên nhân; Y kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tống kinh phí đư ọc phc duyệt đề tài: 400 triệu đồng PHẦN II TỎNG QUAN KẾT QUẢ NG HIÊN c ứ u Đ ặt vấn đề Virus type gây suy giảm viễn dịch người (HIV-1) tác nhân gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) người Trong chu trình tái bàn HIV-1, protease HIV type (protease HIV-1) protease aspartyl, họ retropepsin A , tạo trình HIV nhiễm vào tế bào chủ, có khả phân cắt chuồi polyprotein (Gag, Gag-Pol) thành protein cấu trúc chức cần thiết cho hình thành virus hoàn chỉnh Cụ the, protease HIV-1 nhận biết cắt 11 liên kết khác polypeptide Gag để tạo thành protein cấu trúc: matrix P17 (MA), capsid p24 (CA), nuclcocapsid p7 (NC) có vai trị q trình lắp ráp xác định hình thái lớp vỏ virus trưởng thành với protein nhô (p , p2 p 1) chưa rõ chức năng; thủy phân polypeptide Gag-Pol tạo thành enzyme: protease, reverse transcriptase integrase cần thiết cho trình chép HIV (Darke et aỉ., 1989; Alastair Wood 1998) (Bảng 1) Khi ức chế hoạt tính protease HIV-1 gây đột biến gen mã hóa protease HIV-], virus khơng thê đóng gói đê tạo thành virion hồn chỉnh; vậy, chúng khơng có khả xâm nhiễm vào tế bào vạt chủ (Darke et ai, 1989) v ề cấu trúc, protease HIV-1 !à dimer, monomer giống hệt có khối lượng phân từ (KLPT) 11 kDa gồm 99 acid amin xếp gần theo kiểu đối xứng Cấu trúc monomer chứa phiến gấp nếp b đoạn xoắn a ngắn gần đầu c Trung tâm hoạt độnơ protease nằm mặt phân giới dimer xác định ba xúc tác có tính bảo thủ cao: Asp-Thr-Gly (Asp 25, Thr 26 Gly 27) Trong đó, mồi monomer đêu có ba AsỊD-Thr-Gly vị trí axit amin tương ứng sau: 25 (25’) - 26(26’) - 27 (27’) Asp cần thiết cho cấu trúc hoạt tính xúc tác protease (Tie, 2006) Bảng Trình tự vị trí cắt protease HIV-1 protein gag gag-pol (Tie, 2006) Các vị trí căt Trên protein Gag P4 P3 P2 P1 P l’ P2’ P3’ MA-CA CA-p2 p2-NC NC -pl p -p6 Trên p6 Ser Ala Ala Arg Pro Lys Gln Arg Thr Gln Gln Glu Asn Val Ile Ala Asn Leu Tyr Leu Met Asn Phe Tyr Pro Ala Met Phe Le Pro le Glu Gin Leu Gin Leu Val Ala Ag Gly Ser Thr Asp Scr Thr Ala Arg Leu Phe Leu Glu Lys Ala Asn Asn Thr Ile Phe Phe Phe Phe Leu Leu Pro Pro Tyr Phe Gin Gin lie Val Leu Gly lie Scr Asp Asp Trên protein Pol TFP-p6 po1 p6 po1 - PR PR-RT p66-p51 RT-IN Do có vai trị quan trọng trình hình thành thê virus, nên protease HIV-1 xem đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS sở ức chế protease HIV-1 Các chất ức chế protease có cấu trúc giống chất gắn vào trung tâm hoạt động protcasc qua ức chế hoạt động enzyme (Bossi et ai, 1999) Sự đời thuốc ức chế protease (PI) thuốc ức chế enzyme chép ngược nucleotide (NNRTI) vào năm 1995 bắt đầu kỷ nguyên trị liệu kháng retrovirus hiệu lực cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy-HAART) tạo tiến vượt bậc giảm tỷ lệ mắc tử vong HIV giảm rõ rệt nhiễm trùng hội khối u Tuy nhiên, kháng thuốc tác dụng phụ vấn đề lớn thuốc PI nói riêng thuốc điều trị HIV nói chung Vì vậy, nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế HIV vần tiến hành (Volonte et al., 2011) phương pháp phù hợp cho xác định lioạt độ protease cần thiết Khác với protease khác, protease HIV-1 có tính đặc hiệu cao nhận biết phân cat chat, enzyme chi thủy pliân chất có liên kết đặc hiệu tương tự vị trí cắt cấu trúc protein Gag Gag-Pol HIV-1 Vì vậy, phần lớn chất protcase HIV-1 chuỗi pcptide gồm từ axit amin, ký hiệu P4-P3-P2-P1*P1'-P2'-P3' có trình tự giống với 11 vị trí cắt đặc hiệu protease HIV-1 chuồi polyprotein (Gutierrez et al., 2002) Trình tự axit amin thường đa dạng, enzyme cắt liên kết P1*P1' (Boross ct al., 1999; Bcck et al., 2000; Chaudhury et al., 2009) Vai trị, đặc tính gốc axit amin trình tự ưa thích protease HỊV-1 làm rõ (Beck et al., 2000; Bagossi et al., 2005; Chaudhury et al., 2009) v ề phân loại, có thê chia chất protease HIV-1 thành hai nhóm; nhóm p axit amin thơm, p 1' Pro (Aro-P), nhóm axit amin kỵ nước (Chaudhury et al., 2009) Mặt khác, nghiên cứu cho thấy kích thước, trình tự đặc tính axit amin ảnh hường đến cấu hình chất với trung tâm hoạt động protease HIV-1, qua ảnh hưởng đến lực chất với enzyme (Tic, 2006) Hiện nay, có nhiều loại chất huỳnh quang mang gốc hoá học khác cho xác định hoạt độ protease IIIV -1 đă thương mại hố Tuy nhiên, trình tự axit amin chất thường không công bố chưa thể lực cao với protease HIV-1 Ngoài ra, giá thành chất cao đặc biệt tiến hành với nhiều phản ứng xác định hoạt độ protease HIV-1 với chất gắn huỳnh quang cần có tương thích bước sóng với hệ thong máy quang phổ huỳnh quang mà phịng thí nghiệm có Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu nham thiết kế chất peptide đặc hiệu có lực cao với protease sử dụng phân tích hoạt độ protease HIV, tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu phát triển thuốc ức chế protease HIV điều trị HIV/AIDS nước việc thiết kế tạo chất đặc hiệu protease HIV nghiên cứư áp dụng để tạo chất protease có tính đặc hiệu chất cao khác Mục tiêu: Thiết kế chất đặc hiệu để sừ dụng phân tích hoạt độ protcasc HIV.' Phưong pháp nghiên cứu 3.1 X ác định hoạt độ protease HIV-1 M ột đơn vị hoạt độ (I U) protease HIV-1 lượng enzyme thủy phân pmol chất phút điều kiện tối thích phản ứng Trong nghiên cứu này, chế phẩm protease HlV-1 tái tổ họp (IỈIV-lPrHis) tạo theo quy trình Nguyen et al (2015) sản phẩm Phịng protein tái tơ họp thuộc Phịng thí nghiệm trọng điêm Công nghệ Enzymva Protein; hoạt độ protease HIV-1 xác định theo hai phương pháp: i) sử dụng chat peptide cải biến theo phương pháp Richard et al (1990)và ii) chat peptide huỳnh quang theo nguyên tắc FRET Với phương pháp Richard et (1990), chất tổng hợp hố học chứa vị trí phân cắt protease HIV-1 dạng cải biến Nle (nonleucine) -NƠ - phenylalanine (Nph) có khả hấp thụ ánh sáng cực đại bước sóng 300 nm (A 300 ) Dưới tác dụng thủy phân proteasc HIV-1, liên kết bị phân giải, đo độ A 300 giảm theo thời gian máy quang phổ kế UV-VIS DU 800 (Beckman Coulter) Các thành phần phản ứng gồm đệm 2x (CHaCOONa 200 mM, pH 4,7 có EDTA mM, P-mecaptoethanol 10 rnM, NaCl 1,8 M, CaCb 10 mM), protease HIV-1 300 ng, chất 20 Ịig ủ trước 37°c Hỗn hợp phản ứng (300 |il) trộn đều, tiến hành đo hệ thống máy quang phổ khả biến DU800 hăng Beckman Coulter bước sóng A 300 phút 37°c sổ liệu phân tích bàng cách sử dụng phần mem Origin pro cxccl Với phương pháp xác định hoạt độ proteasc HIV-1 sử dụng chat peptidc huỳnh quang theo nguyên tắc FRET, chất cùa protease HIV-1 chuồi peptide tổng hợp có vị trí cat đặc hiệu enzyme Một đầu peptide có gắn chất phát huỳnh quang Hilyte Fluor 488, cịn đầu chất thu tín hiệu huỳnh quang QXL 520 Dưới tác dụng hoạt tính protease H1V-1, liên kết đặc hiệu bị thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát từ Hilyte Fluor 488 máy quang phổ huỳnh quang thu lại bước sóng 520 nm Kết cho tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo thời gian Hồn hợp phản ứng (30 [J.1) gồm đệm (CHỉCOONa 100 mM, pH 4,7 có NaCl M, ethylene diaminetetraacetic acid [EDTA] mM, dithiothreitol [DTT] mM dimethyl sulfoxide [DMSO] 5%, protein huyết bò [BSA]) mg/ml, protease HIV1 150 ng chất |iM trộn đưa vào máy quang phổ huỳnh Nanodrop ND3000 (Thermo scientific, Mỹ) đo bước sóng Ex/Em (excitation/emmision) = 490 nm/520 nm phút 37°c Phân tích số liệu cách sử dụng phần mem Origin pro excel Trong phản ứng xác định ảnh hường chất lên hoạt tính protease HIV1, chất nghiên cứu (ở nồng độ khác nhau), ủ với protease HIV-1 phút trước chất bổ sung để bắt đầu phản ứng Mức độ ảnh hường chất đánh giá dựa phần trăm hoạt độ lại protease HIV-1 với cơng thức tính: (Athí nghiệm x 100%)/Ađơi chứng- Trong A thay đơi độ hấp phụ bước sóng 525 nm/giây protease HIV-1 phản ứng đối chứng (khơng có mặt chất nghiên cứu, % hoạt độ protease H IV -1 100%) phản ứng thí nghiệm (có mặt chất nghiên cứu) 3.2 X ác định động học c ủ a protease H IV -I Km số Miehaelis - Menten, phản ánh lực enzyme chất, Km có trị số nhở lực enzyme với chất lớn hiệu phản ứng enzyme xúc tác cao ngược lại Trị số kcat số phân tử chất chuyển hóa thành sản phâm bời phân tử enzyme đơn vị thời gian Tỷ lệ kcat/Km hiệu xúc tác enzyme, dùng để so sánh tính đặc hiệu enzyme với chất khác Trong nghiên cứu này, số động học tính theo hai phưong pháp: Theo phương trình Michaelis - Menten: v r L *-■ J *_ m a x r d Lo J + / v Trong đó: V0: Vân tốc ban đầu phản ứng , ' v max: Vân tôc phản ứng cưc đai K m: Hăng sô M ichaelis - Menten [S]: Nồng độ chất Theo phương trình Lineweaver - Burk: _ _ Vo _ _ Vmax _ X [5] Vmax Theo đó, phương trình Lineweaver - Burk có dạng đường thẳng tuyến tính y = ax + b, cắt trục tung điểm 1/Vmax cắt trục hoành điểm -1/Km, qua dễ dàng xác định giá trị Km, Vmax- Phương trình Lincweaver - Burk dùng phổ biến nhận dẫn liệu thực nghiệm tốt với nhiều nồng độ chất khác nhau, cho kết xác tin cậy Trong nghiên cứu phương pháp huỳnh quang dựa nguyên tắc FRET, đơn vị đo mức độ phát quang RFU/giây nên chủng sử dụng chất phát quang chuẩn ỉlilyte Fluor 488 để xây dựng đường chuẩn mối quan hệ RFU/giây nM/giây Cụ thể phương trình chuyển đổi đổi với Peptide HF y = 5,482x + 73,41 kit sensolyte y = 5,896x + 649,6 3.3 X ác định tính độc củ a ch ất lên d ị n g tế bào H EK 293T theo kit M TS (Prom ega, M ỹ) Dịng tể bào phơi thận người (Human embryonic kidney - HEK 293T) nuôi thành lớp mỏng môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) (Com ing, Mỹ) tủ C (5% COo), 37°c bổ sung 10% (v/v) huyết bào thai bê pha 3,7 g/1 N aH C 03 Tiếp theo, tế bào cấy chuyển sang đĩa 96 giếng (Corning, Mỹ) với mật độ 104 tể bào/giếng 200 p.1 môi trường Sau 24 nuôi cấy, tiến hành bổ sung nồng độ khác chất nghiên cứu, nồng độ lặp lại thí nghiệm lần Sau 48 nuôi cấy, 20 (J.1 dung dịch MTS (CellTiter 96 Aqueous NonRadioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Mỳ) bổ sung vào giếng, ủ tiếp tế bào 2,5 37°c 5% C 02 Đĩa mầu sau lắc nhẹ đo độ hấp thụ bước sóng 490 nm máy Model 680 Microplate reader (Bio-Rad, Mỹ) để đánh gía mức độ sống xót cua tế bào Các chất nghiên cứu chuẩn bị dung dịch DMSO 5% đôi chứng với giếng bổ sung DMSO) 5% thay cho chất nghiên cứu Giá trị độc tính biểu diễn nồng độ 50% tế bào chết (IC50) theo phươnơ pháp MTS 4 T ồn g kết kết nghiên cứu 4.1 Thiết kế trình tự a x it a in in CO’ chất peptide cho xác định hoạt tính protease HIV-1 Hiện nay, thị trường, có loại chất dùng phổ biến là: i) pcptide cải biến vị trí P l-P l' tạo liên kết có khả hấp thụ cực đại vùng từ ngoại; hoạt độ protease HIV-1 đánh giá dựa giảm độ hấp thụ chất theo thời gian máy quang phổ thông thường; ii) pcptidc gắn huỳnh quang hoạt động theo nguycn tắc truyền lượna cộng hường huỳnh quang FRET (Fluorescence resonance energy transfer) máy quang phô huỳnh quang Trong nghiên cứu này, nhằm thiết kế chất đặc hiệu cho phân tích hoạt độ sử dụng cho phản ứng sàng lọc chất ức chế proteasc HIV-1, thiết kế loại chất peptide cải biến peptide huỳnh quang, chất có lực cat hiệu protease HIV-1, tối ưu phát triển nghiên cứu Trên chuồi polyprotein Gag-Pol tiền thân, vị trí P6pol-PR phân cắt để giải phóng protcase H IV -1 có hoạt tính cho bước thuỷ phân Gag-Pol Gag tạo protein cấu trúc chức cần thiết cho HIV-1 (Louis et al., 1999) Mặt khác, theo Kausslich et al (1989), chất dựa trình tự cắt P6pol-PR polyprotein gagpol lại hiệu Nghiên cứu Perez et al (2010) cho thấy sổ chất mang trình tự khác Gag-Pol khơng bị protease HỈV-1 cắt theo lý thuyết không dùng làm chất thực tế thí nghiệm lại có lực cao với trung tâm hoạt động protease HIV-1 chất Nghiên cứu cho thấy, kích thước, trình tự đặc tính axit amin ảnh hưởng đến cấu hình lực chất với trung tâm hoạt động protease HIV-1 Do đó, có thê trình tự phân cắt Gag-Pol tạo enzyme (protease, reverse transcriptase integrase) có lực so với vị trí khác Gag Vì vậy, trình tự CA-p2 MA/CA Gag thường sử dụng cho thiết kế chất peptdic cải biển huỳnh quang; nhiên, nghiên cứu này, dựa trình tự Gag-Pol dẻ thiẻt kẻ chât cho protease H IV -1 Các chất peptdie cải biến thường có ưình tự gồm axit amin với gốc từ P4-P3’, P1 ln Leu norleucine (Nle) P l' nitrophenylalanine (Nph) để tạo liên kết hấp thụ cực đại bước sóng tử ngoại Khi có mặt hoạt tính proteasc HIV-1, liên kết PlP l' bị cat cho bước sóng giảm dần theo thời gian máy quang phổ kế, nhờ xác định động học enzyme Cụ thể Nle khơng có mạch bên R phân nhánh; Nph có chứa nhóm NƠ nhóm hút điện tử làm cho liên kết CO*NH c o Nlc NH Nph trở nên lổng lẻo so với CO*NH Leu Nph, giúp tăng hiệu phân cắt chất enzyme Cơ chất thường thiết kế vị trí CA-p2 polyprotein Gag với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Ala-Glu-Ala-NH (* vị trí cắt protease HIV- ), Lcu thường biến đổi thành Nle, Ala biến đổi thành Nph (Richards et al., 1990) Trong nghiên cứu này, với tiêu chí thiết kế chất có lực hiệu cắt cao protease HIV-1, vị trí cắt RT-IN Gag-Pol vói trình tự Arg-Lys-Ile-Leu*Phe-Leu-Asp chúng tơi lựa chọn để thiết kế chat peptide cải biến Trong đó, P1*P1' Leu*Phe biến đổi thành Nle*Nph làm cho liên kết không bị thay đổi nhiều so với cấu trúc tự nhiên Ngoài ra, bổ sung Gly-Nle-NHi vào đầu c giúp chất ổn định hon (giá trị Kmthấp kcatcao) (Richards et al., 1990) Vì vậy, chất pcptidc cải biến protcase H IV -1 thiết kế với trình tự: Ac-Arg-Lys-Ile-Nle*NphLeu-Asp-Gly-Nle-NHi (ký hiệu Peptide CH) Cơ chất đặt tổng hợp bời Genscript (Mỹ) với độ tinh 95% Tiêu chí chất lực cao bị phân cắt nhanh protease HIV-1 Đối với chất huỳnh quang, vị trí cắt Pópol-PR Gag-Pol với trình tự Ser-Phe-AsnPhe-Pro-Gln-Ile-Thr-Leu lựa chọn Trình tự giống với trình tự tự cắt thiết kế protcasc HIV-1 tái tổ họp sử dụng nghiên cứu đâ nhân dòng, biểu tinh theo quy trình N suyen et al (2015) Độ nhạy cao phân tích hoạt độ protease HIV-1 tiêu chí cần thiết chất enzyme chat peptide huỳnh quang theo nguyên tắc truyền lượng cộng hường huỳnh quang FRET nhàm hướng tới mục tiêu Toth et al (1990) đă sử dụng cặp huỳnh quang acid p-aminonitrobenzoic (Abz)/nitrophenylalanine cho chất protease HIV-1 Tuy nhiên, Abz có hệ số phát quang yếu dẫn đến độ nhạy cặp huỳnh quang thấp Một số chất huỳnh quang khác rhodamine thường đưọc dùng cho kit xác định hoạt tinh enzyme với độ nhạy cao (Lavis et al., 2008) Tuy nhiên, proton lioá huỳnh quang chì bàng 1/2 pH (pH tối thích cho hoạt tính protease HIV-1) (Matayoshi et al., 1990) Chính vậy, cặp huỳnh quang HiLyte Fluor 488/QXL 520 có hệ số phát quang/hấp thụ cao với Ex/Em = 490/520 nm hoạt động tốt điều kiện pH thấp lựa chọn Trong đó, QXL 520 chi bền gắn với gốc Ser qua nhóm y-aminobutyric acid (GABA) nên liên kết với Ser có sẵn đầu N chất; gốc Leu đầu c thay gốc Lys liên kết với HiLyte Fluor 488 Như vậy, chất peptide huỳnh quang thiết kể có trình tự QXL 520-GABA-Ser-Phe-AsnPhe-Pro-Gln-IIe-Thr-Lys-HiLyte Flour 8 -NH (ký hiệu Peptide HF) Peptide HF đặt tổng họp Anaspec (Mỹ) với độ tinh 95% 4.2 X ác định m ột số đặc tính ch ất th iết kế 4.2.1 Cơ chất cải biến Peptide CH Trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme nào, nồng độ enzyme phải phù họp đê có biến đối tuyến tính mức độ chuyến hóa chất theo thời gian phản ứng K.êt thực nghiệm cho thây lượng protease HIV-1 1000ng thê tích phản ứng 300 |il (Hình 1A) nồng độ chất Peptide CH từ 50-60 ỊiM (Hình 1B) thích hợp đốivới phản ứng thủy phân chat Peptide CH protease H ĨV -] Kết cho thấy, thời gian phán úng phút đảm bảo mức độ tuyến tính với tốc độ phản ứng nên chọn cho nghiên cứu (Hình 1) Hình 1: Ánh hưỏng lượng protease HIV-1 (A) nồng độ CO’ chất Peptide CH (B) đến tốc độ phản ứng thuỷ phân boi protease HIV-1 Trên sở Hình 1B, biếu diễn phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo phương trình Michaelis - Menten bước đầu đánh giá hiệu xúc tác enzyme qua số động học Km, V m ax kcat Cụ thể, nồng độ Peptidc CH tăng dần đến đạt giá trị tốc độ phản ứng đạt cực đại (V m a x ), từ tính Km= [S] V o = V max/2 Từ Vmax, biết đưọ'c nồng độ enzyme tham gia phản ứng [Eo], tính hiệu xúc tác enzyme kcat= Vmax/[E0] Kết từ Hình 1B tính Vmax = (AA3oo/At) cực đại = 0,0023 umol/phút, từ xác định Km =96,08 kcat =0,49 (giây)"1, kcat/Km = 5,082 (mM.giây)"1 Nghicn cứu Tomaszek et al (1990) thiết kể chất RT/IN với trình tự tươníỉ tự Peptide CH (Ac-Arg-Lys-Ile-Leu-Nph-Leu-Asp-Gly-NÍ-b) P1 Leu nên cho giá trị Km=280 |iM thê lực thấp hon lần so với Pcptidc CH Cùng vị trí RT/IN P l-P l' không bị cải biển, chất có lực hiệu phân cắt protease HIV-1 cao Peptide CH với giá trị K m= ịiM, kcat=l,2 (giây)'1, kcat/Km=202 (mM.giây)"1 Tuy nhiên, hoạt độ protease HLV-1 trường họp xác định bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC; chất HPLC có độ nhạy cao hon, nhiên phản ứng không liên tục tiêu tốn nhiều thời gian (Tozser et al., 1991) Có thể, khác trinh tự, kích thước chất phương pháp xác định hoạt độ ảnh hưởng tới lực chất với protease HIV-1 4.2.2 Cơ chất huỳnh quang Peptide H F Tương tự, với nồng độ protease HIV-1 100 ng/phản ứng (30 ỊJ,1) (Hình 2A) sử dụng chất huỳnh quang Peptide HF nồng độ khác nhau, kết phân tích cho thấy nồng độ từ 2-3 |J.M (Hình 2B) đảm bảo mức độ tuyến tính tốc độ hình thành sản phẩm thời gian phút, chứng tỏ nơng độ thích hợp cho phản ứng xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụn