TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC VÀ CÁC TRƯỜNG KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)
LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim chế phẩm huyết tương điện di mao quản” kết trình học tập nghiên cứu thân trường Đại học Dược Hà Nội suốt hai năm qua Để có kết cuối này, xin chân thành cảm ơn thầy cô trường đại học Dược Hà Nội, người truyền đạt kiến thức làm tảng cho thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An, người dành nhiều tâm huyết, trí tuệ thời gian giỳp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Phạm Thị Thanh Hà, người tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Phương, người nhiệt tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho q trình thực nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn mơn Phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm & Mỹ phẩm Hà Nội, phòng Kiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Cuối xin cảm ơn gia đình bạn bè luụn động viên, khích lệ, giúp đỡ tơi tận tình Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AUC : Diện tích đường cong (Area Under Curve) BP : Dược điển Anh (British Pharmacopoeia) Cmax : Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration) CZE : Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) CE : Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) CPDASP : 3-[(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulphonat HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Perfomance Liquid Chromatography) IS : Chuẩn nội (Internal Standard) LOQ : Giới hạn định lượng ( Limit of Quantification) LOD : Giới hạn phát (Limit of Detection) MEKC : Sắc ký điện động Mixen ( Micellar Electrokinetic Chromatography) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol PA : Tinh khiết phõn tích (Pure for Analysis) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SDS : Sodium dodecyl sulfat SKS : Số kiểm sốt S/N : Tín hiệu/nhiễu đường (Signal/Noise) STT : Số thứ tự TBAOH : Tetrabutyl amoni hydroxyd Tmax : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa TLTK : Tài liệu tham khảo USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia) DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Cefixim thuốc kháng sinh cephalosporin hệ có nhiều ưu điểm nởi bật so với cephalosporin hệ trước tác dụng mạnh với chủng vi khuẩn Gram (-), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả khuyờờ́ch tán tới quan mà cepholosporin khác khó thâm nhập vào có thời gian bán hủy lâu Đặc biệt cefixim dễ hấp thụ đạt nồng độ điều trị máu bằng đường uống thay phải sử dụng đường tiêm nhiều kháng sinh khác nờn dễ sử dụng Chính vài năm trở lại Cefixim sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam nhiều dạng bào chế viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch Tuy nhiên, cefixim lại kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng cao Trong năm 2008 2009, nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chi lưu hành khơng đạt tiêu chuẩn hàm lượng viên bao phim Massime (cefixim 200 mg, Ấn Độ), viờn nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viờn nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc) Hiện dược điển Việt Nam chưa có chuyờn luận Cefixim, việc kiểm nghiệm chi dựa tiêu chuẩn sở Trong dược điển BP 2008 USP 32, cefixim định lượng bằng kỹ thuật HPLC Việc định lượng Cefixim huyết tương người bằng kỹ thuật nghiên cứu giới ở Việt Nam Ưu điểm kỹ thuật HPLC có khả tách tốt, độ lặp lại độ xác cao, nhiên có nhược điểm chi phí cao, sử dụng nhiều dung mơi, hóa chất độc hại Điện di mao quản kỹ thuật phân tích đại, nghiên cứu đưa vào sử dụng nhiều nước giới với nhiều ưu điểm hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn dung mơi, độc hại Cho đến nay, Việt Nam, điện di mao quản kỹ thuật lĩnh vực phân tích nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế Từ phân tích trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim chế phẩm huyết tương điện di mao quản” với mục tiêu: Xây dựng chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim chế phẩm huyết tương Định lượng hoạt chất số chế phẩm lưu hành thị trường cũng xác định nồng độ hoạt chất mẫu huyết tương thỏ nhằm phục vụ công tác nghiên cứu kiểm soát điều trị Chương TỔNG QUAN 1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN Điện di mao quản (capillary electrophoresis: CE) kỹ thuật tỏch cỏc chất dựa sở di chuyển khác tiểu phân mao quản chứa dung dịch chất điện ly tác dụng điện trường 1.1.1 Nguyên tắc hoạt động điện di mao quản [4], [6], [25], [37] Sơ đồ hệ thống điện di trình bày ở hình 1.1 Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di Quá trình điện di thực mao quản silica dài 25-100 cm, đường kính 25 - 100 àm, đường kính ngồi 300 - 400 àm Sử dụng áp suất để đưa dung dịch mẫu dung dịch đệm lên mao quản Điện chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo q trình tỏch: cỏc chất phân tích phát nhờ detector thích hợp di chuyển đầu mao quản Detector hay dùng detector UV hay detector mảng diod DAD Vị trí phát nằm mao quản gọi “cửa sổ” Cửa sở có bằng cách đốt đoạn lớp bao polyimid để mao quản trở thành ống thủy tinh suốt 1.1.2 Đặc điểm điện di mao quản [4], [6], [25], [37] - Có hiệu lực tỏch cỏc chất cao ống mao quản thủy tinh hoặc Teflon có đường kính 25 - 100 àm - Điện cao, thường từ 10 - 30 kV (200 - 500 V/cm) đặt ở hai đầu ống mao quản - Số đĩa lý thuyết cột mao quản lớn, thường từ 10 - 106 nên có khả tách tốt mẫu chứa hỡn hợp phức tạp - Thể tích mẫu tiêm nhỏ, cỡ - 50 nl nên tiết kiệm mẫu - Có nhiều kiểu CE nên khả ứng dụng vào thực tế đa dạng - Sự tách thực chủ yếu môi trường nước với có mặt chất điện ly nên kinh tế khơng độc hại - Có khả tự động hóa nên dễ dàng phân tích số lượng mẫu lớn 1.1.3 Phân loại điện di mao quản [4] Điện di mao quản có nhiều kiểu khác Mỡi kiểu có chế tách riêng Bảng 1.1 tóm tắt kiểu điện di hay sử dụng phân tích Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản Kiểu điện di Điện di mao quản vùng Cơ chế tách Linh độ khác chất (phụ thuộc (capillary zone elctrophoresis) điện tích kích cỡ ion) Sắc ký điện động mixen MEKC Tương tác phân cực / không phân cực với (micellar electrokinetic hạt mixen dung dịch linh độ chromatography) Điện di mao quản gel CGE chất Linh độ chất tương tác loại cỡ với (capillary gel electrophoresis) hạt gel Sự phân bố chất phân tích vào pha tĩnh Điện sắc ký mao quản CEC (capillary electrochromatography) (hạt nhồi) hoặc pha động (dung dịch điện ly nền) linh độ khác chất Trong điện di mao quản vùng (CZE) kiểu điện di đơn giản nhất, sử dụng rộng rãi Kỹ thuật CZE sử dụng nghiên cứu 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM 1.2.1 Cấu trúc hóa học [3], [14] O HO 1S H2 N O O N N H N H N H CH2 3H2O S O OH O - Công thức phân tử: C16H15N5O7S2.3H2O - Khối lượng phân tử: 507,5 - Tên khoa học: - Acid (6R,7R)-7-[(Z)-(2-amino-4-thiazolyl)-2(carboxymethoxyimino)acetamido]-8-oxo-3-vinyl-5-thia-1azabicyclo[4,2,0]-oct-2-ene-2-carboxylic trihydrat 1.2.2 Tính chất vật lý [3], [14] Bột tinh thể màu trắng hoặc gần trắng, hút ẩm, nóng chảy ở khoảng 220°C kèm phân hủy Dễ tan methanol, propylen glycol, dimethyl sulfoxid, glycerin Rất tan aceton, ethanol, nước Khơng tan diethyl ether, ethylacetat, aceton hexan Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim 1mL H2O có pH từ 2,6 đến 4,1 Hệ số phân bố octanol/nước cefixim trihydrat 0,0029 Theo [14] cefixim trihydrat có hằng số ion hóa: pKa1 = 2,10 nhóm -COOH cephem ở vị trí số 2, pKa2 = 2,69 nhóm -NH2 ở vị trí số nhóm amino-thiazol , pKa3 = 3,73 nhóm -COOH mạch nhánh gắn vào vị trí số Cefixim trihydrat có đồng phân Z E đồng phân Z có phở 58 Tính tốn kết Tiến hành điện di mẫu thử theo chương trình chọn, ghi kết diện tích pic Tính tốn nồng độ hoạt chất mẫu đem phân tích dựa vào đường chuẩn xây dựng sau: Đường chuẩn biểu diễn bằng phương trình y = ax + b y đại lượng biểu diễn diện tích pic, x đại lượng biểu diễn nồng độ Nồng độ hoạt chất huyết tương tính theo công thức sau: x (àg/mL) = ( y + b ) /a Ứng dụng định lượng nồng độ hoạt chất huyết tương thỏ dùng thuốc Thỏ lựa chọn theo tiêu chí: cân nặng từ 2,2 đến 2,5 kg, khỏe mạnh Thỏ dùng thuốc sau: Tên thuốc: Tacoxim 200 ( cefixim 200 mg) Nơi sản xuất: Yeva Therapeutics Pvt., Ltd - Ấn Độ SKS : VN-4089-07 Liều dùng: Tính tốn liều dùng cho liều dùng tương đương với người nặng 50 kg uống liều đơn 400 mg, cách tính theo [7] cụ thể sau: Vì người nặng 50 kg uống liều đơn 400 mg nên mỗi kg tương ứng với mg, hệ số nội suy thỏ người nên mối kg thỏ phải tương ứng với 24 mg cefixim Thỏ chọn có cân nặng từ 2,2 -2,5 kg nên phải uống tương đương liều khoảng 50mg Lấy viên Tacoxim 200 nghiền mịn, hòa tan 50 mL nước cất dung dịch có nồng độ mg/mL Cho mỡi thỏ uống 6mL dung dịch Lấy mẫu phân tích mẫu: Sau khoảng thời gian định lấy mẫu máu xử lý mẫu theo quy trình Mẫu sau xử lý phân tích theo chương trình điện di khảo sát Kết thu thỏ trình bày bảng 3.20 cỏc hỡnh từ 3.18 đến 3.21 sau: 59 Bảng 3.20: Kết định lượng cefixim huyết tương thỏ STT Kết Ti số diện tích pic Nồng độ (àg/mL) Ti số diện tích pic Nồng độ (àg/mL) Ti số diện tích pic Nồng độ (àg/mL) Nờng độ trung bình (àg/mL) 1h - 2h 1,2578 3,51 1,2540 3,44 1,2567 3,49 3,48 3h 1,3587 5,39 1,3630 5,47 1,3676 5,55 5,47 4h 1,2960 4,21 1,2966 4,23 1,2992 4,28 4,24 Hình 3.18: Điện di đồ mẫu huyết Hình 3.19: Điện di đồ mẫu huyết thỏ sau 1h uống thuốc thỏ sau 2h uống thuốc Hình 3.20: Điện di đồ mẫu huyết Hình 3.21: Điện di đồ mẫu huyết thỏ sau 3h uống thuốc thỏ sau 4h uống thuốc Nhận xét: Như so với phương pháp HPLC, phương pháp CE có 60 thời gian thực mẫu ngắn quy trình xử lý mẫu đơn giản hơn, mặt khác chi phí cho việc thực mẫu phân tích theo phương pháp CE thấp dựng ớt hóa chất dung mơi phương pháp CE phù hợp để định lượng hoạt chất huyết tương nhằm mục đích nghiên cứu cá thể hóa điều trị 61 Chương BÀN LUẬN 4.1 VỀ ỨNG DỤNG CE TRONG KIỂM SOÁT ĐIỀU TRỊ [36] Ngày có nhiều thuốc phân tích bằng phương pháp CE để phục vụ mục đích khác như: phân tích độc tính pháp y, kiểm tra độ tinh khiết hoặc nghiên cứu chuyển hóa thuốc Kiểm sốt điều trị (Therapeutic Drug Monitoring: TDM) cơng việc phân tích định lượng thuốc phục vụ cho việc điều chinh liều ở từng bệnh nhân nhằm tối ưu hóa đáp ứng lâm sàng CE có ưu điểm ứng dụng TDM là: tốc độ, đơn giản, chi phí phân tích mẫu thấp có tính chọn lọc cao Tuy nhiên có nhược điểm nởi bật chịu ảnh hưởng hiệu ứng nền, độ nhạy kém độ xác không mong muốn 4.1.1 Độ nhạy Hầu hết thuốc phân tích TDM có nồng độ huyết tương từ 1-30 àg/mL Để định lượng nồng độ thấp có mặt protein với nồng độ cao (g/L), thuốc phải làm tăng nồng độ ở bên hoặc ở bên mao quản Một số thuốc theophillin hay phenobarbital xử lý mẫu đơn giản dễ dàng có thuốc địi hỏi phải q trình chiết cô đặc mẫu phức tạp Do thời gian thực đề tài có hạn thiết bị, hóa chất có nhiều hạn chế nên chúng tơi chưa có điều kiện nghiên cứu kỹ qui trình làm đặc mẫu qua cải thiện LOD LOQ 4.1.2 Hiệu ứng Trong phân tích CE, độ phân giải số đĩa lý thuyết bởi chất có mẫu, đặc biệt ion vô protein Không giống HPLC, hiệu ứng ảnh hưởng lớn tới phân tích mẫu phân tích bằng CE với chất chuẩn dễ phân tích huyết tương sẽ khó khăn 62 Trong huyết tương chứa lượng lớn protein (60 mg/mL)và muối (140 mmol/mL) Muối làm pic bị doãng protein bám vào thành mao quản gây phản ứng thứ cấp ảnh hưởng lớn đến độ lặp lại Hiệu ứng đáng kể lượng mẫu phân tích tăng nhiều.Để hạn chế hiệu ứng nền, chủng tiến hành lọc mẫu qua màng lọc 0,2 àm sau dựng MeOH để loại bỏ protein, nhiên khơng thể loại muối tiến hành dùng đệm phosphat pH 6,8 đệm có sức ion lớn để làm giảm ảnh hưởng muối huyết tương 4.1.3 Độ xác độ lặp lại Với CE, thông số quan trọng để đánh giá độ xác diện tích pic (hoặc chiều cao pic) với phân tích định lượng thời gian dịch chuyển cho phân tích định tính Độ xác so sánh thơng số thơng thường kém so với phương pháp HPLC Sự kém xác diện tích hoặc chiều cao pic yếu tố ảnh hưởng lượng mẫu tiêm hiệu ứng thành mao quản Sự xác diện tích pic hoặc chiều cao pic đánh giá bởi thông số RSD Thông thường trường hợp thơng số diện tích pic hay dùng có độ xác cao Tuy nhiên, dùng nội chuẩn, độ xác cải thiện, RSD diện tích pic hiệu chinh thu nhỏ 5%, tương đương với phương pháp HPLC [43] RSD liên quan trực tiếp tới nồng độ hoạt chất mẫu, đú dùng kỹ thuật cô đặc mẫu cải thiện thêm thơng số Tuy nhiên thời gian nghiên cứu có hạn, mặt khác hệ số RSD =2,67% tốt với phân tích dịch sinh học 4.2 VỀ QUY TRÌNH CHIẾT LOẠI BỎ PROTEIN TRONG HUYẾT TƯƠNG 4.2.1 Chiết lỏng-lỏng chiết pha rắn Chiết lỏng-lỏng chiết pha rắn ứng dụng nhiều HPLC GC, ứng dụng để loại protein muối mẫu huyết tương 63 Phương pháp có lợi vừa làm mẫu, loại bỏ hiệu ứng vừa cô đặc mẫu Tuy nhiên trường hợp cefixim, phương pháp bộc lộ nhiều nhược điểm Vì cefixim chất phân cực nên khơng thích hợp với phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung mơi khơng phân cực Chiết pha rắn làm mẫu đặc mẫu cải thiện LOD LOQ Tuy nhiên kỹ thuật địi hỏi thời gian phân tích mẫu lớn nên khơng phù hợp phân tích mẫu trường hợp bệnh nhân cấp cứu, mặt khác đầu tư trang thiết bị ban đầu cột chiết pha rắn đắt nên khơng có tính kinh tế khơng phù hợp với phịng thí nghiệm vừa nhỏ 4.2.2 Loại protein huyết tương dung môi hữu Hai dung môi hữu thường dùng để loại protein huyết tương MeCN MeOH MeCN thường xuyên dùng để loại protein HPLC Với kỹ thuật CE, loại protein, MeCN kết hợp với lượng NaCl cao mẫu (50 mmol/L) cịn cho phép đặc mẫu tới 5-30 lần Tuy nhiên trình làm thực nghiệm chiết cefixim huyết tương bằng MeCN hoặc hỗn hợp MeCN MeOH với ti lệ khác không thu kết mong muốn Vì cefixim tan tốt MeOH nên MeOH thích hợp để tách loại protein khỏi huyết tương Nếu dùng ti lệ thể tích huyết tương: MeOH = 1:1 mẫu chưa đủ sạch, cản trở trình phõn tớch, ti lệ 1:4 mẫu bị pha lỗng q nhiều làm giảm độ nhạy phương pháp ti lệ 1:2 hợp lý Tuy nhiên dùng theo ti lệ này, huyết tương bị pha loãng lần làm giảm độ nhạy phương pháp nên mặc dù tăng tối đa thời gian tiêm mẫu lên 10 giây xong LOQ thu chi 64 àg/mL, chi thích hợp để nghiên cứu cá thể hóa điều trị, chưa thể dùng để nghiên cứu dược động hoặc tương đương sinh học 4.3 VỀ SO SÁNH KỸ THUẬT HPLC VÀ CE VỚI PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT TRONG CHẾ PHẨM VÀ TRONG HUYẾT TƯƠNG 4.3.1 Trong chế phẩm Thực nghiệm cho thấy phân tích cefixim chể phẩm bằng phương pháp HPLC phương pháp CE kết thu hồn tồn tương đương, kỹ thuật CE dựng ớt hóa chất dung mơi đắt tiền độc hại kỹ thuật phù hợp để phân tích kiểm nghiệm chất lượng thuốc ở sở sản xuất, nghiên cứu trung tâm kiểm nghiệm 4.3.2 Trong huyết tương Hiện giới Việt Nam chưa có cụng tỡnh nghiên cứu định lượng cefixim huyết tương công bố Tuy nhiên nghiên cứu trờn cỏc thuốc khác cho thấy nhìn chung kỹ thuật CE phân tích dịch sinh học có ưu điểm nhanh dễ dàng thực hơn, cho độ phân giải cao với chất có tính phân cực Bên cạnh chi phí thực mẫu Trái lại, kỹ thuật HPLC có ưu điểm có độ tuyến tính, độ xác tốt hơn, đường đẹp giới hạn phát giới hạn định lượng tốt Từ thực nghiệm phân tích cefixim huyết tương bằng kỹ thuật CE so sánh với phương pháp định lượng bằng HPLC nhận thấy độ tuyến tính, tính xác nhiễu đường tương đương, nhiên độ nhạy kém Với kỹ thuật HPLC, thông thường LOQ 0,2 àg/mL với kỹ thuật CE chi số àg/mL, kỹ thuật chi dùng để nghiên cứu cá thể hóa điều trị mà chưa thể áp dụng để nghiên cứu dược động học tương đương sinh học Để nghiên cứu cần khảo sát thêm qui trình chiết nghiên cứu kỹ thuật làm tăng nồng độ chất phân tích 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ kết thực nghiệm thu được, đạt mục tiêu đề xây dựng phương pháp điện di mao quản phù hợp để vừa định lượng cefixim chế phẩm vừa định lượng cefixim huyết tương.Cỏc kết thu sau: Đã xây dựng phương pháp định lượng cefixim chế phẩm huyết tương bằng CZE với điều kiện điện di: Chiều dài cột mao quản l = 40 cm, đường kính id = 50 àm, Điện đặt vào hai đầu mao quản: 25 kV, Hệ đệm natri phosphat 50 mM pH 6,80, Nhiệt độ mao quản: 25°C, Tiêm mẫu: 50 mbar x 10 giây (với huyết tương) 50 mbar x giây (với chế phẩm), Chương trình preconditioning: 0,5 phút SDS 10mM + 0,5 phút nước + phút NaOH 0,1M + 0,5 phút nước tinh khiết + phút đệm, Bước sóng phát 283 nm Đã xác định hàm lượng cefixim số chế phẩm thuốc viên bột cốm lưu hành trờn thỡ trường bằng phương pháp điện di vừa xây dựng Xác định nồng độ cefixim mẫu huyết tương tự tạo mẫu huyết tương thỏ uống thuốc, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu cá thể hóa điều trị với bệnh nhân dùng cefixim Kiến nghị: Ứng dụng rộng rãi định lượng hoạt chất chế phẩm công tác kiểm nghiệm thuốc sở sản xuất trung tâm kiểm 66 nghiệm nhằm tiết kiệm thời gian, chi phí góp phần bảo vệ môi trường Để triển khai kỹ thuật điện di mao quản nhằm định lượng nồng độ hoạt chất huyết tương cần thiết phải nghiên cứu thêm qui trình định lượng nhằm tăng giới hạn phát giới hạn định lượng để ứng dụng đánh giá tương đương sinh học chế phẩm có thị trường Mở rộng nghiên cứu sử dụng điện di mao quản để tỏch cỏc đồng phân đối quang nghiên cứu kiểm nghiệm số chế phẩm đa thành phần để đưa phương pháp có nhiều ưu điểm có khă ứng dụng cao kiểm nghiệm thuốc 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Tử An (2006), Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm hai thành phần Amoxicilin Acid clavulanic, Trường Đại học Dược Hà Nội, Đề tài nghiên cứu cấp Bộ Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Thẩm định phương pháp phân tích sinh học ứng dụng nghiên cứu sinh khả dụng dược động học, Trường đại học Dược Hà Nội Bộ mơn Hóa dược (2002), Hóa dược 2, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.200-201 Bộ mơn phân tích (2006), Hóa phân tích 2, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.225-237 Bộ mơn phân tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.127, 133 6.Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao, Trường đại học Tổng hợp quốc gia Hà Nội, tr.123-128 Trịnh Văn Lẩu (2006), Xây dựng hướng dẫn thử độc tính thuốc, Phụ lục 1: Ngoại suy liều, thể tích dung dịch mẫu thử dùng cho động vật thí nghiệm, phân loại độc Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội (2007), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện di mao quản nghiên cứu định lượng kháng sinh Cefuroxim chế phẩm dịch sinh học, Đề tài nghiên cứu cấp 9.Phùng Thị Vinh, Tạ Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Tựu CS (2006), Nghiên cứu tương đương sinh học viờn nang Cefixim sản xuất nước, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, (2006), tập 4, số 12, tr 21 - 25 68 10.Tống Thị Thanh Vượng (2006), Nghiên cứu phân tích kháng sinh β-lactam chế phẩm điện di mao quản, Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường đại học Dược Hà Nội 11 Các thông tin internet: http://www.doisongphapluat.com.vn http://www.soytedaklak.gov.vn http://www.soytekhanhhoa.gov.vn http://www.vnmedia.vn TIẾNG ANH 12 Altria K.D (1993), Quantitative aspects of the application of capillary electrophoresis to the analysis pf pharmaceuticals and drug related impurities, J Chromatogr 646, pp.245-257 13 BP (2008), p.431 14 Brittain H.G (1998), Analytical profiles of Drug substances and excipients 25, pp.40-83 15 Falkowski AJ et al (1987), Determination of cefixime in biological sample by reverse-phase high-performance liquid chromatography, J Chromatogr 422, pp.145-152 16 Garcia J.A (1995), Oral cephalosporins: current perspectives, Inter J Antimicrob Agents 5, pp 231-243 17 Gaspar A., Adrasi M., Kardos Sz (2002), Application of CZE to the analysis and to a stability of cephalosporin, J Chromatogr B 775, pp.239-245 18 Golcu A et al (2005), Anodic voltametric behavior and determination of cefixime in pharmaceutical dosage forms and biological fluids, Talanta 67, pp 703-712 19 Honda S et al (1992), Determination of cefixime and its metobolites by high performance capillary electrophoresis, J Chromatogr 590, pp.364-368 69 20 Japanese pharmacopoeia XIV (2006), p.443 21 Knoller J (1987), Invitro stability of cefixime (FK -027) in serum, urine and buffer, J Chromatogr A 389, pp.312-316 22 Korean pharmacopoeia (2007), pp.171-173 23.Leveque D et al (1997), Capillary electrophoresis for pharmacokinetics studies, J Chromatogr B 697, pp.67-75 24 Liu GL et al (1993), Determination of cefixime in human plasma and urine using high performance liquid chromatography column switching technique, Yao Xue Xue Bao 28, pp 216-221 25 Lunn G (2004), Capillary electrophoresis methods for pharmaceutical analysis, John Wiley & Sons, pp.109-112, 315-317, 378 26 Mayer B.X (2000), How to increase precision in capillary electrophoresis, J Chromatogr A 907, pp.21-37 27 Mc Ateer J.A et al (1987), Liquid- chromatographic determination of five orally active cephalosporins : cefixime, cefaclor, cefadroxil, cephalexin, and cephradine in human serum, Clin Chem 33, pp.1788-1790 28 Meng F et al (2005), Sensitive liquid chromatography-tadem mass spectrometry method for the determination of cefixime in human plasma: Application to a pharmacokinetic study, J Chromatogr B 819, pp.277-282 29 Mrestani Y et al (1997), Determination of cephalosporins in urine by CZE, Anal Chem Acta 349, pp.207-213 30 Nahata M.C (1990), Mesurement of cefixime in serum and cerebrospiral fluid by high-performance liquid chromatography, J Liq Chromatogr.& related tech 14, pp.3755-3759 31 Paresh B., et al (2006), Spectrophotometric, difference spectroscopic and high- performance liquid chromatographic methods for the determination of Cefixime in pharmaceutical formulation, J AOAC inter 89, pp 987-994 70 32 Pe’hourcq F., Jarry C (1998), Determination of third-generation cephalosporins by high- performance liquid chromatography in connection with pharmacokinetic studies, J Chromatogr A 812, pp.159-178 33 Riley C.M., Fell A.F (1996), Development and validation of analytical methods, Elservier Science Ltd, pp.9-71, 247-289 34 Gonzalez H et al (2001), Reversed phase high performance liquid chromatographic determination of Cefixime in bulk drugs, J Liq Chromatogr & related tech 24, pp.2315-2324 35 Sciacchitano C.J., Mopper B., Specchio J.J (1994), Identification and separation of five cephalosporins by micellar electrokinetic chromatography, J Chromatogr B 657, pp.395-399 36 Shihabi Z.K (1998), Therapeutic drug monitoring by capillary electrophoresis, J Chromatogr A 807, pp.27-36 37 Shintani H., Pholonsky J (1997), Handbook of capillary electrophoresis applications, Blackie academic & professional, p.158 38 Tokuma Y., Shiozaki H., Noguchi H.(1984), Determination of a new orally active cephalosporin in human plasma by high-performance liquid chromatography using automated column switching, J Chromatogr 311, pp.339-385 39 Toothaker R.D (1987), Recent Analytical Methods for Cephalosporins in Biological Fluids, Antimicrob Chemothe Aug.1987, pp 1157-1163 40 USP 32 (2009), Vol 2, p.1835 41 Yamamoto H et al (2000), Orally Active Cephalosporins Part 4: Synthesis, Structure- Activity Relationships and Oral Absorption of 3-[(E) and (Z)-2Substituted Vinyl]-cephalosporins, Bio & Med Chem 8, pp.43-54 42 Yamamoto H et al (2002), Orally Active Cephalosporins Part 4: Synthesis, Structure- Activity Relationships and Oral Absorption of Novel 3-(4-Pyrazolylmethylthio)cephalosporins with Various C-7 Side Chains, Bio & Med Chem 10, pp.1525-1545 43 Zendellovska D et al (2003), High-performance liquid chromatographic method for determination of Cefixime and Cefotaxime in human plasma, Bul Chem Tech Macedonia 22, pp.39-45 71 PHỤ LỤC QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG VIấN NÉN VÀ TRONG BỘT PHA HỖN DỊCH Các bước Viên nang Chuẩn bị mẫu - Đối với viên nén: Cân 20 viên lấy khối lượng, , tính khối lượng bột thuốc trung bình viên, nghiền mịn - Đối với bột pha hỡn dịch: Cân 10 gói bột, tính khối lượng bột thuốc trung bình gói, nghiền mịn Chuẩn bị đệm Cân xác 780g Natri dihydrophosphat vào cốc có mỏ khơ, pha nước chuyển vào bình định mức 100 mL, thêm nước tới vạch lắc siêu âm cho đồng Cân xác 890 g Natri dihydrophosphat vào cốc có mỏ khơ, pha nước chuyển vào bình định mức 100 mL, thêm nước tới vạch lắc siêu âm cho đồng Đem đo pH 70 mL dung dịch Natri dihydrophosphat, thêm dung dịch muối Natri dihydrophosphat đạt pH 6,8 Dung dịch thử - Cân lượng chế phẩm tương ứng với 50 mg hoạt chất Thêm mL methanol, thêm nước vừa đủ 100 mL.(dung dịch 2) Lắc siêu âm 10 phút - Hút xác 5,0 mL dung dịch 2, thêm 2mL dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn nội thêm đệm vừa đủ 10 mL Lắc kỹ Lọc qua màng lọc 0,2àm - Cân xác khoảng 50 mg chất chuẩn Làm tương tự dung dịch thử Chương trình Cột Agilent HPCE l = 40 cm, i.d = 50 àm định lượng - Tiêm mẫu bằng áp suất 50 mbar x 5giây - Điện thế: 25 KV , bước sóng 283 nm, nhiệt độ 250C PHỤ LỤC 72 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG Các bước Chuẩn bị mẫu - Đối với huyết tương trắng + Lấy xác 0,8 mL huyết tương, thêm 0,1 mL cefixim ở nồng độ khác 0,1 mL chất nội chuẩn nồng độ mg/mL, sau thêm xác 2,0 mL MeOH Lắc xoáy phút đem ly tâm 10 phút (tốc độ 4000 vũng/phỳt) Lấy dịch, lọc qua màng lọc 0,2 àm dịch lọc đem chạy điện di Với huyết tương bệnh nhân hoặc súc vật dựng cefixim + Lấy xác 0,9 mL huyết tương, thêm 0,1 mL chất nội chuẩn nồng độ mg/mL, sau thêm xác 2,0 mL MeOH Lắc xốy phút đem ly tâm 10 phút (tốc độ 4000 vũng/phỳt) Lấy dịch, lọc qua màng lọc 0,2 àm dịch lọc đem chạy điện di Chuẩn bị đệm Cân xác 780 g Natri dihydrophosphat vào cốc có mỏ khơ, pha nước chuyển vào bình định mức 100 mL, thêm nước tới vạch lắc siêu âm cho đồng Cân xác 890 g Natri dihydrophosphat vào cốc có mỏ khơ, pha nước chuyển vào bình định mức 100 mL, thêm nước tới vạch lắc siêu âm cho đồng Đem đo pH 70 mL dung dịch Natri dihydrophosphat, thêm dung dịch muối Natri dihydrophosphat đạt pH 6,8 Chương trình điện di - Cột Agilent HPCE l = 40 cm, i.d = 50 àm, - Tiêm mẫu bằng áp suất 50 mbar x 10 giây - Điện thế: 25 kV , bước sóng 283 nm, nhiệt độ 250C ... ớt g? ?y nhiễm Do thực tế phương pháp điện di mao quản x? ?y dựng dùng để định lượng cefixim chế phẩm thay cho phương pháp HPLC 3.3 XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG 3.3.1 Xử lý mẫu huyết tương. .. phương pháp để định lượng cefixim chế phẩm huyết tương, cụ thể là: 2.3.2.1 Lựa chọn điều kiện điện di Phương pháp điện di chọn ở điện di mao quản vùng (CZE), hệ thống m? ?y điện di mao quản Hewlett... mẫu cefixim huyết tương 27 đệm xử lý điều kiện để xác định hiệu suất 28 Chương KẾT QUẢ 3.1 X? ?Y DỰNG PHƯƠNG PHÁP Phương pháp x? ?y dựng cho định lượng đồng thời cefixim ở chế phẩm huyết tương