Tạo cây thuốc lá mang gen đa đoạn kháng virus TMV CMV TYLCV và TSWV bằng kỹ thuật RNAi

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67 Tạo thuốc mang gen đa đoạn kháng virus TMV, CMV, TYLCV TSWV kỹ thuật RNAi Lê Thị Thủy1,*, Nguyễn Thị Thu Hiền2, Phạm Thị Vân2, Chu Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn2 Đại học Sư phạm Hà Nội, 136 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Viện Cơng nghệ sinh học, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2014 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2014; Chấp nhận đăng ngày 19 tháng năm 2014 Tóm tắt: RNAi phương pháp sử dụng rộng rãi để phát triển thuốc chuyển gen kháng virus phổ rộng giúp giảm đáng kể thiệt hại suất virus gây Do đó, nghiên cứu tiến hành thiết kế vector chuyển gen nhị thể pGWTCYS mang cấu trúc RNAi lặp lại đoạn gen TCYS đảo chiều có ngăn cách đoạn intron Đoạn gen TCYS mang đa đoạn gen chức không đầy đủ loại virus gây hại phổ biến thuốc Việt Nam TMV (Tobacco mosaic virus – virus khảm thuốc lá), CMV (Cucumber mosaic virus – virus khảm dưa chuột), TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus – virus xoăn vàng cà chua) TSWV (Tomato spotted wilt virus – virus héo đốm cà chua) Cấu trúc chuyển vào giống thuốc Nicotiana tabacum K326 C9-1 Sau trình tái sinh chọn lọc thu 66 dòng (36 dòng K326 30 dòng C9-1) phát triển bình thường Phân tích PCR cho thấy tất dịng dương tính với gen chuyển TCYS Đánh giá tính kháng loại virus nghiên cứu dòng thuốc chuyển gen hệ T0 thu 20/66 dịng (trong đó, 11 dịng K326 dịng C9-1) khơng có biểu bệnh virus gây sau lây nhiễm Từ khóa: TMV, CMV, TYLCV, TSWV, thuốc lá, RNAi Mở đầu* chế tác hại virus kiểm soát mức độ định thơng qua số biện pháp mang tính chất phịng trừ sử dụng giống bệnh hay biện pháp canh tác [1] Bên cạnh nấm vi khuẩn, virus nguyên nhân gây nên bệnh truyền nhiễm thực vật Cho đến nay, có gần 1000 lồi virus hại thực vật phát hiện, chưa có loại thuốc bảo vệ thực vật chống lại bệnh virus gây nên mối lo ngại lớn cho nơng nghiệp Con người hạn Hiện nay, với phát triển công nghệ sinh học, việc tạo trồng chuyển gen kháng virus xem biện pháp đại hữu hiệu việc chống lại bệnh virus hại thực vật Dựa chiến lược “tính kháng tạo từ tác nhân gây bệnh” kết hợp với việc phát chế gây bất hoạt gen sau phiên _ * Tác giả liên hệ ĐT.: 84-986466739 Email: hienthuy20@gmail.com 58 L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  mã (RNAi), nhiều nghiên cứu nhằm tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa trình tự gen virus gây bệnh thực Bằng chứng kháng virus thông qua RNAi cung cấp Waterhouse cộng (1998) [2], kháng lại virus PVY (Potato virus Y) thuốc chuyển gen Cho tới nay, có nhiều thành cơng nhiều hệ thống vật chủ khác để kháng lại vài loại virus [3- 6] RNAi chế tự nhiên tế bào sống làm bất hoạt gen đó, chế tìm thấy nấm, thực vật động vật [2, 7] Ở thực vật, RNAi thực cách chuyển gen có cấu trúc biểu phiên mã cao RNA sense, anti-sense RNA kẹp tóc bổ sung (hairpin RNA, hpRNA) mà chứa trình tự tương đồng với gen đích [8, 9] Bệnh khảm bệnh phổ biến thuốc làm giảm từ 35%-65% suất trồng, bệnh xuất gây hại loại virus TMV CMV [1] Đây loại virus có phổ kí chủ rộng, khả chống chịu cao lan truyền dễ dàng qua tiếp xúc học bệnh khỏe Về mặt di truyền, genome virus ARN đơn dương [10], gen mã hóa cho protein vỏ (coat protein-CP) virus, loại protein đóng vai trò quan trọng dịch chuyển virus, q trình truyền bệnh phân hóa triệu chứng bệnh [11-13] Với vai trị nó, gen CP thường sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho tạo trồng chuyển gen kháng virus theo chế RNAi Nhóm bệnh phổ biến thuốc virus gây hại bệnh xoăn TYLCV TSWV nguyên nhân gây nên triệu chứng xoăn lá, xoăn thuốc Là nhóm virus đa thực gây hại nhiều đối tượng trồng thuộc họ Cà, đặc biệt cà chua, thuốc lá, [14, 15] truyền bệnh nhờ môi giới Trong đó, virus xoăn vàng cà 59 chua TYLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae phát lần Israel vào năm 1939 [16] Các virus chi Begomovirus chia làm nhóm dựa vào cấu trúc genome chúng bao gồm loại hai vòng gen - thể dipartite, loại vòng gen dịch mã thành hai khung đọc riêng biệt thể monopartite loại vòng gen kèm DNA vệ tinh [17- 19] TYLCV lan truyền nhờ loài bọ phấn Bemisia tabaci, lồi trùng có sức sinh sản nhanh mạnh Genome TYLCV gồm gen chức gen V1 (CP), V2 (pCP), C1, C2, C3, C4 Các gen hệ gen TYLCV nằm vòng DNA-A hai vòng DNA-A DNA-B riêng biệt tùy chủng virus ngăn cách với vùng liên gen khoảng 150 250 nucleotide TSWV – Virus héo đốm cà chua thuộc loại Tospovirus, họ Bunyaviridae, có cấu tạo dạng thiên thể kích thước 70-90nm Genome TSWV gồm ba sợi RNA đơn âm (negative) lưỡng tính (ambisense) sợi L (8,9 kb), sợi M (4,9 kb) sợi S (2,9 kb) Sợi L mã hóa cho replicase liên quan tới trình phiên mã virus sợi M mã hóa cho protein vận chuyển (NSm) protein vỏ (GN GC) – loại protein đóng vai trị quan trọng xâm nhiễm truyền bệnh, sợi S mã hóa cho nucleprotein (N) protein ức chế trình bất hoạt gen (NSs) [20, 21] Bọ trĩ môi giới truyền bệnh hiệu virus Việc sử dụng nguồn gen chức virus chuyển vào trồng nhằm tạo kháng virus cơng nghệ RNAi ứng dụng thành công nhiều nghiên cứu Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam [22-24] Ứng dụng công nghệ này, cấu trúc RNAi đa đoạn mang đoạn gen chức không đầy đủ virus TMV, CMV, TSWV TYLCV lặp lại đảo chiều thiết kế nhằm tạo trồng chuyển gen có tính kháng virus 60 L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  phổ rộng Cấu trúc chuyển vào thuốc giống K326 C9-1 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Những dòng thuốc chuyển gen hệ T0 thu nhận phân tích PCR tính kháng virus Cloning Kit (Invitrogen), kit thực phản ứng Gateway Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen) E coli One Shot® TOP 10 (Invitrogen), chủng Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang plasmid gây độc pGV2260, E coli DH5α Vật liệu thực vật Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguồn gen virus TMV, CMV, TYLCV TSWV Các nguồn gen phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp gồm: 1) Vector pENTRY/TCY mang 740 nucleotide đoạn gen đa đoạn TCY (TCY chứa 304 nucleotide CP TMV nối 255 nucleotide CP CMV (Phạm Thị Vân et al, 2009) ghép nối với đoạn gen đa đoạn nhân tạo TYLCV gồm 112 nucleotide CP, 101 nucleotide C1/C2, 127 nucleotide C1/C4 130 nucleotide βC1) 2) Vector tách dòng pENTR/TSWV mang 270 nucleotide đoạn gen mã hóa protein CP khơng đầy đủ virus TSWV phân lập từ mẫu thuốc Tây Ninh Chủng khuẩn vector Vector chuyển gen pK7GWIWG2(II) [25], kit nhân dịng pENTRY Directional TOPO® Cây thuốc thuộc giống Nicotiana tabacum K326 C9-1 nuôi cấy điều kiện in-vitro (được cung cấp Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế mồi cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đa đoạn TCYS Để khuyếch đại vùng gen quan tâm, mồi RNAi thiết kế với mồi TMV-CPFi-2 bổ sung thêm nucleotide CACC tương thích với đầu 3’ GTGG vector nhân dịng pENTRTM/D-TOPO® (Invitrogen) cịn hai mồi cTYLCV-TSWV-Fi-1 cTYLCVTSWV-Ri-1 có 20 nucleotide gối lên (10 nucleotit đầu 5’ TMV 10 nucleotit đầu 3’ TSWV) Kích thước đoạn gen đa đoạn TCYS là1000 bp Bảng Danh sách mồi Tên mồi Trình tự (5'-3') TMV-CP-Fi-2 cTYLCV-TSWV-Fi-1 CACCGAAGTTGAAAATCAGG TATCATCAACAGTTCTGCGAGTTTTGC cTYLCV-TSWV-Ri-1 GCAAAACTCGCAGAACTGTTGATGATA TSWV-CP-Ri-1 TTGCCATAATGCTAGGAGGT Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa gen đa đoạn kháng virus Kỹ thuật Gateway (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) sử dụng để tạo cấu trúc hpiRNA Đầu tiên, phản ứng PCR nhân đoạn gen TCY CPi TSWV với cặp mồi đặc hiệu tương ứng TMV-CP-Fi-2/cTYLCVTSWV-Ri-1 cTYLCV-TSWV-Fi-1/TSWV- L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  CPi-Ri-1 nhờ sử dụng enzyme Pfu DNA polymerase (Fermentas) Sản phẩm phản ứng sau tinh sạch, làm khn cho phản ứng PCR ghép nối hai đoạn gen lại với với cặp mồi TMV-CP-Fi-2/TSWV-CPi-Ri-1 Đoạn gen ghép nối TCYS tiếp tục gắn vào vector tách dịng pENTRTM/D-TOPO®, sau đó, dịng hóa tế bào khả biến E.coli One Shot TOP 10 Các dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp dương tính ký hiệu pENTCYS ni, tách chiết thu nhận plasmid Tiếp đó, phản ứng LR (LR phản ứng tái tổ hợp vị trí attL and attR xúc tác enzym LR Clonase™ II) thực vector cho pENTCYS có chứa vị trí tái tổ hợp attL vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) có chứa vị trí gắn kết attR Kết phản ứng LR tạo vector biểu thực vật nhị thể đặt tên pGWTCYS Vector mang cấu trúc hpiRNA với hai vị trí chèn đoạn gen đa đoạn TCYS đảo chiều ngăn cách đoạn intron điều khiển promoter 35S cauliflower mosaic virus Cấu trúc pGWTCYS dịng hóa tế bào E coli One Shot® TOP 10 cuối chuyển vào tế bào A tumefaciens phương pháp xung điện Tế bào ni cấy mơi trương LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc cho vector streptomycin 40mg/l, chloramphenicol 34 mg/l, kháng sinh chọn lọc vỉ khuẩn A.tumefaciens rifamycin 50 mg/l Những dịng khuẩn lạc dương tính nuôi , tách chiết plasmid để kiểm tra phản ứng cắt enzyme giới hạn XbaI HindIII Chuyển cấu trúc RNAi TCYS vào thuốc Cấu trúc RNAi TCYS chuyển vào giống thuốc Nicotiana tabacum K326 C91 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens theo phương pháp Topping có cải tiến (1998) [26] 61 Phân tích chuyển gen hệ T0 - PCR kiểm tra có mặt gen chuyển DNA tổng số tách chiết nhanh từ thuốc chuyển gen sau tuần nhà lưới Sử dụng cặp mồi TMV-CP-Fi2/TSWV-CP-Ri-1 để kiểm tra có mặt gen chuyển nhờ phản ứng PCR - Đánh giá tính kháng virus phương pháp lây nhiễm nhân tạo Mỗi dòng thuốc chuyển gen T0 nhân thành cây, trồng để lây nhiễm TMV CMV, để lây nhiễm TYLCV TSWV Các thuốc trồng nhà lưới đến cao khoảng 10-30cm tiến hành lây nhiễm virus TMV CMV theo phương pháp Herbers (1996) [27] Đối với việc đánh giá tính kháng TYLCV TSWV, phương pháp nhiễm bệnh qua môi giới sử dụng Những chuyển gen T0 trồng điều kiện nhà lưới chứa môi giới truyền bệnh bọ phấn (Bemisia tabaci) bọ trĩ (Stenchaetothrips biformis Bagnall) với mật độ cao, đồng thời với có mặt WT (cây không chuyển gen) nhiễm bệnh TYLCV TSWV WT không nhiễm bệnh Các dịng thuốc chuyển gen bố trí trồng thí nghiệm bên nhà lưới, WT nhiễm bệnh trồng Thường xuyên kiểm tra mật độ bọ phấn bọ trĩ nhà lưới thông qua việc quan sát đếm số lượng Triệu chứng bệnh quan sát sau 30-40 ngày Kết thảo luận 3.1 Thiết kế vector chuyển gen RNAi đa đoạn Thuốc trồng chịu thiệt hại nhiều lồi virus khác Với mục đích tạo thuốc có khả kháng đồng thời nhiều 62 L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  chèn đoạn gen TCYS theo chiều sense antisense ngăn cách đoạn intron, điều khiển promoter 35S (Hình 2) Dựa vào phản ứng cắt enzyme giới hạn XbaI HindIII, plasmid tái tổ hợp pGWTCYS (dòng khuẩn lạc hình 2D) lựa chọn để biến nạp vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens chủng CV58C1 loại virus gây hại với nhiều khu vực nước, nghiên cứu thiết kế đoạn gen đa đoạn chứa vùng trình tự gen chức có độ bảo thủ cao virus TMV, CMV, TSWV TYLCV Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế đặc hiệu đoạn gen đa đoạn virus có kích thước khoảng 1000 bp thu nhận (Hình 1) Đoạn gen gắn vào vector tách dịng pENTRTM/D-TOPO® xúc tác enzyme toposoimerase có vector Sản phẩm plasmid tái tổ hợp pENTCYS dịng hóa vào tế bào E.coli One Shot TOP 10 Những dòng dương tính thu nhận xác định trình tự đoạn gen đa đoạn Kết đọc trình tự cho thấy đoạn gen thu có kích thước 1000 bp, với trình tự dự tính 3.2 Tạo thuốc chuyển gen Với mục đích kiểm tra hiệu biểu vector thiết kế tạo thuốc kháng đồng thời nhiều virus, giống thuốc trồng phổ biến Việt Nam mẫn cảm với virus K326 C9-1 lựa chọn để chuyển cấu trúc RNAi TCYS thông qua A.tumefaciens Kỹ thuật Gateway gồm phản ứng LR BP xem phương pháp hiệu quả, nhanh nhạy nhằm gắn đoạn DNA vào hệ thống vector trao đổi đoạn gen hai hệ thống vector Trong nghiên cứu này, phản ứng LR thực thành cơng vector cho pENTCYS có chứa trình tự attL đầu đoạn gen TCYS vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) có chứa vị trí attR Kết phản ứng LR tạo vector nhị thể (pGWTCYS) mang cấu trúc RNAi với hai vị trí bp M1   TSWV‐CPi 500 bp Sau trình chuyển gen, tái sinh chọn lọc , có 36 dịng thuốc chuyển gen hệ T0 giống K326 30 dịng giống C9-1 sống sót mơi trường chọn lọc chuyển trồng nhà lưới để phân tích PCR đánh giá tính kháng virus 76/100 dịng cho kết PCR dương tính với gen chuyển TCYS (Hình 3) M2     TCY        bp 1500 1000 750 280 250 A  M2  TCYS       bp 1000 500 B C Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR ghép nối tạo đoạn gen đa đoạn TCYS A) Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi TSWV cặp mồi cTYLCV-TSWV-Fi-1 TSWV-CP-Ri-1; B), Sản phẩm PCR nhân đoạn TCY cặp mồi TMV-CP-Fi-2 cTYLCV-TSWV-Ri-1 C),Sản phẩm PCR ghép nối TCY CPi TSWV tạo đoạn gen đa đoạn TCYS M1, GeneRuler TM kb DNA ladder (Fermentas); M2, kb DNA ladder (Geneshun) L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  63 A B 112 nt 397 nt 101 nt C CACCGAAGTTGAAAATCAGGCGAACCCCACGACTGCCGAAACGTTAGACGCTA CTCGTAGAGTAGACGACGCAACGGTAGCCATAAGGAGCGCTATAAATAATTTA GTAGTAGAATTGATCAGAGGAACCGGATCTTATAATCGGAGCTCTTTCGAGAGC TCTTCTGGTTTGGTTTGGACCCGCATTCAAATTCGAGTTAATCCTCTGCCGAAATT TGATTCTACCGTGTGGGTGACAGTCCGTAAAGTTCCTGCCTCCTCGGACTTGTCC GTTGCCGCCATCTCTGCTATGTTCGCGGACGGAGCCTCACCGGTACTGGTTTATC AGTATGCTATGTCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTTCCACTCCCGCATCCA AGGTGCGTCGCCGGCTGAATTTCGACAGCCCGTATGTCAACCGTGCTGTTGCCC CCACTGTCCTC/TCAACTCTCCGTCTCCGAACAGGCCTCTTCTTGGCTATTCTGTG TTGCACTTTGATTGGTACCTGAGTACAATGGGCTGTTGAGGGTGACGAATTCTG CATtt/AGCTCCCTGAATGTTTGGATGGAAATGCGCTGACCTGGTTGGGGATACC AGGTCGAAGAATCTGTTATTCTGGCATTTGTATTTCCCTTCGAACTGGACAAGCA CGTGGAGATGAGGAGACCCATT/TATACATTGGTATTCATAAATACATCATATTC ATCTCCTATATTAATATCATCAACAGTTCTGCGAGTTTTGCCTGTTTTTTAACCCC AAACATTTCATAGAACTTGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCCATAGCAACACTT CCTTTAGCATTAGGATTGCTGGAACTAAGTATAGCAGCATACTCTTTCCCCTTCTT CACCTGATCTTCAGTCATTTCAAATGCTTTGCTTTTGCATCCTGATATATAGCCAA GACAACACTGATCATCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAAGAGGTAAGCTACC TCCTAGCATTATGGCAA 56 nt D bp M (-) bp 8116 8116 3394 3310 1543 1463 Hình A Sơ đồ cấu trúc đoạn RNAi TCYS: P35S, promoter 35S; attB1 attB2, vị trí tái tổ hợp phản ứng LR LB, left T-DNA border; RB, right T-DNA border; T35S, terminator 35S; CmR, gen kháng chloramphenicol Vị trí điểm cắt giới hạn enzyme XbaI HindIII B Cấu trúc đoạn gen đa đoạn TCYS C Trình tự đoạn gen đa đoạn TCYS: Màu đen trình tự đoạn gen TMV, màu đỏ trình tự đoạn gen CMV , màu xanh dương trình tự đoạn gen đa đoạn nhân tạo cTYLCV, màu tím trình tự đoạn gen TSWV trình tự in đậm gạch chân vị trí mồi D Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pGWTCYS enzyme XbaI HindIII: M, kb DNA ladder (Geneshun); - 4, Dòng khuẩn lạc - 4; (−), Đối chứng âm vector pK7GWIWG2(II) Các dòng chuyển gen đánh số theo thứ tự K1 đến K36 giống K326 C1C30 giống C9-1 Mỗi dòng nhân invitro thành cây, chia thành nhóm trồng nhà lưới khác Nhóm tiến hành kiểm tra tính kháng TMV CMV phương pháp lây nhiễm nhân tạo, thống kê nhiễm bệnh thông qua quan sát triệu chứng bệnh xuất sau lây nhiễm Nhóm lây nhiễm TYLCV TSWV nhờ môi giới truyền bệnh bọ phấn bọ trĩ bố trí nhà lưới Kết kiểm tra tính kháng với virus TMV CMV cho thấy, sau lần lây nhiễm nhân tạo có 26/36 dịng chuyển gen K326 17/30 dịng C9-1 chuyển gen kháng hoàn toàn với TMV CMV (hình 4) Ở nhà lưới thứ 2, kết lây nhiễm TYLCV TSWV cho thấy có 14/36 dịng K326 11/30 dịng C9-1 khơng biểu bệnh xoăn Các biểu bệnh có triệu chứng xoăn lá, xoăn ngọn, thấp lùn, khả sinh trưởng So sánh với dòng kháng virus TMV CMV thống kê 64 L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  thuốc Đây bước quan trọng việc tạo thuốc kháng đồng thời nhiều loại virus giúp giảm đáng kể thiệt hại bệnh virus gây trên, thu 11 dòng chuyển gen K326 dịng C9-1 đồng thời kháng TMV, CMV khơng biểu bệnh xoăn Kết cho thấy hoạt động hiệu vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi TCYS Hình Sản phẩm PCR kiểm tra thuốc T0 chuyển gen TCYS M: Thang chuẩn 1Kb, (+): Mẫu PCR từ plasmid, 1-:8: PCR T0 chuyển gen TCYS mồi TMV-CP-Fi-2 TSWV-CP-Ri-1 (-): mẫu đối chứng âm A B C Hình Hình ảnh dòng thuốc chuyển gen sau 40 ngày lây nhiễm A, Cây thuốc dòng K4 chuyển gen biểu bệnh khảm; B, Cây chuyển gen dịng K18 khơng biểu bệnh; C, Cây chuyển gen dòng K4 biểu bệnh xoăn L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  65 Bảng Kết chuyển cấu trúc RNAi TCYS vào thuốc hệ T0 Chuyển gen tái sinh Lây nhiễm nhân tạo TMV CMV Số Số cây không Tỷ lệ lây (%) biểu nhiễm bệnh Lây nhiễm TYLCV TSWV qua môi giới Số Số cây không Tỷ lệ lây (%) biểu nhiễm bệnh Số không biểu bệnh Giống Số mẫu x số lần Tổng số chồi tách Số chồi phát triển WT-K326 5x2 9±1,4 10 0 10 0 K326 50x2 131,5±4,9 18±1,4 36 26 72,2 36 14 38,9 11 WT-C9-1 5x2 7±1,41 10 0 10 0 C9-1 50x2 87,5±3,5 15±2,8 30 17 56,7 30 11 36,7 Ghi chú: WT-K326, WT-C9-1: Cây thuốc không chuyển gen giống K326 C9-1 Kết luận Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi đa đoạn TCYS chứa gen chức không đủ loại virus TMV, CMV, TYLCV TSWV thiết kế chuyển thành công vào giống thuốc K326 C9-1 Phân tích tính kháng virus TMV, CMV, TYLCV TSWV 66 dòng thuốc chuyển gen giống K326 C9-1 hệ T0 thu 20 dòng (gồm 11 dòng K326 dịng C9-1) khơng có biểu bệnh virus gây Lời cảm ơn Nghiên cứu thực hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo giống thuốc kháng bệnh khảm xoăn đọt kĩ thuật chuyển gen” Tập thể tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học hỗ trợ thực nghiên cứu Tài liệu tham khảo [1] Vũ Triệu Mân, Giáo trình bệnh chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật, NXB Nông Nghiệp, 2007 [2] Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB, Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA, Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998) 13959-13964 [3] Di Nicola Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus, Transgenic Res 14 (2005) 989-994 [4] Lennefors BL, Savenkov EI, Bensefelt J, Wremerth-Weich E, van Roggen P, Tuvesson S, Valkonen JPT and Gielen J dsRNA-mediated resistance to Beet necrotic yellow vein virus infections in sugar beet (Beta vulgaris L ssp vulgaris), Mol Breed 18 (2006) 313-325 [5] Abhary MK, Anfoka GH, Nakhla MK, Maxwell DP, Post-transcriptional gene silencing in controlling viruses of the Tomato yellow leaf curl virus complex, Arch Virol 151 (2006) 2349-2363 [6] Hamilton JH, Baulcombe DC, A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants, Science 286 (1999) 950-952 [7] Baulcombe D, RNA silencing, Trends Biochem Sci 30 (2005) 290-293 66 L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  [8] Helliwell CA, Waterhouse PM, Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants, Methods 30 (2003) 289-295 [9] Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM, Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs, Nature 407 (2000) 319-320 [10] Goelet P, Lomonossoff GP, Butler PJ, Akam ME, Gait MJ, Karn J, Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA, Proc Natl Acad Sci USA 79 (19) (1982) 5818-5822 [11] Callaway A, Giesman-Cookmeyer D, Gillok ET, Sit TL, Lommel SA, The multifunctional capsid proteins of plant RNA virus, Annu Rev Phytopathol 39 (2001) 419-460 [12] Edwardson JR, Christie RG, CRC Handbook of viruses infecting legumes CRC press, Boca Raton, Fla, Cucumoviruses (1991) 293-319 [13] Roossinck M, Cucumber mosaic virus, amodel for RNA virus evolution, Mol Plant Pathol (2001) 59-63 [14] Chappel TM, Beaudoin AL, Kennedy GG, Interacting virus abundance and transmission intensity underlie tomato spotted wilt virus incidence: an example weather-based model for cultivated tobacco, PLoS One 8(8) (2013) e73321 [15] Srinivasan B, Riley D, Diffie S, Shrestha A, Culbreath A, Winter Weeds as Inoculum Sources of Tomato Spotted Wilt Virus and as Reservoirs for Its Vector, Frankliniella fusca (Thysanoptera:Thripidae) in Farmscapes of Georgia, Environ Entomol 43(2) (2014) 410420 [16] Píco B, Díez MJ, Nuez F, Viral diseaes causing the greastest economic losses to the tomato crop “The Tomato yellow leaf curl virus”- a review, Sci Hortic 67 (1996) 151-196 [17] Chowda RV, Colvin J, Muniyapa V, Seal S, Diversity and distribution of begomoviruses infecting tomato in India, Arch Virol 150 (2005) 845-867 [18] Ha C, Coombs S, Revill P, Harding R, Vu M, Dale J, Molecular characterization of Begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] Geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation, J Gen Virol 89 (2008) 313-326 Idris AM, Brown JK, Evidence for interspecificrecombination for three monopartite begomoviral genomes assosiated with the tomato leaf curl disease from central Sudan, Arch Virol 150 (2005) 1003-1012 Kormelink R, de Haan P, Peters D, Goldbach R, Viral RNA synthesis in tomato spotted wilt virusinfected Nicotiana rustica plants, Journal of General Virology (73) (1992) 687-693 Takeda A, Sugiyama K, Nagano H, Mori M, Kaido M, Mise K, Tsuda S, Okuno T, Identification of a novel RNA suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus, FEBS Letters 532 (2002) 75-79 Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus kỹ thuật RNAi Hội nghị Quốc gia Sinh vật biến đổi gen Quản lý an toàn sinh học Hà Nội, 28/08/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ (2009) 19-28 Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình, Cây thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2) (2009) 241-249 Nguyễn Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình, Tạo dịng cà chua PT18 kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật RNAi, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 9(3) (2011) 333-340 Karimi M, Inzé D, Depicker A, GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation, Trends Plant Sci 7(2002) 193-195 Topping JF, Tobacco transformation In Foster GD, Taylor SC (ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance, vol 81 Humana Press, Totowa, NJ (1998) 365-485 Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, Sonnowald U, Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase: possible hexose sensing in the secretory pathway, Plant Cell (1996) 793-803 L.T Thủy nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 58-67  67 Multi-fragment Transgenic Nicotiana tabacum Plants Exhibit Broad Spectrum Resistance to Multiple Viruses (TMV, CMV, TYLCV and TSWV) Based on RNAi Lê Thị Thủy1, Nguyễn Thị Thu Hiền2, Phạm Thị Vân2, Chu Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn2 Hanoi National University of Education, 136 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hanoi, Vietnam Institute of Biotechnology, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hanoi, Vietnam Abstract: RNA interference (RNAi) is a widely used method to develope broad spectrum viral resistance in transgenic tobacco plants in order to significantly reduces yield losses caused by viruses Therefore, in this study we have designed pGWTCYS binary vector carrying RNAi construct with inverted repeat multi-fragment TCYS flanked by an intron.This multi-fragment TCYS carries partially functional genes of four harmful tobacco viruses in Vietnam which are TMV (Tobacco mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus), TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) and TSWV (Tomato spotted wilt virus) This construct had been transformed into Nicotiana tabacum K326 and C9-1 via Agrobacterium tumefaciens After regeneration and selection procedure, 66 transgenic tobacco lines growing well on selective media were obtained (36 of K326 and 30 of C9-1 transgenic tobacco lines) PCR analysis showed that all the lines were positive with TCYS transgene The resistant valuation to all studied viruses of T0 transgenic tobacco lines revealed that 20/66 lines did not show pathological expression after virual infection Keywords: Cucumber mosaic virus, Tobacco mosaic virus, Tomato yellow leaf curl virus, Tomato spotted wilt virus, tobacco, RNA interference  ... B Cấu trúc đoạn gen đa đoạn TCYS C Trình tự đoạn gen đa đoạn TCYS: Màu đen trình tự đoạn gen TMV, màu đỏ trình tự đoạn gen CMV , màu xanh dương trình tự đoạn gen đa đoạn nhân tạo cTYLCV, màu... dụng công nghệ này, cấu trúc RNAi đa đoạn mang đoạn gen chức không đầy đủ virus TMV, CMV, TSWV TYLCV lặp lại đảo chiều thiết kế nhằm tạo trồng chuyển gen có tính kháng virus 60 L.T Thủy nnk / Tạp... WT-C9-1: Cây thuốc không chuyển gen giống K326 C9-1 Kết luận Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi đa đoạn TCYS chứa gen chức không đủ loại virus TMV, CMV, TYLCV TSWV thiết kế chuyển thành công vào