Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 97-103 Bước đầu nghiên cứu ứng dụng DNA tự thai máu mẹ (cffDNA) xét nghiệm trước sinh không xâm lấn bệnh β-thalassemia Trịnh Văn Bờ Em1, Nguyễn Vạn Thông2, Nguyễn Thị Thanh Kiều3, Đỗ Thị Thu Hằng3,* Bệnh viện Huyện Bình Chánh, E9/5 Nguyễn Hữu Trí, Bình Chánh, TP.HCM, Việt Nam Khoa Di truyền, Bệnh viện Hùng Vương, 28 Hồng Bàng, Quận 5, TP.HCM, Việt Nam Khoa Y, ĐHQG-HCM, Phường Linh Trung, Thủ Đức, TP.HCM, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 04 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: β-thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây đột biến gen β-globin Bệnh gây ảnh hưởng nặng nề đến phát triển thể chất tâm thần trẻ nhỏ, tăng gánh nặng chăm sóc điều trị cho gia đình xã hội Chính thế, việc tầm sốt sớm bệnh β-thalassemia nhằm kiểm soát gia tăng cộng đồng trọng Hiện nay, để phát sớm bệnh thai nhi ngồi phương pháp xâm lấn truyền thống chọc ối sinh thiết gai nhau, ứng dụng DNA tự thai máu mẹ (cffDNA) để chẩn đoán tiền sản không xâm lấn hướng mới, an toàn hiệu Trong nghiên cứu này, tách chiết làm giàu tỉ lệ cffDNA máu mẹ, đồng thời tối ưu hóa quy trình AS-PCR phát đột biến phổ biến CD17, CD26 CD41/42 Bước đầu áp dụng lên 10 mẫu cffDNA để chẩn đoán di truyền đột biến từ bố sang thai nhi cho kết 10/10 mẫu so với kết chọc ối Từ khóa: β-thalassemia, chẩn đốn trước sinh không xâm lấn, DNA tự thai, Alelle-specific PCR Đặt vấn đề thọ tan máu biến chứng Đặc biệt việc điều trị khó khăn tốn kém, hiệu quả, tỉ lệ tử vong cao năm đầu sống Vì vậy, việc phịng bệnh đặt giải pháp nhằm ngăn chặn lan tràn bệnh di truyền Từ trước năm 1990, chẩn đoán trước sinh sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử thường cần tế bào thai nhi lấy chọc ối, sinh thiết gai nhau, Nhưng kỹ thuật xâm lấn có nguy rủi ro cho mẹ thai nhiễm trùng ối, chảy máu tử cung nặng gây sẩy thai, Trong số trường hợp, cặp vợ chồng chẩn đoán mang gen bệnh β-thalassemia khuyến cáo thực Thalassemia bệnh di truyền đơn gen phổ biến phân bố rộng khắp khu vực giới Dựa loại gen globin bị ảnh hưởng mà bệnh thalassemia phân thành loại -thalassemia gen globin alpha bị đột biến -thalassemia gen globin beta bị đột biến [1] Trẻ mắc β-thalassemia thể nặng gây hậu nghiêm trọng phát triển thể, tuổi _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-1634009659 Email: hangdo009@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4546 97 98 T.V.B Em nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 97-103 kỹ thuật xâm lấn nhằm kiểm tra di truyền cho thai Rõ ràng 75% thai kỳ khơng có nguy bị bệnh phải trải qua thủ thuật xâm lấn với nguy biến chứng nguy hiểm [2] Do đó, cần có kỹ thuật chẩn đốn trước sinh khơng xâm lấn, đơn giản an tồn để tầm sốt trường hợp thai kỳ có nguy mắc bệnh β-thalassemia Với việc phát tồn DNA thai nhi lưu hành tự máu mẹ hay cffDNA (cell-free fetal DNA) có nguồn gốc từ ni phơi (trophoplasts), nghiên cứu cffDNA khảo sát lần đầu sớm tuần thứ số tuần thứ Lượng cffDNA tăng theo thai kỳ, giảm nhanh sau sinh phát khoảng sau sinh Người ta ước tính cffDNA chiếm khoảng 2-20% DNA tự tổng số máu mẹ (cell-free DNA hay cfDNA) [2, 3] Theo số nghiên cứu, kích thước trung bình cffDNA A), IVSI-5(G>C), FR8/9(+G), CD44(-C), với tỉ lệ thành công 100% [8] Tương tự, Chen cộng sử dụng AS-PCR cho SNPs kết hợp làm giàu qua gel để phát di truyền đột biến CD41/42, IVS1-5 IVSII-654 từ bố mẹ sang thai nhi đạt kết xác 8/8 mẫu [7] Mới đây, năm 2016, nghiên cứu Silvia Galbiati cộng công bố thành công việc áp dụng kỹ thuật full COLD-PCR (coamplification at lower denaturation temperature-PCR) microarray để phát đột biến β-thalassemia di truyền từ bố sang 75 mẫu thai phụ [9] Bên cạnh đó, NGS phương pháp chẩn đoán NIPT nghiên cứu ứng dụng rộng rãi giới, Việt Nam chưa phát triển Một nghiên cứu gần áp dụng NGS để phát đột biến 28(A>G), CD17(A>T), CD41/42(-TTCT) IVSII-654(C>T) di truyền từ bố 83 thai phụ người Ðông Nam Á, nghiên cứu báo cáo độ xác 96.5%, độ nhạy 100% đặc hiệu 92.1%, với kết dương tính giả [10] So với phương pháp khác NGS hay microarray, phương pháp AS-PCR hay realtime AS-PCR có ưu điểm tốn dễ dàng thiết kế cho phịng thí nghiệm Việt Nam Tuy nhiên, việc thực bước làm giàu qua gel thực phương pháp đòi hòi tỉ mỉ cao thao tác để tránh nguy ngoại nhiễm 4.2 Khuyến nghị Nghiên cứu thực số lượng mẫu hạn chế (10 mẫu), cần mở rộng nghiên cứu số lượng mẫu lớn để khẳng định tính ổn định quy trình tính độ nhạy, độ đặc hiệu Ngồi ra, chúng tơi tập trung vào đột biến CD17, CD26 CD41/42 vào trường hợp đột biến thai phụ chồng khác Cần nghiên cứu mở rộng đột biến khác gây bệnh β-thalassemia Việt Nam cần mở rộng nghiên cứu cho trường hợp đột biến thai phụ chồng giống Xa nữa, cần đánh giá, so sánh hiệu phương pháp AS-PCR với phương pháp khác mở rộng nghiên cứu bệnh di truyền đơn gen khác Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) khuôn khổ Đề tài mã số C2017-44-01 T.V.B Em nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 97-103 Tài liệu tham khảo [1] Nguyễn Khắc Hân Hoan, Nghiên cứu tầm soát chẩn đoán trước sinh bệnh alpha bêta thalassemia, Luận án tiến sĩ Đại Học Y Dược TPHCM, (2013) [2] Stumm M, Wegner R-D, Hofmann W., Cell-free fetal DNA in maternal blood: new possibilities in prenatal diagnostics, Laboratoriumsmedizin, (2012), 36(5) [3] Sekizawa K., YokokawaY., SugitoY., IwasakiM., YukimotoY., Ichizuka K., Saito H.,, Okai T., Evaluation of bidirectional transfer of plasma DNA through placenta, Hum Genet, (2003), 113(4): 307-310 [4] Chan K.C., Zhang J., Hui A.B., Wong N., Lau T.K., Leung T.N., Lo K.W., Huang D.W., Lo Y.M., Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma, Clin Chem, (2004), 50(1): 88-92 [5] Lun F.M., Tsui N.B., Chan K.C., Leung T.Y., Lau T.K., Charoenkwan P., Chow K.C., Lo W.Y., Wanapirak C., Sanguansermsri T., Cantor C.R., Chiu R.W., Lo Y.M Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma Proc Natl Acad Sci, (2008); 105(50): 19920-19925 [6] Li Y., Di Naro E., Vitucci A., Zimmermann B., Holzgreve W., Hahn S., Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia using size-fractionated cell-freeDNA in maternal plasma, JAMA, (2005), 293(7): 843-849 103 [7] Chen J.J., Tan J.A., Chua K.H., Tan P.C., George E., Non-invasive prenatal diagnosis using fetal DNA in maternal plasma: a preliminary study for identification of paternally-inherited alleles using single nucleotide polymorphisms, BMJ Open, (2015), 5(7): e007648 [8] Ramezanzadeh M., Salehi M., Farajzadegan Z., Kamali S., Salehi R., Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia in maternal plasma using simple fetal DNA enrichment protocol with or without whole genome amplification: an accuracy assessment, J Matern Fetal Neonatal Med, (2016), 29(16): 2645-2649 [9] Galbiati S., Monguzzi A., Damin F., Soriani N., Passiu M., Castellani C., Natacci F., Curcio C., Seia M., Lalatta F., Chiari M., Ferrari M., Cremonesi L., COLD-PCR and microarray: two independent highly sensitive approaches allowing the identification of fetal paternally inherited mutations in maternal plasma, J Med Genet, (2016), 53(7): 481-487 [10] Xiong L., Barrett A.N., Hua R., Tan T.Z., Ho S.S., Chan J.K., Zhong M., Choolani M Non-invasive prenatal diagnostic testing for beta-thalassaemia using cell-free fetal DNA and next generation sequencing, Prenat Diagn, số (2015), 35(3): 258-265 [11] Little S., Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) analysis of point mutations Curr Protoc Hum Genet, (2001), Chapter 9:Unit 9.8 Primary Study on Application of Cell-free Fetal DNA (cffDNA) in Non-invasive Prenatal Testing of β-thalassemia Trinh Van Bo Em1, Nguyen Van Thong2, Nguyen Thi Thanh Kieu3, Do Thi Thu Hang3 Binh Chanh Hospital, E9/5 Nguyen Huu Tri Street, Binh Chanh District, Ho Chi Minh City, Vietnam Department of Genetics, Hung Vuong Hospital, 28 Hong Bang Street, District 5, Ho Chi Minh City, Vietnam School of Medicine-VNU-HCMC, Linh Trung Ward, Thu Duc District, Ho Chi Minh City, Vietnam Abstract: β-thalassemia is a common autosomal recessive disorders, caused by mutations in the β-globin gene It severely influences the physical and mental development of affected children and place an immense burden of care and treatment on the family and society Therefore, the prenatal screening of β-thalassemia to control its increase in the community is anessential part of preventive genetics Currently, besides traditional prenatal diagnostic tests that requires invasive sampling techniques such as amniocentesis or chorionic villous sampling (CVS), the use of cffDNA for non-invasive prenatal testing of β-thalassemia is a new, safer, and more effective direction In this study, we extracted and enriched the percent of cffDNA in the maternal peripheral blood as well as optimized AS-PCR to detect three most common β-thalassemia mutations CD17, CD26, and CD41/42 Presence or absence of the paternal mutant allele was then correctly determined in all of 10 cases compared to fetal genotyping that determined with amniocentesis Keywords: β-thalassemia, non-invasive prenatal diagnosis, cell-free fetal DNA, Alelle-specific PCR ... ứng dụng cffDNA chẩn đốn tiền sản khơng xâm lấn cịn hạn chế, đặc biệt nhóm bệnh đơn gen thalassemia Trong nghiên cứu này, bước đầu nghiên cứu ứng dụng cffDNA xét nghiệm trước sinh không xâm lấn. .. sau sinh Người ta ước tính cffDNA chiếm khoảng 2-20% DNA tự tổng số máu mẹ (cell-free DNA hay cfDNA) [2, 3] Theo số nghiên cứu, kích thước trung bình cffDNA