Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 242-247 Bước đầu nghiên cứu đáp ứng thụ thể Constitutive Androstane với dịch chiết Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) Hoàng Thị Trang1, Hoàng Thị Phương1, Phạm Thị Thu Hường2, Mai Châu Phương3, Đẩu Bảo Ngọc3, Trần Tiến Thịnh3, Phạm Thị Dậu1,* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Trường Trung học Phổ thông Chuyên Lam Sơn, 88 Hàn Thuyên, Thanh Hóa Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Đái tháo đường/tiểu đường nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa với biến chứng nguy hiểm, mối lo toàn xã hội Bên cạnh phương pháp điều trị insulin, dược lý liệu pháp ăn kiêng, dân gian từ lâu biết sử dụng số loài để hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) biết đến thuốc quý hỗ trợ điều trị tiểu đường, điều hòa huyết áp giảm mỡ máu, sử dụng dạng trà viên nén Một số nghiên cứu gần cho thấy thụ thể tế bào Constitutive Androstane (CAR) có khả đáp ứng với nhiều phân tử ngoại lai, có vai trò quan trọng việc cải thiện bệnh tiểu đường béo phì Do đó, nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu đáp ứng CAR với dịch chiết giảo cổ lam làm sở để nghiên cứu vai trò CAR cải thiện bệnh tiểu đường dịch chiết Kết ban đầu cho thấy, biểu CAR gen đích CYP2B6 tế bào HepG2 tăng cường khoảng 9,8 3,8 lần xử lý với dịch chiết giảo cổ lam (1µg/ml) Từ khóa: Đái tháo đường/tiểu đường, Giảo cổ lam, thụ thể Constitutive Androstane (CAR) Giới thiệu tăng với tốc độ ngày cao, thực trở thành mối đe dọa với sức khỏe cộng đồng Hiện nay, bên cạnh phương pháp điều trị tiểu đường như: điều trị insulin, dược lý liệu pháp ăn kiêng, việc sử dụng thuốc giảo cổ lam hỗ trợ điều trị tiểu đường quan tâm Hiệu can thiệp giảo cổ lam điều trị tiểu đường chứng minh thông qua việc làm giảm lượng đường máu bệnh nhân chuột bị tiểu đường [2] Tuy nhiên, tác dụng dược liệu bệnh tiểu đường mức độ phân Đái tháo đường/tiểu đường nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa với biến chứng nguy hiểm như: bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, nguyên nhân gây tử vong người bệnh [1] Những năm gần đây, số người mắc bệnh tiểu đường gia _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-904237881 Email: phamthidau1204@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4591 242 H.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 242-247 tử chưa quan tâm Thụ thể Constitutive Androstane (CAR) thành viên liên họ thụ thể nhân tế bào (CAR, NR1I3), yếu tố phiên mã trình chuyển hóa chất ngoại lai (xenobiotics) phân tử nội sinh tế bào (endogenous) Một số nghiên cứu gần cho thấy CAR có vai trò quan trọng việc cải thiện bệnh tiểu đường béo phì chuột [3] Do đó, nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu đáp ứng CAR tế bào người với dịch chiết giảo cổ lam làm tiền đề nghiên cứu vai trò CAR cải thiện bệnh tiểu đường người dịch chiết Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thu huyện Tân Lạc, tỉnh Hịa Bình chiết tổng số methanol 80% Dịch chiết tổng số giảo cổ lam (GCL) loại bỏ methanol hòa tan lại DMSO để thử nghiệm độc tính tế bào ung thư gan HepG2 tế bào phơi thận lành tính HEK293 có nguồn gốc từ người (ATCC, Manassas, Mỹ) Chất kiểm chứng dương, chất hoạt hóa CAR người (hCAR) [4] 6-(4-chlorophenyl) imidazo [2,1b] [1, 3] thiazole-5-carbaldehyde O-(3,4dichlorobenzyl) oxime (CITCO) chất kiểm chứng âm, chất ức chế hCAR [5] isoquinoline carboxamide (PK1119) (Sigma Aldrich, Mỹ) sử dụng nồng độ 1µM 2,5 µM 2.2 MTS assay Tế bào HepG2 HEK293 nuôi đĩa 96 giếng qua đêm sau ủ với CITCO, PK1119 GCL nồng độ định Sau 48 giờ, độc tính chất lên khả sinh trưởng tế bào đánh giá kít CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất 243 2.3 Real-time PCR RNA tổng số từ tế bào HepG2 HEK293 ủ với GCL nồng độ định tách dung dịch TRIzol (Life Technologies, Mỹ) Một lượng RNA (1µg) chuyển hố thành cDNA enzyme phiên mã ngược MLV-Reverse transcriptase (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Real-time PCR thực với 1µl cDNA mẫu máy ABI 7500 (Applied Biosystems, Mỹ) sử dụng tín hiệu SYBER Green (Thermo Scientific, Mỹ) Các cặp mồi gen CAR, CYP2B6 β-actin người [6-7] (IDT, Singapore) có trình tự sau: hCAR-F: 5’-TGGTACTGCAAGTCATCAAGT-3’ hCAR-R: 5′CTTCAATTGTGTAGCGAAGAG-3′; hCYP2B6-F: 5’AGACGCCTTCAATCCTGACC-3’ hCYP2B6-R: 5’CCTTCACCAAGACAAATCCGC-3’; hactin-F: 5’-TGACCCAGATCATGTTTGAGA3’ hβ-actinR: 5’TACGGCCAGAGGCGTACAGC-3’ 2.4 Western Bloting Các tế bào HepG2 HEK293 (2x105 tế bào/ml) nuôi đĩa giếng qua đêm, ủ với GCL nồng độ xác định Sau 24 giờ, tế bào thu tách protein tổng số đệm RIPA (Thermor scientific) Mẫu xử lý với đệm Leaming 5X điện di gel SDS-PAGE 10%, sau chuyển lên màng Hybond-P (GE Health Sciences, Mỹ) Protein màng ủ với kháng thể đặc hiệu kháng hCAR h-actin (Cell Signaling, Mỹ) Phức hợp kháng nguyên kháng thể phát kháng thể thứ cấp tương ứng có gắn HRP (horseradish peroxidase-conjugated antibody) Băng tín hiệu nhận diện dung dịch Chemiluminescence (GE Health Sciences, Mỹ) 2.5 Phân tích số liệu Số liệu xử lý thống kê phần mềm Excel GraphPrism 244 H.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 242-247 Kết thảo luận 3.1 Độc tính dịch chiết giảo cổ lam Độc tính GCL tế bào HepG2 tế bào HEK293 sau 48 thử nghiệm phương pháp MTS nhằm định hướng nồng độ dịch chiết GCL thí nghiệm xác định ảnh hưởng tới CAR dòng tế bào Khả sống sót tế bào giá trị IC50 dịch chiết GCL thể Bảng Hình Bảng Giá trị IC50 dịch chiết GCL dòng tế bào HepG2 HEK293 Nồng độ GCL (g/ml) 640 320 160 80 40 20 10 Khả sống sót tế bào ± SEM (%) HepG2 HEK293 1,15 ± 0,57 0,04 ± 0,04 80,41 ± 2,02 33,00 ± 0,19 90,47 ± 6,55 78,02 ± 0,41 94,32 ± 2,02 81,77 ± 0,36 94,45 ± 2,63 84,03 ± 8,99 96,09 ± 2,05 84,70 ± 2,88 99,26 ± 1,61 91,38 ± 9,98 Kết cho thấy, tỉ lệ sống tế bào HepG2 không bị ảnh hưởng nồng độ 10g/ml Tỉ lệ giảm không đáng kể (từ 5-10%) nồng độ GCL tăng từ 20-160gl/ml Tỉ lệ tiếp tục giảm tới 20% nồng độ 320gl/ml giảm đột ngột tới 1,15% nồng độ 640g/ml Trong đó, tỉ lệ sống tế bào HEK293 giảm khoảng 10% xử lý với GCL nồng độ 10g/ml Tỉ lệ tiếp tục giảm từ 15-20% xử lý với GCL nồng độ từ 20-160gl/ml Tỉ lệ giảm mạnh tới 67% nồng độ GCL 320gl/ml giảm gần hoàn toàn (0%) nồng độ 640g/ml Giá trị IC50 tế bào HEK293 (228,9 g/ml) thấp khoảng 1,6 lần so với dòng tế bào HepG2 (378,7g/ml) chứng tỏ tế bào HEK293 nhạy cảm với dịch chiết GCL so với tế bào HepG2 Kết phù hợp với kết sàng lọc độc tính số hợp chất số dòng tế bào, thể tế bào HEK293 thường nhạy cảm với chất so với tế bào HepG2 [8] Kết sở cho việc thiết kế nồng độ GCL để kích thích biểu CAR dịng tế bào cho thí nghiệm IC50 (g/ml) HepG2 HEK293 378,7 228,9 Hình Đường cong đáp ứng tế bào với dịch chiết GCL 3.2 Đáp ứng gen CAR với dịch chiết giảo cổ lam Để đánh giá khả đáp ứng CAR với GCL, mức độ biểu mRNA protein CAR sau ủ với GCL chất kiểm H.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 242-247 chứng hai dòng tế bào HepG2 HEK293 thực Trong đó, tế bào HepG2 sử dụng tế bào đích với biểu CAR cao tế bào HEK293 sử dụng tế bào đối chứng với biểu CAR thấp Mức độ biểu mRNA CAR kiểm tra kĩ thuật qRT-PCR (Hình 2) Như mong đợi, biểu mARN CAR dòng tế bào HepG2 cao so với dòng tế bào HEK293 khoảng từ 1,2-2,1 lần (p