Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học T nh n v C n n h T p 33 S 1S (2017) 231-236 Phân l p v tuyển chọn v khuẩn từ vùn rễ trồn có khả năn khán phổ rộn nấm ây b nh th c v t N uyễn Thị Hồn Phạm Đức N ọc2,* Viện Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ cao Đông Dương, Số M6B Bắc Linh Đàm, Hà Nội, Việt Nam Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nh n n y 16 thán năm 2017 Chỉnh sửa n y 20 thán năm 2017; Chấp nh n đăn n y 10 thán 10 năm 2017 Tóm tắt: Sản xuất n n n h p h n bị ảnh hưởn n h m trọn bở v s nh v t ây b nh tron có v nấm V c sử dụn hóa chất để d t nấm gây b nh th c v t ảnh hưởn t u c c đến chất lượn n n sản v ây m trườn B n pháp k ểm soát s nh học sử dụn chế phẩm v s nh v t ch n nấm l tron nhữn ưu t n h n đầu tron sản xuất sản phẩm n n n h p an to n h n Tron n h n cứu n y 254 v khuẩn phân l p từ vùn rễ trồn tron 11 có đặc tính đ khán ch n lạ nh ều lo nấm ây b nh ồm Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Sclerotium hydrophila, Neoscytalidium dimidiatum, Aspergillus flavus Aspergillus niger Các n y định danh l Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens Burkholderia vietnamienis bằn ả trình t en 16S rRNA Các thuộc ch Bacillus có khả năn s nh enzyme n oạ b o mạnh để phân ả chất t nh bột case n ch t n có tron m trườn Các v khuẩn thu tron n h n cứu n y sử dụn để bổ sun v o chế phẩm v s nh phân bón hữu nhằm thay thu c bảo v th c v t hóa học óp phần bảo v m trườn v nân cao chất lượn sản phẩm n n n h p Từ khóa: Bacillus subtilis, Burkholderia vietnamienis v khuẩn đ khán v nấm ây b nh th c v t Đặt vấn đề vụ thu hoạch trồn quan trọn t u c ph lon c chua [1]… Sử dụn thu c hóa học h u cao tron phòn ch n nấm nhưn lạ ây nh ễm m trườn n h m trọn v ảnh hưởn xấu đến sức khỏe n ườ Sử dụn chế phẩm v s nh chứa v s nh v t đ khán để ch n lạ nấm ây b nh đan l ưu t n h n đầu tron sản xuất sản phẩm n n n h p hữu [2] Do v c tuyển chọn v khuẩn từ vùn rễ trồn vớ khả năn đ khán phổ rộn nấm ây b nh th c v t để phục vụ sản xuất chế phẩm B nh hạ trồn h n năm ây th t hạ lớn cho sản xuất v bảo quản n n sản tron tác nhân l v nấm Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Sclerotium hydrophila, Neoscytalidium dimidiatum, Aspergillus flavus ữ va trò chủ ch t Các lồi nấm n y phá hủy phần to n _ Tác ả l n h ĐT.: 84-24-38588856 Email: ngoc46a@yahoo.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4573 231 232 N.T Hồng, P.Đ Ngọc / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, T p 33, Số 1S (2017) 231-236 v s nh bảo v th c v t có ý n hĩa khoa học v th c t ễn Đối tượng phương pháp nghiên cứu để cấy v khuẩn phân l p cách nấm khoản cách tươn đươn Sau n y kết đ khán vớ từn lo nấm xác định d a v o khoản cách hình th nh từ mép h sợ nấm tớ khuẩn lạc v khuẩn [3] 2.2.3 Định danh chủng vi khuẩn 2.1 Đối tượng Các nấm F oxysporum, P capsici, S hydrophila, A flavus, A niger TS Trần Văn Tuấn Phòn Genom c thuộc Phịn thí n h m Trọn đ ểm C n n h Enzym v Prote n Trườn Đạ học Khoa học T nh n ĐHQGHN cun cấp Nấm ây b nh đ m nâu lon Neoscytalidium dimidiatum G áo sư Phạm Văn Ty cun cấp v định danh bở nhóm n h n cứu TS Trần Văn Tuấn Các v khuẩn phân l p tron n h n cứu n y dạn kh ết bảo quản tron lycerol -30oC sau kh l m đ n tron n tơ lỏn 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân l p vi khuẩn vùng rễ Cân mẫu đất thu từ vùn rễ cho v o ml nước cất v trùn mẫu trộn bằn máy vortex để thu mẫu đồn Pha loãn mẫu bằn nước cất khử trùn nồn độ khác Cấy trả mẫu nồn độ n y môi trườn LB để thu nhữn khuẩn lạc r n rẽ Các khuẩn lạc có hình dạn m u sắc khác tách r n kh ết v ữ tron n n h m để sử dụn cho thí n h m t ếp theo [3] 2.2.2 Xác định hoạt tính đối kháng Để tuyển chọn v khuẩn có khả năn đ khán nấm ây b nh th c v t mỗ nấm n y tuổ cấy vị trí trun tâm đĩa m trườn PDA sau dùn que cấy v trùn Các v khuẩn phân l p được quan sát hình thá tế b o nhuộm Gram v nhuộm nộ b o tử [4] Sau th c h n ả trình t en 16S rRNA: ADN h en tách ch ết en 16S rRNA khuếch đạ bằn PCR v t nh bằn k t thươn mạ hãn Prome a Sản phẩm PCR sau t nh đ ả trình t tạ S n apore Các trình t en 16S rRNA sau so sánh vớ n ân h n l u GenBank sử dụn c n cụ BLAST 2.2.4 Xác định khả sinh enzym ngoại bào chủng vi khuẩn Khả năn s nh enzyme n oạ b o ồm amylase cellulase protease ch t nase thử theo phươn pháp khuếch tán tr n thạch chứa 1% chất tươn ứn l t nh bột tan CMC casein chitin [5] Kết thảo luận 3.1 Phân l p xác định khả đối kháng nấm bệnh trồng chủng vi khuẩn Từ mẫu đất khác 254 v khuẩn phân l p tr n m trườn LB Để tuyển chọn v khuẩn có hoạt tính khán nấm cao chún t t ến h nh k ểm tra hoạt tính khán nấm bằn phươn pháp đồn nu cấy Kết thu 11 có hoạt tính khán mạnh nh ều lo nấm ây b nh th c v t (Bản 1) Bản Các v khuẩn có hoạt tính khán nấm phổ rộn Chủn BDB 1.1 BNK8 BNK2.3 P capsici +++ +++ +++ F oxysporum +++ +++ ++++ S hydrophila ++++ ++++ ++++ N dimidiatum ++++ ++++ ++++ A niger ++++ ++++ ++++ A flavus +++ +++ +++ N.T Hồng, P.Đ Ngọc / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 1S (2017) 231-236 DH4.9 DH4.15 LU4.4 BNK 7.1 BRK4.5 H2.7 H3.5 DT3.5 + + + +++ +++ ++++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ Ghi chú: (-) kh n khán +++ +++ +++ +++ ++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ ++++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ 233 +++ +++ ++ +++ +++ +++ (+) khán yếu (++) khán trun bình (+++) khán mạnh (++++) khán mạnh BNK8 BNK4.5 BNK2.3 BNK7.1 F oxysporum DH4.9 DH4.15 BDB1.1 DT3.5 H3.5 BDB1.1 H3.5 H2.7 N dimidiatum LU 4.4 H2.7 A niger BDB1.1 LU 4.4 DT3.5 LU 4.4 P capsici DT3.5 H3.5 S hydrophila H2.7 A flavus Hình Khả năn khán nấm 11 v khuẩn đạ d n Các vớ khả năn kháng nấm mạnh phân l p từ đất vùn rễ nh ều loạ trồn khác đ u tươn lạc, lúa Kết Bản cho thấy 11 vi khuẩn tuyển chọn thể h n khả năn khán mạnh nấm N dimidiatum ây b nh đ m nâu long v nấm S hydrophila gây b nh tr n c chua Đặc b t có đến chủng khán lạ hai loài nấm ây hỏn n n sản sau thu hoạch A niger A flavus Các v khuẩn thu tron n h n cứu n y có t ềm năn ứn dụn v o bảo v trồn cũn n n sản sau thu hoạch 3.2 Định danh chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng nấm Cả 11 vớ hoạt tính khán nh ều nấm t ến h nh phân loạ đến lo d a v o đặc đ ểm hình thá v ả trình t en 16S rRNA Tron s 11 nhuộm Gram v quan sát kính h ển v có 10 chủng Gram dươn vớ tế b o dính thành chuỗ hình que có nộ b o tử Như v y sơ kết lu n 10 n y thuộc chi Bacillus Riêng LU4.4 l v khuẩn Gram âm tế b o hình que Để phân loạ xác đến lo trình t en 16S rRNA 11 ả trình t v so sánh độ tươn đồn vớ l u GenBank bằn c n cụ BLAST Kết thu trình bày Bản 234 N.T Hồng, P.Đ Ngọc / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, T p 33, Số 1S (2017) 231-236 Bản So sánh trình t Chủn BDB1.1 BNK8 BNK2.3 DH4.9 DH4.15 LU4.4 BNK7.1 BRK4.5 H2.7 H3.5 DT3.5 en 16S rRNA 11 đ Mức độ tươn đồn vớ l u GenBank 99% 100% 100% 100% 100% 99% 100% 100% 100% 99% 100% khán nấm b nh vớ l u GenBan Tên loài GenBank vớ mã s en tươn ứn Bacillus subtilis (KX608731.1) Bacillus subtilis (MF403067.1) Bacillus subtilis (GU122961.1) Bacillus amyloliquefaciens (KM117160.1) Bacillus amyloliquefaciens (KU922934.1) Burkholderia vietnamienis (AB568311.1) Bacillus amyloliquefaciens (MF171193.1) Bacillus subtilis (MF403067.1) Bacillus subtilis (MF073326.1) Bacillus amyloliquefaciens (KU922448.1) Bacillus amyloliquefaciens (KY886133.1) 25 20 15 10 Protease Cellulase Amylase Chitinase (A) (B) Hình (A) Khả năn phân ả chất khác 11 n h n cứu (đơn vị mm) (B) Khả năn s nh enzyme n oạ b o B subtilis BDB1.1: (a) Protease, (b) Cellulase, (c) Amylase, (d) Chitinase N.T Hồng, P.Đ Ngọc / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 1S (2017) 231-236 Hầu hết thuộc ch Bacillus, tron BDB1.1 BNK8 BNK2.3 BRK4.5 H2.7 thuộc lo Bacillus subtilis, DH4.9 DH4.15 BNK7.1 H3.5 DT3.5 thuộc lo Bacillus amyloliquefaciens Loài B subtilis có khả năn sản s nh nh ều enzyme n oạ b o amylase protease phytase s nh tổn hợp khán s nh ch n nấm kanosamine, lipopeptides (LP) Lồi B amyloliquefaciens có quan h d truyền ần ũ vớ B subtilis có khả năn s nh auxin, l chất có khả năn kích thích s kéo d rễ, thúc đẩy tăng trưởn trồn [6] Chủn LU4.4 l Gram âm sau kh phân tích trình t nh n thấy LU4.4 thuộc ch Burkholderia, ần ũ vớ lo Burkholderia vietnamienis vớ độ tươn đồn trình t gen 16S rRNA 99% Tron s c n b trước cho thấy B vietnamienis có khả năn c định n tơ giúp tăn năn suất tr n 20% trồn v s nh tổn hợp chất kích thích tăn trưởn th c v t IAA, NAA [7] 3.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào Các enzyme n oạ b o đón va trị quan trọn tron v c phân ả nh ều hợp chất cao phân tử th nh nhữn phân tử nhỏ úp dễ d n hấp thụ kích thích s nh trưởn [2] Vì v y khả năn phân ả nh ều chất khác l t u chí quan trọng kh chọn v khuẩn l m prob ot c cho th c v t Kết từ Bản cho thấy 10 Bacillus có khả năn s nh enzyme protease amylase cellulase v ch t nase đặc b t B subtilis BDB1.1 có khả năn phân ả mạnh nh ều chất Chủn LU 4.4 kh n có khả năn phân ả chất n o 235 Kết luận Đã phân l p 254 v khuẩn từ mẫu đất vùn rễ trồn v xác định 11 có hoạt tính khán nấm ây b nh th c v t Tron 10 l v khuẩn Gram dươn v Gram âm d a tr n kết nhuộm Gram Đã phân loạ đến lo 11 có hoạt tính khán nấm mạnh bằn ả trình t en 16S rRNA v so sánh vớ l u GenBank Đã khảo sát khả năn s nh enzyme n oạ b o ồm protease amylase ch t nase cellulase n h n cứu Tài liệu tham khảo [1] Webster., John., and Roland Weber., Introduction to fungi Cambridge University Press, (2007) [2] Avis., and Tyler J., Multifaceted beneficial effects of rhizosphere microorganisms on plant health and productivity, Soil Biology and Biochemistry 40.7 (2008) 1733-1740 [3] Petatán-Sagahón., Iván., Isolation of bacteria with antifungal activity against the phytopathogenic fungi Stenocarpella maydis and Stenocarpella macrospora, International journal of molecular sciences 12.9 (2011) 5522-5537 [4] Trần L nh Thước, Phươn pháp phân tích v s nh v t tron nước th c phẩm v mĩ phẩm, NXB Giáo dục, TP HCM (2010) [5] Phạm Văn Ty C n n h s nh học – c n n h v s nh v m trườn NXB G áo dục TP HCM 2006 [6] Trịnh Trun Th nh Đặc đ ểm s nh học v t ềm năn ứn dụn v khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1901 phân l p tạ Rừn Qu c a Ho n L n VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, (2013) 29(3) [7] Ly Ngoc Thanh Xuan, Isolation and characterization of rice endophytic bacteria in acid sulphate soil of Mekong Delta, Viet Nam, (2016) 236 N.T Hồng, P.Đ Ngọc / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 1S (2017) 231-236 Isolation and Characterization of Bacterial Strains Isolated from Crop Rhizosphere, which Exhibit Antagonistic Activity against Fungal Plant Pathogens Nguyen Thi Hong1, Pham Duc Ngoc2 Indochina Research Institute of Applied Advanced Technology, M6B Bac Linh Dam, Hanoi, Vietnam Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Abstract: Agricultural production is now severely affected by pathogenic microorganisms including molds The use of chemical fungicides for controlling plant pathogens has negatively influenced on the quality of agricultural products and the environment Currently, biological control using antifungal preparations is one of the top priorities in the production of safe agricultural products In this study, 254 bacterial strains were isolated from the plant rhizosphere, of which 11 isolates exhibited antagonistic properties against several fungal pathogens including Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Sclerotium hydrophila, Neoscytalidium dimidiatum, Aspergillus flavus and Aspergillus niger These bacterial strains were identified as Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens and Burkholderia vietnamienis by sequencing of 16S rRNA genes The Bacillus isolates are capable of producing extracellular enzymes to decompose starch, casein and chitin The strains obtained in this study could be used to supplement microbial preparations or organic fertilizers to replace pesticides, contribute to environmental protection and improve quality of agricultural products Keywords: Bacillus subtilis, Burkholderia vietnamienis, biocontrol, fungal plant pathogens ... Kết thảo luận 3.1 Phân l p xác định khả đối kháng nấm bệnh trồng chủng vi khuẩn Từ mẫu đất khác 254 v khuẩn phân l p tr n m trườn LB Để tuyển chọn v khuẩn có hoạt tính khán nấm cao chún t t ến... flavus Hình Khả năn khán nấm 11 v khuẩn đạ d n Các vớ khả năn kháng nấm mạnh phân l p từ đất vùn rễ nh ều loạ trồn khác đ u tươn lạc, lúa Kết Bản cho thấy 11 vi khuẩn tuyển chọn thể h n khả năn khán... subtilis BDB1.1 có khả năn phân ả mạnh nh ều chất Chủn LU 4.4 kh n có khả năn phân ả chất n o 235 Kết luận Đã phân l p 254 v khuẩn từ mẫu đất vùn rễ trồn v xác định 11 có hoạt tính khán nấm ây b nh