Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng phân giải độc tố cảu một số chủng microcystis phân lập ở hồ hoàn kiếm hà nội

đại học quốc gia hà nội VIệN VI SINH VậT Và CÔNG NGHệ sinh học -o0o - BO CO TI C BIT CP HQG đề tài nghiªn cøu khoa häc 2007-2008 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ HOÀN KIẾM, HÀ NI Mó s: QG.07.24 Chủ trì đề tài : Nguyễn Thị Hoài Hà Hà nội - 2008 BO CO TểM TẮT Tên đề tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học thăm dò khả phân giải độc tố số chủng Microcystis phân lập hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội Các thành viên tham gia đề tài Chủ trì đề tài - Họ tên: Nguyễn Thị Hoài Hà Các thành viên: Lƣu Thị Thùy Giang Nguyễn Quang Huy Lê Trung Thủy Phạm Thị Bích Đào Trần Thị Điệp Tóm tắt tổng quan đề tài Trong năm gần Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo theo ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành vùng lân cận Hồ Hoàn Kiếm địa danh tiếng thủ đô bị ô nhiễm Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn tới phát triển thƣờng xuyên khơng bình thƣờng vi khuẩn lam, làm biến đổi cấu trúc thành phần loài hệ vi tảo hồ Sự suy giảm số loài vi tảo đặc hữu đồng thời với gia tăng thành phần loài mật độ vi khuẩn lam gây độc hồ Hoàn Kiếm đƣợc cảnh báo gây nên lo ngại môi trƣờng cho khu hệ động thực vật sống hồ Trong số loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa Kutzing loài bị bắt gặp thƣờng xuyên phổ biến M.aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ peptid mạch vịng có tên gọi microcystin Microcystin chất ức chế enzyme protein phosphatases (nhóm PP1 PP2A) [30] Độc tố gây ảnh hƣởng xấu lên hai loại protein serine threonin phosphatases Đã có số báo chứng minh tƣợng nƣớc nở hoa vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật ngƣời Microcystin thƣờng tích luỹ nội quan tế bào dƣới dạng tự nƣớc Đã có khơng cơng trình nghiên cứu tƣợng nở hoa nƣớc giảm thiểu tác hại độc tố vi khuẩn lam gây độc, nhiên kết mức độ khác Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học thăm dò khả phân giải độc tố số chủng Microcystis phân lập hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội Mục tiêu đề tài * Phân lập, định tên, nuôi cấy lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam Microcystis Bảo tang Vi tảo Phịng Cơng nghệ Tảo Sinh học Môi trƣờng - Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN * Thăm dò khả phân giải độc tố chúng vi khuẩn Tóm tắt nội dung nghiên cứu đề tài - Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hố nƣớc hồ Hồn Kiếm thời điểm thu mẫu - Phân lập, khiết nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp chủng Microcystis - Phân loại đến loài chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc - Tách chiết phân loại độc tố chủng Microcystis máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) - Thăm dò khả phân giải độc tố microcystin vi khuẩn lam gây độc vi khuẩn địa (vi khuẩn nƣớc) Kết đề tài - Hồ Hồn Kiếm tình trạng ô nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD vƣợt tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần Với giá trị NH4+ từ 0,1290,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO43- từ 0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P cao - Đã phân lập khiết nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi Microcystis theo phƣơng pháp Shirai có cải tiến Mơi trƣờng thạch agarose B12 với tỷ lệ 0,4% mơi trƣờng thích hợp cho việc phân lập Microcystis - Các chủng Microcystis sinh trƣởng tốt môi trƣờng Bold 3N với số lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy Đặc biệt chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao 68,6 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 19 Trên môi trƣờng J, chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ×106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày ni cấy Trong chủng LT2 phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao 76,46 × 106 tế bào/ml sau ngày thứ 19 Trên môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tế bào/ml sau 12 đến 15 ngày nuôi cấy Ở môi trƣờng chủng LT8 phát triển với mật độ tế bào đạt cao 54,78 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 15 - Có loại axít béo khơng no dạng C15, C17 C19 tế bào chủng Microcystis LT2 LT8 thành phần axit palmitic (C16H32O2) chiếm lƣợng lớn với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô chủng LT2, chủng LT8 0,9683 μg/mg trọng lƣợng khơ Kết cho thấy có sai khác lƣợng loại axit béo có tế bào chủng LT2 LT8 - Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học phƣơng pháp phân loại đại dựa phân tích trình tự rADN 16S, chủng vi khuẩn LT 2, LT8 đƣợc xác định Microcystis aeruginosa, chủng vi khuẩn nƣớc N4 N7 đƣợc xác định thuộc loài Sphingomonas mali Sphingomonas asaccharolytica - Dựa vào kết phân tích HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô, độc tố MC – YR 236,8 ng/mg thấp độc tố MC – LR: 114,25 ng/mg - Hai chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn đƣợc có khả phân giải microcystin nhanh Ở nồng độ microcystin µg/l thời gian bán phân giải 1,34 với nồng độ 20µg/l, thời gian 3,43 - Nhiệt độ thích hợp cho phân giải microcystin chủng vi khuẩn Sphingomonas mali N4 Sphingomonas asaccharolytica N7 30°C Sau ngày phân giải gần nhƣ hoàn toàn 100% Các cơng trình cơng bố sản phẩm đào tạo  Cơng trình cơng bố - Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà 2008 Đánh giá biến động số lượng theo mùa theo tầng nước vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa hồ Hồn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 số 15, tr 125 – 128 - Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hồi Hà 2008 Tìm hiểu khả phân giải độc tố vi khuẩn lam Microcystis hồ Hồn kiếm vi khuẩn Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 số 15, tr 119 – 122  Đào tạo Cử nhân - Bƣớc đầu phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn có khả phân giải độc tố vi khuẩn lam Microcystis hồ Hồn Kiếm, Hà Nội 2007 Khố luận tốt nghiệp hệ đại học quy Đặng Thị Kim Anh - Bƣớc đầu đánh giá khả phân giải độc tố microcystin vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa vi khuẩn Sphingomonas 2008 Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học quy Nguyễn Thị Hồi - Khảo sát biến động theo mùa vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa hồ Hoàn Kiếm khả ức chế sinh trƣởng chúng dịch chiết vỏ chuối, vỏ quýt 2009 Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học quy Lê Thị Trang - Phân lập, nghiên cứu số đặc tính tảo độc Microcystis tách chiết độc tố thăm dò biện pháp xử lý.2009 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hữu Hiếu  Đào tạo Thạc sỹ Phân giải tế bào Microcystis phân huỷ độc tố microcystin vi khuẩn nƣớc 2007 - 2009 Những đóng góp đề tài: - Là cơng trình tách lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam Microcystis - Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas có khả phân giải độc tố microcystin vi khuẩn lam Microcystis - Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin Tình hình sử dụng kinh phí đề tài - Kinh phí đƣợc cấp: 100 000 000 đồng - Kinh phí thực hiện: 100 000 000 đồng Hà Nội , ngày 18 tháng 10 năm 2008 Chủ trì đề tài Thủ trƣởng đơn vị (ký tên, đóng dấu) TS Nguyễn Thị Hoài Hà ABSTRACT OF PROJECT Title of the project: “Study on biological characteristis and capacity of biodegradation toxin of some Microcystis isolated from Hoan Kiem Lake, Hanoi” Coodinator: Nguyen Thi Hoai Ha Member: Luu Thuy Giang Nguyen Quang Huy Le Trung Thuy Pham Thi Bich Dao Tran Thi Diep Introduce Hoan Kiem Lake is a famous place because of its historical and cultural value This is the habitat of valuable and rare species with endemicity and is also diversifying about the component of microalgae species In recent years, the socioeconomic developmental process caused a lot of influences on the lake ecosystem especially on water quality Mesotrophic situation of this lake resulted in the bloom water reducing specific microalgae species and concurrently increasing the species component and density of toxic algae Among toxic cyanobacterial genera, Microcystis accounts for highest population (approximately 80% of total cyanobacterial strains that cause the bloom water) Microcystis aeruginosa Krutzing is the most popular species This is a species which produces hepatotoxin, a type of liver toxin, composed from cyclic peptides called microcystin They have effect on both animals and plants in waters microcystin usually accumulates in cells or releases to surrounding waters Thus the research on toxic cyanobacteria Microcystis in Hoan Kiem lake, Hanoi and finding effective methods to diminish their negative effects are essential In this report, we describe the isolation, selection and classification location as well as biological characters of some Microcystis strains from Hoan Kiem lake, as a basic for the next researches 4.The airm of project - Isolation, identification, inoculation and maitainance of Microcystis strains (blue-green, Cyanobacteria) at Microalgal Technology and Enviromental Biology Lab, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National of University, Hanoi - Capacity of toxin degradation by aquatic bacteria Brief summary: - Biophysical and biochemical analysis of freshwater in Hoankiem lake at sampling time - Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated - Identification of Microcystis isolated - Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC - Capacity of toxin degradation by fresh bacteria Results obtained - Hoankiem lake is in pollution condition in the aspect of chemical evacuation such as COD and BOD concentration is over the corresponding ones in Vietnamese standard system, TCVN 4942-1995 (type B) 20 times Concentration of ammonium cation 0,129- 0,699 (mg/l), nitrite 0.012- 0,05 (mg/l), nitrate 0,0470,129 (mg/l), and phosphate 0,08- 0.64 (mg/l) that demonstrate concentration of nitrogen and phosphorus are relatively high - Based on modified Shirai method, 10 pure strains of Microcystis were isolated and cultured B12 medium (0.4% agarose) was selected as the most suitable for Microcystis isolation - All of Microcystis strains were grown well on the Bold 3N medium that the numbers of cell from 68,6 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture Especially, the maximal cell number of LT2 strain increased to 68,6 ×106 cells/ml after 19th culture For J medium, the cell density was from 40,42 – 76,46 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture in which LT2 was the best growth strain with the numbers of cell 76,46 ×106 cells/ml after 19th culture - Analytical results of unsaturated fatty acid in Microcystis LT2 and LT8 strains showed different types of C15, C17 and C19 in which Palmitic acid occupied as major part with 1,302 μg/mg and 0,9683 μg/mg (in dry weight) in LT2 and LT8, respectively The results indicated the diference in the concentration between types of fatty acid - Based on morphological and molecular taxonomy (for example comparision the sequence of 16S rDNA), LT2 and LT8 cyanobacterial strains were identified as M aeruginosa; aquatic N4 and N7 bacterial strains were type of Sphingomonas mali Sphingomonas asaccharolytica - HPLC analysis showed the maximal concentration of MC-RR of 512,8 ng/mg in dry weight, 236,8 ng/mg of MC-YR and the lowest 114,25 ng/mg MCLR - Sphingomonas strain was demonstrated to degrade microcystin in relatively good level Time for degradation of a half of µg/l and 20µg/l microcystin was 1,34 h and 3,43 h; respectively - The suitable temperature for microcystin degradation by Sphingomonas mali N4, Sphingomonas asaccharolytica N7 strains was at 30°C The degradation was completely after day Publications and training activity Publications - Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha Investigate water quality and the composition of algae in some lakes in Hanoi 2008 Vietnam National University, Hanoi Journal Natural Science Vol 24, No 18, pp 125 – 128 - Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha Study on toxin lysis in blue green algae by some strains bacteria isolated in Hoan Kiem lake 2008 Vietnam National University, Hanoi Journal Natural Science Vol 24, No 18, pp 119 – 122 Training activity Master thesis completed in 2009 - Lysis of Microcystis and degradation of microcystin by aquatic bacteria 2007-2009 Tran Thi Diep‟s official undergraduate thesis Bacheler thesis completed - Isolation and screening of Microcystis toxin-degrading bacterial strains in Hoankiem lake, Hanoi, 2007 Dang Thi Kim Anh‟s official undergraduate thesis - Investigation of Microcystis aeruginosa microcystin degradation by Sphingomonas 2008 Nguyen Thi Hoai ‟s official undergraduate thesis - Study on the seasonal fluctuation of cyanobacterial Microcystis aeruginosa in Hoankiem lake and growth restriction by banana skin and mandarin peel extracted solution, 2009 Le Thi Trang‟s official undergraduate thesis - Isolation and study on Microcystis toxic cyanobacterial characteristics: toxin extraction and treatment investigation, 2009 Nguyen Huu Hieu‟s official undergraduate thesis Contributions of project: Dung dịch NH4Cl tiêu chuẩn: cân 0,382 g NH4Cl tinh khiết sấy khô o 105 C giờ, pha vào bình định mức lít Dung dịch có nồng độ 0,1 mg NNH4+ ml Lấy 10 bình định mức có số thứ tự từ 1- 10 Dùng pipet hút dung dịch chuẩn cho vào bình định mức với thể tích là: ml, ml, ml, ml, ml, ml, ml, ml, ml, 10 ml sau cho thêm ml dung dịch seignet ml dung dịch nessler, thêm nƣớc cất đến vạch định mức Tiến hành so màu bƣớc sóng 420 nm máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO Căn vào giá trị mật độ quang đo đƣợc ta lập đƣờng chuẩn Cách tiến hành: Lấy ml nƣớc mẫu cần phân tích cho vào bình định mức 50 ml, pha lỗng nƣớc cất tới 25 ml Cho vào bình ml muối seignet, tiếp tục cho vào ml thuốc thử nessler, thêm nƣớc cất đến vạch định mức Làm tƣơng tự mẫu trắng so màu bƣớc sóng 420 nm Tra đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng N- NH+ mẫu Cơng thức tính kết quả: N-NH4+ = W  0,1  1000 V Trong đó: W- thể tích NH4Cl tiêu chuẩn tra đƣờng chuẩn V- thể tích mẫu nƣớc dùng phân tích (5 ml) 3.5 Xác định hàm lƣợng NO3- acid phenoldisunfonic Nguyên tắc: Ion NO3- phản ứng với acid phenoldisunfonic tạo acid nitrophenoldisunfonic Acid tác dụng với dung dịch kiềm cho muối màu vàng, cƣờng độ màu tỷ lệ với hàm lƣợng NO3- dung dịch C6H3OH(SO3H)2 + HNO3 + 3NH4OH  C6H2ONH4(SO3NH4)2NO2 + 4H2O (acid phenoldisunfonic) (màu vàng) Dụng cụ, hoá chất: - Bát sứ - Pipet loại - Bình định mức 50 ml - Dung dịch NH4OH 25% - Dung dịch NaOH 20% 72 - Acid phenoldisunfonic: cân g phenol nguyên chất kết tinh màu trắng cho vào bình tam giác, thêm 20 ml H2SO4 đặc (d=1,84) Đậy bình nút có ống thủy tinh làm lạnh khơng khí Đun sơi cách thuỷ đƣợc dung dịch màu vàng nhạt Bảo quản bình sẫm màu Phương pháp lập đường chuẩn: Cân 0,7216 g KNO3 sấy khô 105oC 2h, cho vào bình định mức lit, dung nƣớc cất lần hoà tan thêm đến vạch định mức ml dung dịch chứa 0,1 mg N-NO3- Lấy 50 ml dung dịch cho vào bát sứ cô cạn, để nguội thêm ml thuốc thử disunfonic, dùng đũa thuỷ tinh cạo nhẹ thành bát để trộn thuốc thử, để yên 10 phút để thuốc thử ngấm Sau thêm 15 ml nƣớc cất, trung hoà NaOH 20% đến pH kiềm, cho toàn dung dịch màu vàng vào bình định mức 200 ml (dung dịch A) Lấy 10 bình định mức 50 ml, cho dung dịch A vào bình định mức lần lƣợt với thể tích ml, ml, ml, ml, ml định mức đến vạch So màu bƣớc sóng 420 nm máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO, xây dựng đƣờng chuẩn Cách tiến hành: Lấy 50 ml nƣớc mẫu cần phân tích cho vào bát sứ, chƣng cạn, để nguội, cho vào ml dung dịch acid phenoldisunfonic, dùng đũa thuỷ tinh cạo thành bát để hoà tan hết cặn, để yên 10 phút để acid ngấm Cho thêm nƣớc cất, cho vào ml dung dịch NH4OH 25%, đổ tất sang bình định mức 50 ml, tráng bát sứ nƣớc cất đổ sang bình định mức Dùng nƣớc cất định mức đến vạch So màu bƣớc sóng 420 nm máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO Căn vào mật độ quang đo đƣợc đƣờng chuẩn tính hàm lƣợng NO3- mẫu cần phân tích Cơng thức tính kết quả: N-NO3- (mg/l) = W  0,025  1000 V Trong đó: W- thể tích tra đƣờng chuẩn V- thể tích mẫu dùng phân tích (50 ml) 3.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NO2Nguyên tắc: 73 Phƣơng pháp dựa vào phản ứng Diajo hóa nitrit môi trƣờng acid với acid sunphanilamide tạo thành muối aro có màu đỏ hồng Phƣơng pháp thích hợp với việc xác định NO2- có hàm lƣợng mg/l N dạng NO2- trở xuống Các yếu tố ảnh hưởng: Các ion sau gây cản trở: Fe3+, Pb2+, Hg2+, Ag+, ion có màu, chúng có mặt dung dịch làm thay đổi màu hệ Các chất rắn ảnh hƣởng đến việc xác định NO2- Dụng cụ hoá chất: - Pipet loại - Bình định mức 50 ml - Thuốc thử sunphanilamide: hồ tan 5g sunphanilamide hỗn hợp 50 ml acid HCl đặc 300 ml nƣớc cất Pha loãng đến 500 ml nƣớc cất - Dung dịch NED dihydroclorua: hoà tan 500 mg NED dihydroclorua 500 ml nƣớc, đựng chai tối màu, pha chế lại hàng tháng tức khắc thấy dung dịch chuyển sang màu nâu Các lập đường chuẩn: Dung dịch NO2- tiêu chuẩn: cân 0,4927 g NaNO2 khan vào bình định mức lít, thêm nƣớc cất đến vạch, dung dịch chứa 0,1 mg N-NO2- ml Lấy 10 ml dung dịch cho vào bình định mức lít, thêm nƣớc cất đến vạch, dung dịch dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ 0,001 mg N-NO2- ml Cho vào bình định mức 50 ml có thứ tự từ 1- 10 dung dịch chuẩn với thể tích ml, 2ml, 3ml, 4ml, ml, ml, ml, ml, ml, 10 ml Sau thêm nƣớc cất đến vạch, so màu bƣớc sóng 530 nm máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO Căn vào giá trị mật độ quang lập đƣờng chuẩn Cách tiến hành: - Lấy ml nƣớc mẫu cần phân tích cho vào bình định mức 50 ml, nƣớc thải pha lỗng thành 25 ml - Dùng pipet cho vào bình 1ml dung dịch sunphanilamide, lắc phút, cho thêm 1ml dung dịch NED dihydroclorua, lắc 10 phút - Làm tƣơng tự với mẫu trắng Tiến hành so màu máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO bƣớc sóng 530 nm Cơng thức tính kết quả: 74 Hàm lƣợng N-NO2- đƣợc tính theo cơng thức: N-NO2- (mg/l) = W  0,001  1000 V Trong đó: W- thể tích dung dịch N-NO2- tra đƣờng chuẩn V- thể tích mẫu nƣớc lấy phân tích (5 ml) 3.7 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng photphat PO43Nguyên tắc: Khi đun nóng dung dịch PO43- với molipdat amon có mặt H2SO4 đặc tạo thành acid photpho molipdat, acid tác dụng với acid ascorbic môi trƣờng pH= cho hợp chất photpho molipdat màu xanh lam Căn vào cƣờng độ màu đo đƣợc đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng PO43- dung dịch cần phân tích Hố chất dụng cụ: - Pipet loại - Bình định mức 50 ml - Dung dịch (NH4)6Mo7O24.4H2O 2,5%: cân 25 g molipdat amon, hồ tan bình định mức 1000 ml Thận trọng cho thêm 175ml dung dịch H2SO4 đặc, để nguội dung dịch thêm nƣớc cất đến vạch định mức - Dung dịch acid ascorbic 1%: 1g acid ascorbic hoà tan 100ml dung dịch CuSO4 0,05M (dung dịch chuẩn bị trƣớc dùng) Cách lập đường chuẩn: - Dung dịch chuẩn photphat: cân 0,22131 g KH2PO4 sấy khô nhiệt độ 105oC 2h, hồ tan đến lít nƣớc cất lần ta đƣợc dung dịch chuẩn có hàm lƣợng 0,05 mg P-PO43- ml - Cho vào bình định mức 50 ml lần lƣợt thể tích dung dịch chuẩn photphat nhƣ sau: 0,1 ml; 0,3 ml; 0,5 ml; 0,7 ml; 0,9 ml; 1,1 ml Thêm ml dung dịch molipdat amon; 0,5 ml dung dịch acid ascorbic, thêm nƣớc cất đến vạch định mức Đun cách thuỷ nhiệt độ 30oC 10 phút So màu máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO bƣớc sóng 660 nm Từ kết đo mật độ quang lập đƣờng chuẩn Cách tiến hành phân tích: Lấy 10 ml nƣớc mẫu cho vào bình định mức 50 ml, dùng pipet cho ml dung dịch thuốc thử molipdat amon 0,5 ml dung dịch acid ascorbic, thêm nƣớc cất đến 75 vạch định mức Đun cách thuỷ nhiệt độ 30oC 10 phút So màu bƣớc sóng 660 nm máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO Căn vào giá trị mật độ quang đo đƣợc đƣờng chuẩn ta xác định đƣợc hàm lƣợng PO43- mẫu Cơng thức tính kết quả: P- PO43- = W  0,05  1000 V Trong đó: W- thể tích tƣơng ứng với mật độ quang đo đƣợc V- thể tích mẫu dùng để phân tích (10 ml) 3.8 Xác định hàm lƣợng cặn lơ lửng SS Nguyên tắc: Nƣớc mẫu đƣợc lắc đem lọc qua giấy lọc đƣợc biết trƣớc khối lƣợng Cặn lại giấy lọc đƣợc sấy đến trọng lƣợng không đổi nhiệt độ 1050C Khối lƣợng chênh lệch trƣớc sau sấy cặn lơ lửng SS hay gọi chất rắn huyền phù Các bước tiến hành: Giấy lọc đƣợc sấy khô tới trọng lƣợng không đổi 1050C giờ, để nguội bình hút ẩm sau cân xác trọng lƣợng giấy lọc Lấy 100 ml nƣớc mẫu lọc qua giấy lọc Đem sấy giấy lọc lớp cặn bên trên, để nguội bình hút ẩm cân xác trọng lƣợng giấy sau lọc Cơng thức tính kết quả: SS  mg / l  = Trong đó:  A - B 1000 V A trọng lƣợng giấy lọc lớp cặn sau sấy (mg) B trọng lƣợng giấy lọc ban đầu (mg) V thể tích mẫu nƣớc lọc qua giấy lọc (ml) 76 PHỤ LỤC 4.1 Phƣơng pháp nhuộn Gram Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trị đặc biệt việc phân loại vi khuẩn Trong trình nhuộm Gram, tế bào bƣớc đầu đƣợc xử lý với tím kết tinh iot nên có tạo thành phức chất tím kết tinh – iot bên tế bào Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit lớp màng bị hồ tan làm tăng tính thấm màng dẫn đến rửa trơi phức chất tím – iot làm cho vi khuẩn màu Khi nhuộm bổ sung chúng bắt màu với thuốc (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin) vi khuẩn Gram dƣơng, cồn làm cho lỗ peptidoglycan co lại phức chất tim – iot bị giữ lại bên tế bào Cách tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn đặt lên phiến kính Cố định tiêu lửa nhuộn thuốc đầu dung dịch tím kết tinh (crystal violet) khoảng phút Rửa nƣớc Nhuộm tiếp dung dịch iốt (dung dịch Lugol) phút Rửa nƣớc Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95%:axeton (1:1) khoảng phút Lại rửa nƣớc Sau nhuộm tiếp thuốc nhuộm màu đỏ (nhƣ Safranin hay Fuchsin Ziehl) Rửa qua nƣớc, để khơ, soi kính 4.2 Oxidaza Thử kit (strip), chủng dƣơng tính cho màu tím, chủng âm tính khơng màu 4.3 Xác định khả di động (Motility test) Phần lớn vi khuẩn Bacillus sphingomonas có khả di động, số lồi khơng có khả Ngun tắc: Tiên mao (lơng roi) sợi lông dài, uốn khúc, mọc mặt ngồi số vi khuẩn có tác dụng giúp chúng chuyển động Khả đƣợc quan sát dựa vào sinh trƣởng di dộng vi khuẩn vào bên môi trƣờng thạch mềm Môi trƣờng: Sử dụng môi trƣờng MRS bán lỏng (0,15 - 0,4% thạch) Mỗi ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng Khử trùng 121oC/15 phút Làm nguội trạng thái thẳng đứng 77 Cách tiến hành: Đâm sâu đầu que cấy thẳng có chứa tế bào vi khuẩn lactic xuyên vào môi trƣờng ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2ml Chú ý đƣa que cấy vào ống nghiệm Ni cấy nhiệt độ 30 - 370C 48 - 56 Quan sát vị trí sinh trƣởng vi khuẩn ống nghiệm Nếu tế bào mọc thẳng theo vạch que cấy khơng có khả di động, ngƣợc lại tế bào mọc loang xung quanh vạch que cấy có khả di động 4.4 Xác định khả phân giải tinh bột Cấy chấm cấy vạch vi khuẩn mơi trƣờng thạch thƣờng có bổ sung 1% tinh bột tan, để 370C ngày Đổ thuốc nhuộm Lugol Chủng có hoạt tính tạo vịng xung quanh dƣới chân khuẩn lạc 4.5 Phát vi khuẩn Sphingomonas Ngoài khả phát vi khuẩn Sphingomonas dựa vào khả di động nhanh chúng soi dƣới kính hiển vi cịn phân biệt đƣợc chúng cấy môi trƣờng King‟s B: Proteose peptone - 20g; Glycerol - 10ml; K2HPO4 1,5g; MgSO4 -1,5g; thạch - 18g; nƣớc - 1000ml Trên môi trƣờng này, đa số chủng vi khuẩn Sphingomonas phát quang dƣới đèn cực tím (tuy nhiên có số chủng khơng phát quang) 78 79 PHỤ LỤC Kết phân tích thủy lý, thủy hóa Đợt thu mẫu lần (6/3/2007) TT Đợt thu mẫu lần (8/ 5/2007) Chỉ tiêu D1 D2 D3 D4 D5 D6 D1 D2 D3 D4 D5 D6 Xanh lôc Xanh lơc Xanh ®en Xanh ®en Xanh lam Xanh lam Xanh lơc Xanh lơc Xanh ®en Xanh ®en Xanh lam Xanh lam Tanh Tanh Tanh Tanh TCVN 5942-1995 A B Mµu n-íc Mïi n-íc T0 n-íc 16.6 16.6 16.7 16.9 16.7 16.7 29.8 30.8 31.8 31.3 29.4 29.3 §é 29 28 12 14 19 21 27 25 13 17 22 25 pH 9.80 9.82 9.77 9.79 9.57 9.48 10.52 10.50 10.48 10.47 9.95 SS 250 320 480 440 380 390 230 290 510 420 360 380 20 80 BOD5 120 65 520 310 460 440 220 150 270 260 180 90